专利名称：2,3-吲哚二酮-3-肟的制备和在癌症防治方面的用途的制作方法
技术领域：
本发明公布了一种2，3-吲哚二酮-3-肟、或称靛红-3-肟的制备方法，以及按该方法获得的2，3-吲哚二酮-3-肟在制备癌症预防或治疗药物方面的用途。
背景技术：
基因组不稳定性是恶性肿瘤细胞最具本质性的特征[1]，表现在高基因突变率和染色体组异常两大方面。一个肿瘤细胞基因组中的突变总数高达1万至10万次。肿瘤细胞群体固有的高变异率有助于恶性度更高的新变异出现，后者经克隆选择又可以遗传给更多的子代细胞克隆，使其基因组更趋异常，形成不断演进的恶性循环。因此，基因组不稳定性既是癌症发生的前提，也是恶性肿瘤复发和转移的驱动力。导致基因组不稳定性的根本原因是细胞周期和有丝分裂调控途径中的某些核心分子的基因突变或表观遗传学变异。这些核心分子的失控不仅引发癌细胞的增殖失控和永生化，而且同时导致基因组不稳定性，包括多倍体核型和染色体畸变，使得肿瘤细胞与正常细胞之间出现不可逆转的本质差异[1-2]。
目前大量的分子生物学实验、临床检验数据和流行病学证据表明，细胞周期蛋白cyclin E和细胞周期抑制因子p21基因表达水平的正常调控，对于维护基因组稳定性和防止癌症发生具有关键作用，二者正是上述导致癌症发生和发展的核心分子。例如，在多种癌细胞中检测到cyclin E的过度表达，因而cyclin E属于癌基因；相反，多种癌细胞中p21明显下调，因而表现为抑癌基因。Cyclin E和p21的上述变化使得细胞周期检验点失效，细胞不能滞留在G1期或静止期，而是不断进行DNA复制和有丝分裂，并形成多倍体和非整倍体核型[3-4]。其他两种周期蛋白即cyclin B和cyclin A的过度表达也与癌细胞的增殖失控密切相关[5]。
所以，如果找到一种化合物，能够同时下调细胞内cyclin E、cyclin B和cyclinA的表达，却又能提高p21的表达水平，就能够防止癌前病变细胞的过度增殖和基因组稳定性的进一步破坏，并诱导癌前病变细胞或癌细胞进入G1期阻断状态；处于G1期阻断状态下的癌前病变细胞或癌细胞将启动细胞分化程序，从而失去原有的异常或恶性表型。这样的化合物将具有G1期阻断和分化诱导作用，从而产生显著的防癌和抗癌效果。本发明公布的内容首次表明，2，3-吲哚二酮-3-肟(2，3-indoledione-3-oxime)具有上述特征，可用于制备防止癌症发生的预防性药物、或针对已诊断癌症的治疗性药物或辅助治疗性药物。
本发明所涉及的物质2，3-吲哚二酮-3-肟(2，3-indoledione-3-oxime)又称靛红-3-肟(isatin-3-oxime)或β-靛红肟(isatin-β-oxime)。本发明的合成原料之一是2，3-吲哚二酮(2，3-indoledione)，该物质又称吲哚-2，3-二酮(indole-2，3-dione or 2，3-dioxoindole)、吲哚醌或靛红(isatin)，是一种重要的人体内源性生物活性物质，具有神经-内分泌活性，因而具有良好的人体兼容性。以靛红作为2，3-吲哚二酮-3-肟的合成原料具有成本低廉、无毒性、无污染的优点。将靛红与羟胺反应合成2，3-吲哚二酮-3-肟或靛红-3-肟的方法已有文献报道[6]。然而，靛红的羰基具有反芳香性，非常活泼，事实上靛红的2-位和3-位羰基均可能成肟，并可形成数种异构体；而且在反应体系过酸或过碱、反应温度过高的条件下，会出现多种副反应，使得产品的质量不稳定、产率低、后续纯化步骤繁琐、能耗和成本过大。例如，文献报道的方法通常是将盐酸羟胺、碳酸钠和靛红溶解在含乙醇和水的反应体系中加热回流，然而当pH值为7.6时，可导致副产品靛红-2-肟的生成[6]。又如，另有一篇近期文献报道了在离子液体作用下由Isonitrosoacetanilide环化生成靛红-3-肟的方法，但离子液体成本很高，且反应需要135℃的高温[7]。本发明公布的一种2，3-吲哚二酮-3-肟合成和纯化方法解决了上述问题。
参考文献 [1]Klausner R.D.，The fabric of cancer cell biology-weaving together the strands.Cancer Cell.2002，1，3-10 [2]Olaharski A.J.Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervicalcarcinogenesis.Carcinogenesis.2006，27，337-343 [3]Minella A.C.p53 and SCFFbw7cooperatively restrain cyclin E-associated genome instability.Oncogene.2007，26，6948-6953 [4]Benjamin D.Rowland and Daniel S.Peeper.KLF4，p21 and context-dependent opposing forcesin cancer.Nature Reviews Cancer.2006，6，11-23 [5]Whitfield M.L.et al.Common markers of proliferation.Nature Reviews Cancer.2006.6，99-106 [6]Abele E.et al.Indole and isatin oximessynthesis，reactions，and biological activity.Chemistryof Heterocyclic Compounds.2003，39(1)，3-35 [7]Pinto A.C.et al.Pronounced ionic liquid effect in the synthesis of biologically activeisatin-3-oxime derivatives under acid catalysis.Tetrahedron Letters.2008，49，5639-5641
发明内容
本发明公布了一种具有简便、经济、环保特点的2，3-吲哚二酮-3-肟制备方法，用本方法制备的2，3-吲哚二酮-3-肟满足以下结构
本发明中关于2，3-吲哚二酮-3-肟制备方法的主要技术特征是使用一种无水有机溶剂，该溶剂的特征是能够保证2，3-吲哚二酮(即靛红)在该溶剂中的室温溶解量≥0.5mol/L；用该溶剂溶解盐酸羟胺和靛红，并加入一种无机或有机碱；在所选无水有机溶剂中，盐酸羟胺、靛红、碱的溶解或加入可按任何顺序进行；通过调节所加碱的摩尔比，保证反应体系的pH值为中性或弱酸性；在机械搅拌中于温度范围为0℃至50℃的任何一种温度下反应生成2，3-吲哚二酮-3-肟；反应达终点后，向反应体系中加入2至5倍体积的水，致使鲜黄色的2，3-吲哚二酮-3-肟沉淀析出；再通过反复水洗、或反复水洗后有机溶剂内的重结晶，获得2，3-吲哚二酮-3-肟纯品。上述技术特征有三项要素 第一个要素是选取一种无水有机溶剂，并保证靛红和盐酸羟胺在该溶剂中有足够大的溶解量。以往的制备方法通常使用甲醇、乙醇、乙腈，或前述三种溶剂与水的混合物进行反应。经测试，靛红在甲醇、乙醇、乙腈中的溶解量在室温时分别小于或等于0.25mol/L、0.15mol/L、0.0625mol/L；当这三种溶剂中含水时，靛红的溶解量大大降低。但是以往的制备方法为了保证盐酸羟胺或硫酸羟胺也能溶解在上述三种溶剂中，不得不加入水，并且通常需要加热回流，以便加快反应速度。经我们验证，在上述旧有条件下反应，靛红会部分分解，影响产物的纯度和产率，并且由于产物在反应体系中的浓度低，不能通过直接结晶或加水沉淀等简便方法回收产物，而是需要先经过减压蒸发等浓缩步骤才能提高产率。这就不可避免地导致能耗和成本的增高，并且不利于环保。本发明通过选择合适的溶剂，解决了上述问题。为了同时保证靛红和盐酸羟胺在该溶剂中均有足够大的溶解量，本发明选择了以下溶剂二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、N-甲基吡硌烷酮、吡啶、二甲基亚砜(DMSO)；2，3-吲哚二酮或靛红在上述溶剂中的溶解量依次为2.5mol/L、0.5mol/L、2mol/L、1mol/L、2mol/L。盐酸羟胺在上述溶液中的溶解量均超过靛红。在上述溶剂中，以DMF中的溶解量最大，且DMF在上述溶剂中是最为经济环保的一种溶剂，因此本发明优选DMF，并且优选在DMF中接近饱和的靛红浓度，如2至2.5mol/L。
上述制备方法技术特征中的第二个要素是通过选择一种无机或有机碱，保证反应体系的pH值处于合适的范围。以往的2，3-吲哚二酮-3-肟合成方法常常在碱性或酸性条件下反应，这将导致副反应的增多和反应不彻底、并形成多种肟类异构体或物种，为后续的纯化带来困难。本发明将整个反应体系的最终pH值控制在弱酸性到中性之间，即pH值在4至7.5之间，其中优选pH值范围为5至6.5，这样可以在大大加快反应进程的同时，减少副反应的发生。检测pH值的方法是取1份体积的反应体系混合液，加10份体积的水混匀，用pH试纸或pH计检测。本发明所用的碱可以是以下任何一种氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氧化钙、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、四硼酸锂、四硼酸钠、四硼酸钾、三乙胺、吡啶、羟胺。在这些碱中，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氧化钙、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、四硼酸锂、四硼酸钠、四硼酸钾在反应体系中的溶解度很低，需要事先研磨成细粉，且在室温反应时需要长时间(12小时)剧烈机械搅拌，才能保证反应终点的实现。三乙胺和吡啶不利于环保、且后续纯化时的产率不高。本发明优选氢氧化锂，因其在反应体系中溶解量大，可提高反应速度。氢氧化锂可以是一水合氢氧化锂，也可以是无水氢氧化锂。氢氧化锂分子量小，按重量计算用量少，比某些其他碱成本更经济。
上述制备方法技术特征中的第三个要素是在节省盐酸羟胺用量的条件下，保证反应依然能快速达到终点。本发明所述反应终点特指靛红在反应中全部消耗完毕。某些旧有方法为保证靛红完全转化、从而有利于后续纯化步骤，常常加入摩尔比大大过量的羟胺，但羟胺有一定毒性，不利于环保。本发明通过提高反应物的浓度、选用非质子溶剂、优化反应体系的酸碱度等措施，降低了盐酸羟胺的用量，即选择盐酸羟胺与靛红的摩尔比为1至1.5∶1，其中优选1.2∶1。本发明所述反应终点除了使用常规TLC技术检测以外，还可按本发明公布的简便鉴定方法进行取1份体积的2mol/L氢氧化锂水溶液与9份体积的DMF混合，作为检测液；取1份体积的反应体系混合液，用上述检测液稀释50倍，观察溶液的颜色；如果呈紫色，表示有残存靛红；如果呈浅黄色，表示靛红全部消耗，即已达反应终点。按本发明所述优化的条件进行反应，室温30min即可确保达到反应终点。
本发明公布的能够满足上述技术特征中三项要素的优选方案是反应体系中盐酸羟胺、靛红、一水合氢氧化锂的摩尔比按1.2∶1∶1设定；以DMF为溶剂，使上述三种成分的摩尔浓度分别为2.4mol/L、2mol/L和2mol/L。
当反应达终点后，本发明的后续纯化过程均按常规操作进行。具体地说，向反应体系中加入2至5倍体积的水，以低温预冷的水为佳，以便促进2，3-吲哚二酮-3-肟结晶析出和提高产率；用滤膜或滤纸抽滤、或用离心沉降法收集沉淀物即2，3-吲哚二酮-3-肟；再反复水洗2至4次、或进行连续淋洗，干燥后可获纯度95％以上的产物。进一步纯化采用重结晶法，即将上述初步纯化产物溶解于预热的挥发性有机溶剂如甲醇、乙醇或异丙醇内，待溶剂冷却后析出晶体，可获纯度99％以上的产物。
本发明进一步公布了2，3-吲哚二酮-3-肟在制备癌症预防或治疗药物方面的用途。如在前文的“背景技术”部分所述，基因组不稳定性既是癌症发生的前提，也是恶性肿瘤复发和转移的驱动力。而导致基因组不稳定性的核心分子机制涉及癌基因产物cyclin E、cyclin B和cyclinA的过度表达，以及抑癌基因p21的表达下调；上述癌基因与抑癌基因的表达失控同时还造成癌细胞的过度增殖和细胞周期的不断运行。本发明首次证明了2，3-吲哚二酮-3-肟对癌细胞、恶性神经胶质瘤细胞、具有癌前病变细胞特征的转化细胞即人胎肝L02细胞均有显著的增殖抑制作用，能够将这些细胞阻断在G1期，并诱导细胞分化。本发明还首次阐明了2，3-吲哚二酮-3-肟发挥上述作用的分子机制，即2，3-吲哚二酮-3-肟能够显著下调癌基因产物cyclin E、cyclin B和cyclin A的表达，并能大幅度提高抑癌基因p21的表达水平。2，3-吲哚二酮-3-肟对上述关键癌症相关靶分子的特异性作用，提供了将2，3-吲哚二酮-3-肟用作防癌和抗癌药物的科学依据。
目前临床上许多常用抗癌药的作用机制是诱导DNA双链断裂，进而由DNA双链断裂激活细胞周期检验点，诱发癌细胞凋亡。这类已知抗癌药的作用特点使其不可避免地产生两大弊端第一、这类抗癌药具有基因毒性，对患者身体造成的损害极大，并常常诱发新的基因突变，引起癌细胞耐药，甚至诱发二次肿瘤发生。第二、癌细胞的细胞周期检验点经常失灵，其失灵的原因恰恰与癌基因产物cyclin E、cyclin B和cyclin A的过度表达和抑癌基因p21的表达阻遏密切相关，故此癌细胞易于对这类抗癌药产生耐药性。本发明一方面证明了2，3-吲哚二酮-3-肟不具有上述已知抗癌药的第一项弊端用DNA双链断裂的特异性探针、即γH2AX抗体检测表明，2，3-吲哚二酮-3-肟并不导致DNA双链断裂，即不具有基因毒性；相反，临床常用基因毒类抗癌药表柔比星则引起γH2AX表达量明显增加，即产生了DNA双链断裂。本发明在小鼠毒性实验中也证实，2，3-吲哚二酮-3-肟的体内毒性极低。本发明另一方面证明了2，3-吲哚二酮-3-肟能够对抗已知抗癌药的上述第二项弊端选取有代表性的临床常用基因毒类抗癌药表柔比星进行单独或联合给药实验，证实2，3-吲哚二酮-3-肟能够增加癌细胞对表柔比星的敏感性，表明2，3-吲哚二酮-3-肟具有和传统化疗药联合用药以便增加疗效的价值。
图1，2，3-吲哚二酮-3-肟对人鼻咽癌CNE细胞具有显著的G1期阻断作用。A.DMSO处理细胞24h的对照；B.4.2μg/ml的2，3-吲哚二酮-3-肟处理细胞24h。图中显示流式细胞分析仪测得的细胞周期各个时相的分布。
图2，2，3-吲哚二酮-3-肟对人鼻咽癌CNE细胞中周期蛋白和周期抑制因子表达的影响。各实验组在药物作用24h后，收集细胞，进行Western blotting。图中每条区带均分为三个泳道左侧为DMSO溶剂对照(Ctr)，中间为4μg/ml的2，3-吲哚二酮-3-肟(IO)，右侧为4μg/ml靛红(IS)。与对照(Ctr)和靛红给药组(IS)相比，2，3-吲哚二酮-3-肟(IO)在显著下调癌基因产物cyclin E、cyclin B和cyclinA表达的同时，对抑癌基因产物p21有明显上调作用。
图3，2，3-吲哚二酮-3-肟对人鼻咽癌CNE细胞的分化诱导作用。癌细胞经4μg/ml的2，3-吲哚二酮-3-肟作用24h后，经鬼笔环肽-TRITIC标记微丝和Hoechst33258染色显示细胞核之后，用激光共聚焦显微镜检测。左侧为DMSO对照，右侧为2，3-吲哚二酮-3-肟给药后的结果。
图4，按本发明所述方法制备的2，3-吲哚二酮-3-肟的500MHz1H NMR表征图谱。
具体实施例方式 实施例1按本发明的优化条件制备2，3-吲哚二酮-3-肟。
反应体系中盐酸羟胺、靛红、一水合氢氧化锂的摩尔比按1.2∶1∶1设定。称取盐酸羟胺8.33g，溶于50ml DMF中，配成浓度为2.4mol/L的溶液，并置于一个有磁力搅拌装置的容器中；向容器中加入一水合氢氧化锂4.2g，并进行磁力搅拌；加入靛红14.7g，在室温下和磁力搅拌中进行反应。在数分钟内，溶液由初始反应时的橙红色转变为浅橙黄色。在反应进行了30分钟之后，溶液颜色不再变浅，按本发明所述方法检测反应终点，证实全部靛红均已经消耗完毕。在搅拌中加入150ml于4℃预冷的蒸馏水，溶液内出现大量鲜黄色沉淀；于4℃静置30分钟。弃去上部溶液，将沉淀物转移到一个有滤纸的抽滤装置中，抽滤除去残留液体；用200ml预冷的蒸馏水淋洗沉淀物；最后用95％乙醇淋洗沉淀物，并抽滤去除残余液体；于室温下避光处晾干。所得2，3-吲哚二酮-3-肟产率为92.2％。2，3-吲哚二酮-3-肟的重结晶纯化如下取上述产物3g，加入甲醇100ml，加热至产物溶解；溶液于室温冷却后于4℃静置过夜。收集析出的结晶；溶液经减压旋转蒸发仪浓缩1倍后，继续于4℃静置，收集结晶。合并所得2，3-吲哚二酮-3-肟纯品，产率为70.4％，纯度经HPLC检测大于99％。上述溶液中残余2，3-吲哚二酮-3-肟可通过进一步的浓缩和结晶回收。
按上述方法所获2，3-吲哚二酮-3-肟的表征以DMSO d6为溶剂，对2，3-吲哚二酮-3-肟进行1H谱500MHz的核磁共振分析，所得图谱见图4。
实施例22，3-吲哚二酮-3-肟对癌细胞、恶性肿瘤细胞和转化细胞的生长抑制作用和化疗增敏作用。
将2，3-吲哚二酮-3-肟溶解于DMSO中，配成100mg/ml浓度的溶液，于-20℃冰箱冻存待用。以含10％新生牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基培养细胞，即在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养多种癌细胞、恶性神经胶质瘤细胞和人胎肝L02转化细胞，常规消化传代。取对数生长期细胞，消化后制成细胞悬液，按每孔5×103细胞的密度接种于96孔板。培养24h，实验组加入上述先用二甲基亚砜(DMSO)溶解、再经RPMI-1640培养液稀释至终浓度为1至20μg/ml的2，3-吲哚二酮-3-肟；空白对照组加入RPMI-1640培养液；溶剂对照组加入0.1％DMSO；实验中每个浓度设5个平行孔。各组继续培养48h后用酸性磷酸酶法(acid phosphatase assay，APA)检测给药后细胞相对于对照组细胞的存活率(参见文献马朋，曹同涛，顾国峰，赵翔，杜宇国，张页合成紫花茄皂甙诱导人肝癌细胞株Bel-7402凋亡的作用机制，癌症，2006，25(4)438-442)。所得结果经Prism 4软件绘图并求出半数存活浓度。
结果如下2，3-吲哚二酮-3-肟对人小细胞肺癌NCI-H446细胞、人鼻咽癌CNE细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、大鼠C6神经胶质瘤细胞、人肝细胞癌BEL-7402细胞、和人胎肝L02细胞的半数生长抑制浓度分别为1.1μg/ml、2.1μg/ml、2.3μg/ml、5.0μg/ml、6.4μg/ml和7.8μg/ml。以上结果表明2，3-吲哚二酮-3-肟对癌细胞、恶性神经胶质瘤细胞和转化细胞的增殖均有显著抑制作用。
将不同浓度的2，3-吲哚二酮-3-肟与不同浓度的临床常用抗癌药表柔比星分别或联合给药，按上述方法检测大鼠C6神经胶质瘤细胞的存活率。结果表明，当表柔比星的给药浓度在0.0625μg/ml至1μg/ml之间时，同时给予5μg/ml或10μg/ml的2，3-吲哚二酮-3-肟均可明显增强各个不同浓度下的表柔比星对大鼠C6神经胶质瘤的杀伤作用，例如，在1μg/ml表柔比星作用下，仍有11％的C6神经胶质瘤存活；而当1μg/ml表柔比星与5μg/ml 2，3-吲哚二酮-3-肟联合给药时，仅有2％的细胞存活。表明2，3-吲哚二酮-3-肟有化疗增敏作用。
实施例32，3-吲哚二酮-3-肟对癌细胞的细胞周期G1期阻断和增殖抑制作用。
以浓度为4.2μg/ml的2，3-吲哚二酮-3-肟DMSO溶液处理人鼻咽癌CNE细胞，作用24h后收集细胞并制备细胞悬液，用PBS清洗2次，用200目不锈钢网过滤细胞，获得单细胞悬液。用-20℃预冷的70％乙醇固定细胞。4℃固定30分钟以上后，将细胞离心，弃乙醇，PBS离心清洗两次。调整细胞浓度为1×106/ml，加入RNase(终浓度为20μg/ml)，室温放置30分钟。离心，弃上清，将细胞用PBS重新悬浮。样品中加入20μg/ml碘化丙锭(Propidium iodide，PI)后，用流式细胞仪检测细胞周期各时相的比率，并进行统计学处理。
结果如图1所示，与DMSO对照(图1A)相比，2，3-吲哚二酮-3-肟能够特异性地将癌细胞阻断于G1期(图1B)。对细胞周期各时相的统计分析见表1。表1中可见与DMSO溶剂对照组相比，2，3-吲哚二酮-3-肟作用于人鼻咽癌CNE细胞24小时后，G1期所占比率显著增高(P＜0.01)，S期即DNA复制期比率极显著降低(P≤0.001)，表明2，3-吲哚二酮-3-肟能够显著抑制癌细胞进入DNA复制阶段，即抑制癌细胞增殖。
表12，3-吲哚二酮-3-肟作用24h对CNE细胞周期的影响。各组数据均为三 次独立实验的平均值±标准误。与对照组相比*P＜0.01，**P≤0.001。
实施例42，3-吲哚二酮-3-肟对癌基因产物cyclin E、cyclin B、cyclin A的表达量有显著抑制作用，而对抑癌基因表达产物p21表达量有显著促进作用。
用4μg/ml浓度的2，3-吲哚二酮-3-肟处理癌细胞24h。对照组包括等体积DMSO溶剂对照和4μg/ml浓度的合成前体靛红对照。收集各组细胞，3000r/min离心15min。沉淀用预冷PBS洗涤2次后，加入2倍体积细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1％NP 40，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin)，冰上裂解30～60min。于4℃、12000rpm离心10min。取上清。用Bradford法进行蛋白质定量。取含等量蛋白质的样品进行12％凝胶浓度的SDS-PAGE电泳，然后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，以含5％脱脂奶粉的TBST(含Tween 20的TBS)缓冲液于室温封闭2h。分别用抗cyclin E、cyclin B、cyclin A和p21的单克隆抗体和抗Actin多克隆抗体杂交，以及HRP标记的二抗杂交后，应用SuperSignal West Pico Chemi-luminescent Substrate试剂盒(Pierce公司产品)进行化学发光检测。
结果如图2所示，与DMSO溶剂对照泳道(Ctr)和靛红给药泳道(IS)相比，2，3-吲哚二酮-3-肟(图中IO泳道)作用于人鼻咽癌CNE细胞后，能够显著下调癌基因产物cyclin E、cyclin B和cyclinA表达，同时又对癌基因产物p21的表达有明显上调作用。对人小细胞肺癌NCI-H446细胞、人鼻咽癌CNE细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、大鼠C6神经胶质瘤进行的实验均显示出同样的结果，即显著下调cyclin E、cyclin B和cyclin A表达，同时又明显上调p21的表达。该实施例通过2，3-吲哚二酮-3-肟与其合成前体2，3-吲哚二酮即靛红的对比实验，证实2，3-吲哚二酮-3-肟对癌基因和抑癌基因的上述作用是高度特异的，而2，3-吲哚二酮或靛红则不具备上述作用。
实施例52，3-吲哚二酮-3-肟对癌细胞和癌前转化细胞的分化诱导作用。
以人鼻咽癌CNE细胞和人胎肝L02细胞为实验对象。人胎肝L02细胞是一种永生化的转化细胞，具有非整倍体核型等基因组不稳定性特征，不同于正常细胞；但接种到裸鼠体内不能成瘤，因而可作为癌前病变细胞的代表。用4μg/ml浓度的2，3-吲哚二酮-3-肟处理人鼻咽癌CNE细胞24h后，癌细胞的形态有明显改变，由原先的多边形变成不对称的梭形，铺展面积明显减少，并出现大量丝状突起即微棘。癌细胞的形态变长和趋于不对称是细胞极性和细胞分化状态趋于正常的表现。进一步用鬼笔环肽-TRITIC标记微丝和Hoechst33258染色显示细胞核之后，再经激光共聚焦显微镜观测和记录。结果显示，除了上述形态变化以外，与对照细胞(图3左侧)相比，经2，3-吲哚二酮-3-肟处理后，细胞内的微丝大量富集于质膜下即细胞皮质处，并突起形成毛刺状(图3右侧)。微丝的这种变化与细胞分化和增殖抑制有关。对人胎肝L02细胞进行的上述检测显示出同样的结果。进一步按实施例4所述方法检测了鼻咽癌CNE细胞和人胎肝L02细胞内β-catenin和galectin-3蛋白的表达水平，结果表明2，3-吲哚二酮-3-肟显著下调两种细胞内β-catenin和galectin-3蛋白的表达。β-catenin和galectin-3的表达增加与癌细胞和癌前病变细胞的过度增殖和分化受阻密切相关，也与癌细胞的侵袭转移能力呈正相关，因而是两个重要的癌基因产物(参见张页、张丽君“第十八章、细胞表面、细胞连接和细胞极性”；张页“第二十一章、细胞社会性”，《医学细胞生物学》周柔丽主编，普通高等教育“十五”国家级规划教材，北京大学医学出版社，2006年，第2版。)。因此，2，3-吲哚二酮-3-肟能够通过下调癌基因β-catenin和galectin-3的表达，诱导癌细胞和癌前病变细胞的分化。
实施例62，3-吲哚二酮-3-肟不具有基因毒性 按上述实施例4所述方法给药和进行Western blotting，但不同之处是用DNA双链断裂的特异性探针、即γH2AX单克隆抗体作为一抗进行免疫杂交。结果表明，溶剂对照组和2，3-吲哚二酮-3-肟给药组均无γH2AX区带，即无DNA双链断裂；然而表柔比星阳性对照组则出现明显的γH2AX区带，表明表柔比星导致DNA断裂，具有基因毒性。
实施例72，3-吲哚二酮-3-肟的体内毒性低，可安全使用。
将2，3-吲哚二酮-3-肟溶解在DMSO中，配成2mol/L浓度，并分别以DMSO和同等浓度靛红的DMSO溶液为对照，对昆明小鼠共36只进行腹腔注射。实验包括一次给予最大剂量0.31ml的注射，和每天一次0.125ml、连续7天的腹腔注射。当对各组动物一次注射0.31ml被测样品后，各组小鼠均在当天死亡；由于DMSO组同样死亡，表明该实验反映的是溶剂的毒性。当各组按每天一次0.125ml、连续7天进行腹腔注射时，各组均无一例动物死亡。经计算2，3-吲哚二酮-3-肟对小鼠的腹腔注射致死剂量大于0.9g/kg体重。靛红是一种无毒的人体内源性生理物质，本实施例表明2，3-吲哚二酮-3-肟与靛红对照无显著性区别，可见2，3-吲哚二酮-3-肟同样具有体内毒性低的优点。
权利要求
1.2，3-吲哚二酮-3-肟(或称靛红-3-肟)在制备预防或治疗癌症等恶性肿瘤的药物中的应用，其特征是利用2，3-吲哚二酮-3-肟对细胞增殖周期特异性的G1期阻断作用和阻止肿瘤细胞DNA复制的作用，或对周期蛋白cyclin E、cyclin B和cyclin A的表达下调作用、或对细胞周期抑制因子p21的表达上调作用，或对细胞的分化诱导作用，阻止非典型增生等癌前病变发展为癌症，或者抑制癌细胞或恶性肿瘤细胞的增殖，或者辅助其他化疗药或放射疗法杀灭癌细胞或恶性肿瘤细胞。
2.如权利要求1所述2，3-吲哚二酮-3-肟的制备方法，其特征是使用一种无水有机溶剂，该溶剂的特征是能够保证2，3-吲哚二酮(即靛红)在该溶剂中的室温溶解量≥0.5mol/L；用该溶剂溶解盐酸羟胺和2，3-吲哚二酮，并加入一种无机或有机碱；通过调节所加碱与盐酸羟胺的当量比，保证反应体系的pH值为中性或弱酸性；在机械搅拌中于温度范围为0℃至50℃的任何一种温度下反应生成2，3-吲哚二酮-3-肟；反应达终点后，向反应体系中加入2至5倍体积的水，致使鲜黄色的2，3-吲哚二酮-3-肟沉淀析出；再通过反复水洗、或反复水洗后有机溶剂内的重结晶，获得2，3-吲哚二酮-3-肟纯品；用本方法制备的2，3-吲哚二酮-3-肟满足以下结构
3.如权利要求2所述的2，3-吲哚二酮-3-肟制备方法，所用无水有机溶剂为以下溶剂之中的任何一种二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、N-甲基吡硌烷酮、吡啶、二甲基亚砜(DMSO)；其中优选二甲基甲酰胺。
4.如权利要求2所述的2，3-吲哚二酮-3-肟制备方法，盐酸羟胺与靛红的摩尔比为1至1.5∶1；所用的一种碱是以下任何一种氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氧化钙、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、四硼酸锂、四硼酸钠、四硼酸钾、三乙胺、吡啶、羟胺，其中优选氢氧化锂；在所用反应溶剂中，盐酸羟胺、靛红、碱的溶解或加入可按任何顺序进行；碱的加入量以保证反应体系的pH值为中性或弱酸性为准，即取1份体积的反应体系混合液，加10份体积的水混匀，测得的溶液pH值在4至7.5之间，其中优选pH值范围为5至6.5。
全文摘要
本发明公布了一种2，3-吲哚二酮-3-肟、或称靛红-3-肟的制备方法，并公布了2，3-吲哚二酮-3-肟在制备癌症预防或治疗药物方面的用途。2，3-吲哚二酮-3-肟在癌症或其他恶性肿瘤防治方面的用途基于以下特征该物质对多种肿瘤细胞具有明显的生长抑制作用；对细胞增殖周期具有特异性的G1期阻断作用，即能够阻止肿瘤细胞进行DNA复制；对周期蛋白cyclin E、cyclin B和cyclin A的表达有明显下调作用；对细胞周期抑制因子p21的表达有明显上调作用；对癌细胞或癌前病变细胞具有分化诱导作用；对基因毒类化疗药有增敏作用。
文档编号A61K31/404GK101816649SQ200910009279
公开日2010年9月1日 申请日期2009年2月27日 优先权日2009年2月27日
发明者张页, 林维佳, 张丽君, 赵翔, 张瑶, 薛非凡 申请人:北京大学