专利名称：：核桃仁醇提物及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，特别是一种核桃仁醇提物及其用途。二
背景技术：
：癌症是威胁人类健康的首要疾病，癌细胞失去控制的增殖是其难治的原因，生长因子与细胞膜上相应的受体结合向细胞核传递生长信号引起细胞正常生长，异常增强的细胞生长信号是癌细胞失控增殖的关键原因，抑制癌细胞生长的信号传递是抗癌药物研制的重要途径，寻找控制癌细胞增殖的药物一直是医学研究的难题。发明人运用检测动物记忆力的水迷宫实验，观察了核桃仁对青年小鼠、老龄小鼠、老龄大鼠记忆力的影响，证明了核桃仁增强记忆力的确切效果，发明人对核桃仁药物作用的思考和研究一直没有间断过，为了进一步弄清核桃仁增强记忆力的成分和机理，发明人在网上和图书中查阅了大量的资料，其中药物对培养细胞的作用是发明人最感兴趣的实验，当发明人用乙醇提取核桃仁活性成分观察它对培养的神经细胞的作用时，证明核桃仁醇提物能抑制神经肿瘤细胞增殖。迄今为止，尚未见到将核桃仁醇提物用于制备抗癌药物上的应用的报道。三
发明内容针对上述情况，本发明的目的就在于提供一种核桃仁醇提物及其用途，有效开拓了核桃仁醇提物的新用途，能抑制神经肿瘤细胞增殖，可用于制备抗癌药物上，解决控制癌细胞增殖的问题，核桃仁醇提物是，核桃仁加入核桃仁重量的4-IO倍无水乙醇浸泡一周后，过滤，得药液，55-65'C下浓縮药液，55-65'C真空干燥，获得棕黄色油状的核桃仁醇提物，得率7.34%;IC藏时用二甲基亚砜(DMS0)溶解成浓度为300PgAi1的贮存液，置-20。C冰箱保存备用。实验时将贮存液用所培养细胞要求的不含血清培养基配成所需浓度，过滤除菌，加入血清。本发明通过试验证明核桃仁醇提物对多个癌细胞株具有抑制其增殖的作用，抑制癌细胞EGFR—PLC-Y1—PKCa的生长信号传导是其抑制癌细胞增殖的重要机制。核桃仁不仅是强身健脑的食品，而且含有广谱安全高效药效特点的有效成分，有作为新的抗癌药物开发研究的潜力。四图1为本发明醇提物对骨肉瘤量效关系曲线图，其中Y=U01+10.4421n(x)R2=0.9113IC5O=108.050tig/ml<图2为本发明醇提物对乳腺癌量效关系曲线图，其中Y=-14.961+12.1481n(x)R2-0.934IC50=216.654|ig/ml。图3为本发明醇提物对卵巢癌量效关系曲线图，其中Y=-16.807+12.1301n(X)R2=0.964IC50=254.153)ig/ml。图4为本发明醇提物对肺癌量效关系曲线图，其中Y=-24.521+11.6251n(x)R2=0.931IC50=593.244ng/ml。图5为骨肉瘤细胞对照组。图6为骨肉瘤细胞核桃仁组。图7为乳腺癌细胞对照组。图8为乳腺癌细胞核桃仁组。图9为卵巢癌细胞对照组。图10为卵巢癌细胞核桃仁组。图11为肺癌细胞对照组。图12为肺癌细胞核桃仁组。图13为本发明醇提物对癌细胞增殖抑制作用的时效关系图。图14为本发明醇提物对核桃仁对癌细胞EGFR、PLC-Y1和PKCa蛋白表达的影响图，其中C，对照组；T,用药组；H，骨肉瘤；M，乳腺癌；S，卵巢癌；L，肺癌。五具体实施方式实施例1取核桃仁45g，加入180ml无水乙醇浸泡一周后，滤纸过滤，得药液，旋转蒸发仪56t浓縮药液，58'C真空干燥，获得棕黄色油状的核桃仁醇提物。实施例2取核桃仁50g，加入250ml无水乙醇浸泡一周后，滤纸过滤，得药液，旋转蒸发仪58。C浓縮药液，6(TC真空干燥，获得棕黄色油状的核桃仁醇提物。实施例3取核桃仁55g，加入550ml无水乙醇浸泡一周后，滤纸过滤，得药液，旋转蒸发仪60°C浓縮药液，6CTC真空干燥，获得棕黄色油状的核桃仁醇提物。4以上实施例中的核桃购自郑州土产商店；滤纸来自抚顺滤纸厂，中速滤纸，滤纸孔径4.45微米，直径15cm。本发明核桃仁醇提物经大量试验证明对多个癌细胞株具有抑制其增殖的作用，可有效用于制备抗癌药物的应用，试验资料如下l.材料和方法1.1材料1.1.1核桃仁醇提物核桃仁醇提物贮存时用二甲基亚砜(DMS0)溶解成浓度为300Pg/W的贮存液，置-20。C冰箱保存备用。试验时将核桃仁醇提物贮存液用所培养细胞要求的不含血清培养基配成所需浓度，0.22Wn滤膜过滤除菌，加入血清。1.1.2细胞株人骨肉瘤细胞株Hosp36、乳腺癌细胞株MCF-7、人卵巢癌细胞株SK0V3和人肺腺癌细胞株A549购于中国医学科学院基础研究所细胞中心。1.1.3主要试剂RPMI1640、MEM和DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，苯甲基磺酰氟和亮抑制肽(PMSF和Le叩印tin)(Amresco公司)，丙烯酰胺(Biomol公司)，胰蛋白酶与辣根过氧化物酶偶合的山羊抗小鼠IgG-HRP和山羊抗兔IgG-服P(华美公司)，增强化学发光(enhancedchemiluminecence，ECU试剂盒(SantaCruz公司),PLC-y1单克隆抗体(韩国浦项科技大学国家信号传导网络实验室惠赠)，EGFR单克隆抗体(SantaCruz公司)，PKCa多克隆抗体(SantaCruz公司)，蛋白分子量标准(中国科学院上海生物化学研究所)；四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma公司)，考马斯亮蓝G250(Amresco公司)，硝酸纤维素膜(LifeScience公司)。其他化学试剂均为分析纯，商业购得。1.1.4主要仪器设备Heraeus细胞培养箱(德国Kendro公司)，Axiovert25倒置显微镜(Zeiss公司)，BioMate紫外分光光度计(Thermo公司)，SG-603生物安全柜(Bake公司)，ELx800型酶标仪(Bio-Tek公司)，pH测定仪(意大利HANNA公司)，可调移液器P1000、P200、P100、P20(Gilson公司)，12通道加样器(Thermo公司)，蛋白电泳系统(Bio-Rad公司)，R0TINA35型离心机(德国Hettich公司)，3-18K型台式高速冷冻离心机(Sigma公司)，RE-3000B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，DZF-6050真空干燥箱和DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏试验设备有限公司)，自动消毒锅(T0MY公司)，超纯水制备仪(LABC0NC0公司)，78-1型磁力加热搅拌器(江苏姜堰市天力医疗器械有限公司)，VCX750超声破细胞破碎仪(Sonics&Materials公司)。1.2方法1.2.l细胞培养从液氮罐中迅速取出癌细胞株，立即水浴解冻，吸出细胞悬液移入离心管中，加入10ml无血清培养基，混匀，1000转/分钟离心10分钟，弃上清，将细胞接种于含10%胎牛血清的培养液中，EC9706和SK0V3细胞用RPMI1640培养基，MCF-7和Hosp36细胞用MEM培养基，于37'C、5°/￡02培养箱中培养，每间隔48小时更换一次培养基，待细胞生长至70%汇合率时，用胰蛋白酶溶液[用D-Hans液配制，含0.25%胰蛋白酶，0.02%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，pH8.3]消化，按实验要求接种于96孔培养板中或①100培养皿中。1.2.2MTT法测定细胞生长活性在96孔培养板中接种5Xl(f细胞/L，培养24小时后，分别加入含倍比稀释药液的培养液200nl，药物设8个浓度为，继续培养48小时。在倒置显微镜下对细胞形态进行观察、拍照。吸去上清液，每孔加100yl新鲜配制的含0.2mg/mlMTT的无血清培养基，37°C继续培养4小时，用150u1DMS0溶解MTT，在酶标仪上以570和630nm测定光密度值。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，计算半数抑制率所需药物浓度ICs。值。肿瘤细胞生长抑制率(％)=(l—实验组光密度值/对照组光密度值)X100%。药物的8个浓度见表1。1.2.3MTT法测定细胞抑制作用时效关系在96孔培养板中接种5X103细胞/L，培养24小时后，分别加入IC5。药物浓度，每组6个复孔，分别于12、24、36、48、60小时检测，方法如上。1.2.4免疫印迹法[5]测定细胞中EGFR、PLC-Y1、PKCa蛋白含量接种在cp100培养皿中细胞，37°C、5%0)2培#箱培养24小时后，分别按ICs。药物浓度加入药物，继续培养48小时，收获细胞，用细胞裂解液裂解(裂解液组成20mM服PES，pH7.2，10°/。甘油、50mMNaCl，l%TritonX-100,lmMNa3V04、10ug/mlLeup印tin和lmMPMSF)，14000g、4'C离心15分钟，收集上清，用Bradford法测定蛋白浓度，20ug/孔上样，经8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%SDS-PAGE)，分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉TTBS溶液封闭滤膜1小时(TTBS组成10函Tris,pH7.6,150mMNaCl，0.05%Tween-20)，每张膜用所要检测蛋白相应的抗体室温反应4-6小时，用TTBS洗涤30分钟，再用相应的羊抗鼠或羊抗兔IgG-HRP反应2小时，用TTBS洗涤30分钟，将膜转入另一塑料袋中，加入ECL6试剂A、B液，封口，将硝酸纤维素膜放于暗盒中，放上X光胶片曝光，显影、定影、洗片。1.2.5统计方法数据应用软件spssl3.0进行相关分析和曲线拟合，得到拟合方程，计算半数抑制浓度IC50。2结果2.1对癌细胞增殖抑制作用的量效关系核桃仁醇提物可明显抑制骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌和肺癌细胞的增殖，对癌细胞生长抑制率随药物浓度的增加而上升，呈现剂量-效应依赖关系，其作用强弱依次为骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌和肺癌细胞(见表1、图1-4)。表l.核桃仁:醇提物对癌细胞增殖抑制的量效关系药物浓度抑制率(％)(Pg/ml)骨肉瘤乳腺癌卵巢癌肺癌12.521.26112.16113.5343.1412531.78516.87821.93318.9585045.80539.03428.22119.58110052.06545.75840.60920.27820065.42152.55144.93237.29740066.85062.85563.99951.21580067.83463.76665.38357.733160071.44068.53267.44056.152对四种癌细胞作用的量效关系曲线拟合见图1-4，骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌和肺癌的ICs。值分别为108.05(￥g/ml、216.65扭g/ml、254.153Pg/ml和593.244Pg/ml。2.2对癌细胞形态学影响在倒置显微镜下观察，用核桃仁醇提物处理的癌细胞与对照组细胞相比，数量明显减少，形态发生明显改变。骨肉瘤对照组细胞贴壁生长，呈梭形，折光性良好；核桃仁组细胞数量明显减少，细胞皱縮，圆形细胞增多，透光度降低(见图5-6)。乳腺癌对照组细胞贴壁生长，如贝壳状或三角形状，折光度良好；核桃仁组细胞数量减少，细胞皱縮，圆形细胞增多，漂浮细胞增多，折光度降低(见图7-8)。卵巢癌对照组细胞贴壁生长，生长快速，呈梭形，折光度良好；核桃仁组细胞数量减少，细胞皱缩，呈条形或圆形，胞质充满颗粒或空泡(见图9-10)。肺癌对照组细胞贴壁生长，呈条形，折光度良好；核桃仁组细胞数量明显减少，细胞7皱縮，透光度减低，圆形细胞明显增多(见图11-12)。2.3对癌细胞增殖抑制作用的时效关系核桃仁醇提物对骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌和肺癌细胞在半数抑制浓度情况下，对癌细胞的增殖抑制效果随时间增加而增强，呈时间-效应依赖关系；对各癌细胞生长抑制在48小时达到高峰，48小时后抑制作用较为缓和；其中对骨肉瘤细胞在36小时内抑制效果随时间增加最快，抑制增长速度依次为骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌细胞(见表2、图13)。核桃仁醇提物对骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌细胞形态影响，在半数抑制浓度情况下，随着时间的增加，细胞数量明显减少，形态发生各种不同改变。表2.核桃仁醇提物对癌细胞增殖抑制作用的时效关系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.4对EGFR、PLC-Yl、PKCa蛋白表达的影响免疫印迹法检测显示应用核桃仁醇提物处理的细胞的蛋白条带与对照组相比减弱，说明核桃仁均能下调癌细胞EGFR、PLC-Yl和PKCa蛋白表达水平，其作用强弱依次为骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌和肺癌(见图14)。3讨论活细胞的线粒体能量代谢过程所产生的琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的四甲基偶氮唑盐[3-(4，5-dimethylthiazo1-2-yl)2，5-diphenyltettrazoliunbromide,MTT]还原成蓝紫色的结晶沉积在细胞内和细胞周围，用DMS0溶解紫色沉淀后，在酶标仪上以波长570nm/630nm测定其光密度(0D)值，形成的结晶与增值的细胞数成正比，即0D值越大，细胞数越多，因此，MTT法是测定细胞增殖活性的常用的简便准确的方法。本研究用MTT法检测发现核桃仁醇提物对培养的骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌和肺细胞增殖具有不同程度的抑制作用，在显微镜下也观察到用核桃仁醇提物处理的癌细胞与对照组细胞相比，数量明显减少，形态发生改变，这都说明了核桃仁醇提物确有抑制癌细胞的作用。为了了解核桃仁醇提物对癌细胞作用的最佳剂量和时间，本研究观察了核桃仁醇提物抑制癌细胞增殖的剂量-效应和时间-效应，结果表明核桃仁醇提物对这四种癌细胞的抑制作用都呈量效和时效依赖关系，运用软件spssl3.0进行统计分析表明核桃仁醇提物对这四种癌细胞的抑制效果大小依次为骨肉瘤〉乳腺癌〉卵巢癌〉肺癌，IC5。值分别为108.050Pg/ml、216.654Pg/ml、254.153^g/ml和593.24化g/ml。用核桃仁醇提物处理这四种癌细胞48小时，对各癌细胞生长抑制效果达到高峰。核桃仁历来被作为营养保健的安全果品，本实验在观察核桃仁醇提物对上述四种癌细胞作用的同时，还发现其对人甲状腺癌细胞株SW579细胞、大鼠胰腺癌细胞株Rin-m5F细胞、人食管癌细胞株EC9706细胞及人子宫颈癌细胞株SiHa细胞增殖有明显的直接抑制作用，这种广谱安全高效的药效特点显示出核桃仁具有作为新的抗癌药物开发研究的潜力。生长因子与细胞膜上相应的受体结合向细胞核传递生长信号引起细胞正常生长，异常增强的细胞生长信号是癌细胞失控增殖的关键原因，抑制癌细胞生长的信号传递是抗癌药物研制的重要途径。本研究观察了核桃仁醇提物是否能够通过抑制表皮生长因子受体(EGFR)生长信号传递来抑制癌细胞增殖。EGFR生长信号传递过程是表皮生长因子受体(EGFR)—磷脂酶C-Yl(PLC-Yl)—蛋白激酶Ca(PKCa)—细胞增殖，EGFR是跨细胞膜受体，磷脂酶C-Yl(PLC-Yl)是细胞膜内侧蛋白，蛋白激酶Ca(PKCa)是胞浆蛋白，各种原因引起EGFR、PLC-Y1、PKCa过量表达，或EGFR细胞内部分的酪氨酸磷酸化而高度激活，然后依次使PLC-Yl、PKCa磷酸化，这些都会使癌细胞失控增殖。免疫印迹方法，是根据抗体与抗原特异性结合的原理，先将蛋白通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分离开来，然后将胶内的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，再用已知抗体与膜上蛋白反应，结合上的抗体再与辣根过氧化物酶偶联的抗免疫球蛋白抗体反应，最后加入酶联抗体生色底物或发光底物，在膜上抗原抗体结合处显示染色蛋白条带，或用X光片曝光，在胶片上出现蛋白显影条带，根据条带的有无、位置和深浅可以鉴定细胞或组织样品中是否有相应蛋白的表达、分子量的大小及表达量的多少。发明人用免疫印迹方法检测核桃仁醇提物对癌细胞中EGFR、PLC-Yl、PKCa表达的作用，证明核桃仁醇提物明显抑制癌细胞中EGFR、PLC-Yl、PKCa表达水平，说明核桃仁醇提物抑制癌细胞EGFR—PLC-Yl—PKCa的生长信号传导是其抑制癌细胞增殖的重要机制。总之，通过试验证明核桃仁醇提物确有抑制癌细胞增殖的作用，并揭示出它抑制癌细胞增殖的一种重要机制。说明核桃仁不仅是强身健脑的食品，也含有效的抗癌活性成分，通过提取这些成分并研究其作用机制将会研制出新的抗癌药物。权利要求1、一种核桃仁醇提物，其特征在于，该醇提物是核桃仁加入核桃仁重量的4-10倍无水乙醇浸泡一周后，过滤，得药液，55-65℃下浓缩药液，55-65℃真空干燥，获得棕黄色油状的核桃仁醇提物，得率7.34％。2、核桃仁醇提物在制备治疗抗癌药物的应用。全文摘要本发明涉及一种核桃仁醇提物及其用途，有效开拓了核桃仁醇提物的新用途，能抑制神经肿瘤细胞增殖，可用于制备抗癌药物上，解决控制癌细胞增殖的问题，核桃仁醇提物是，核桃仁加入核桃仁重量的4-10倍无水乙醇浸泡一周后，过滤，得药液，55-65℃下浓缩药液，55-65℃真空干燥，获得棕黄色油状的核桃仁醇提物，得率7.34％；贮藏时用二甲基亚砜溶解成浓度为300μg/μl的贮存液，置-20℃冰箱保存备用。实验时将贮存液用所培养细胞要求的不含血清培养基配成所需浓度，过滤除菌，加入血清。本发明通过试验证明核桃仁醇提物对多个癌细胞株具有抑制其增殖的作用，有作为新的抗癌药物开发研究的潜力。文档编号A61P35/00GK101530464SQ20091006455公开日2009年9月16日申请日期2009年4月3日优先权日2009年4月3日发明者高司申请人:高司