施用抗TNFα抗体的方法

专利名称：：施用抗TNFα抗体的方法施用抗TNFa抗体的方法本申请是申请日为2002年6月5日、申请号为02815654.4、发明名称为"施用抗TNFa抗体的方法"的发明专利申请的分案申请。
背景技术：
：肿瘤坏死因子(TNFcx)是一种由多种细/!包(.包括-单核细刃包和巨噬细胞)产生的细胞因子,最初是根据其诱导某些鼠肿瘤坏死的能力而鉴定出的(参见Okl，L.(1985)Science230:630-632)。随后，确定了一种与恶病相关的，命名为恶液质素(cachecti-n)的细月包因子和TNFcc是同一分子。TNFa参与介导休克(参见Beutler，B.和Cerami,A.(]998)A讓i.Rev.Biochem.57:505-518;Beutier,B.和Cerami，A.(.1998)A皿u.Rev.Immunol.7:625-655)。此外，TNFa与其它多种人类疾病和失调的病理生理学有关，包括脓血症、感染、自身/乙疫病、移4直排-斥和移才直物4元宿主疾病(参、见Vasilli，P.(1992)Amiu.Rev.Immunol.10:411-452;Tracey,K丄和Cerami,A.(1994)Anmi.Rev.Med.45:491-503)。鉴于人TNFa(hTNFcc)在多种人类失调中所扮演的有害角色，治■疗策略被设计为抑制或中和hTNFa的活性。尤其是，能够结合并中和hTNFa的抗体巳被作为一种抑制liTNFa活性的手段(means)。某些最早的这类抗体是鼠的单克隆抗体(mAbs),由用hTNFa免疫的鼠淋巴细胞制备的杂交瘤分泌(参见HahnT.等，(1985)Pi-oNatlAcadSciUSA82:3814-381.8;Uang,C-M等(1986).Biochem.Biop'hys.Res.Comimm.137:S47-S54;Hirai,M等(I9S7)J.Immunol,Methods96:57-62;Fendly,B.M.等，(19S7)Hybridonm6:359-370;M0ller,A.等(:l990)Cytoldne2:162-169;Moeller等的美国专利No.523:1024;Wallach,D.的欧洲专利出版物No.186833B'1;CXld等的欧洲专利申请No.21886SAl;由Moe]lerA.等的欧洲专利出版物No.260610B〗)。这.些鼠抗hTNFa抗体通常显示较高的与hTN:Fa的亲和力(如Kd、<10.9M)并能中和hTNFa活性，但体内应用这些抗体可能受制于施用这些鼠抗人抗体相关的问题，如血清半衰期短、不能触发某些人体效应器功能以及人体内诱发不期望的对鼠抗体的免疫应答("人抗鼠抗体"(HAMA)的反应)。10用基因工程的方法将鼠抗hTNFcx抗体改造得更为"人化"。比如，已经制备了嵌合抗体，其中抗体链的可变区是鼠源性的，而恒定区则是人源性的(Kmght，D.M.等(1993)Mol.Immunol.30:1443-1453;Daddona，P.E.等的PCT出版物No.W092/16553)。此外，也制备了人源化抗体，其中抗体可变区的超变区是鼠源性的，但可变区的其余部分和抗体恒定区是人源性(Adair,J.R.等的PCT出版物No.W092/11383)。然而，因为这些嵌合和人源化抗体仍保留一些鼠序列，它们仍可能谈发不期望的免疫反应，即人抗嵌合抗体(HACA)反应，尤其是长期施用时，如治疗类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)等慢性适应症时(参见Elliott,MJ.等(1994)Lancet344:1125-1127;Elliot,M丄等(1994)Lancet344:1105-1110)。a抑制剂应当是完全的人抗hTNF(x抗体，因为这类药剂即使是长期使用也不会诱发HAMA反应。应用人杂交瘤技术已经制备了人抗hTNFa的单克隆自身抗体(Boyle，P等(1993)Cell.Immunol.152:556-568;Boyle，P.等(1993)Cell.Immunol.152:569-581;Boyle等的欧洲专利申请出版物No.6M9MA2)。然而，据报道这些杂交瘤来源的单克隆自身抗体对hTNFa有亲和力，但亲和力太低以至于用常规方法测不出来，也不能够结合可溶性的hTNFoc,也不能够中和hTNFai秀导的细胞毒性(参见Boyle等；同上)。而且，人杂交瘤技术的成功依赖于人周血中天然存在的产生特异性抗hTNFoc自身抗体的淋巴细胞。某些研究检测了人体中的抗hTNFoc的血清自身抗体(Fomsgaard，A等(1989)Scand.J.Immunol.30:219-223;Bendtzen,K等(1990)Prog.LeukocyteBiol10B:447-452),而其它的研究没有进行检测(Leusch,H-G等(1991)J.Immunol.Methods139:145-147)。除天然存在的人抗hTNFa外可选择重组hTNF'oc抗体。与hTNFct以相对低的亲和力(如Kd约10^M)和快的解离速率(如K。ff约]0'2/秒)结合的重组人抗体已有报道(Griff池s，A.D.等(1993)EMBOJ.12:725-734)。然而，由于它们的相对快速的解离动力学，这些抗体不适于治疗用。此外，已报道一种重组人抗hTNFcx不能中和hTNFcc活性，反而强化hTNFa与细胞表面的结合，加速其内吞(Lidbury,A等(1994)Biotechnol.Ther.5:27-45;Aston,R等的PCT出版物No.W092顧45)。也有报道描迷了重组人抗体，能够以高的亲和力以及慢的解离速率结合可溶的hTNFa，这种抗体能够中和hTNFa活性，包括hTNFcx诱导的细胞毒性(体内和体外)和hTNFa诱导的细胞活化(参见美国专利No.6090382)。施用抗体的典型方案为每周静脉用药。每周施用抗体和/或任何药物是昂贵的、繁瑣的，而且由于频繁施用而导致副反应次数的增加。另外，静脉施用通常需要受过医学训练的人来操作，这也是一种限制。发明概述本发明提供一种治疗TNFoc相关失调的每两周进行一次的用药方法，优选地通过皮下用药。每两周用药一次与每周用药一次相比有许多优点，包括但不限于，较少的注射总数，较少的注射部位反应(如局部疼痛与肿胀)，患者接受程度提高(归因于注射频率降低)'，对患者和卫生保健机构(healthcareprovider)而言较低的花费。皮下用药本身也有优点，即患者可自己施用治疗剂，如人TNFa抗体，这方便了患者和卫生保健机构。本发明提供了治疗其中TNFcc活性有害的失调的方法。该方法包括给受试者每两周皮下注射抗体一次。优选的抗体是能够特异性结合人TNFoc的重组人抗体。本发明进一步提供了治疗其中TNFa活性有害的失调的方法。这些方法包括利用联合治疗方法，其中人抗体与其它治疗药剂一同给受试者施用，所述其它治疗药剂如一种或多种可与其它靶物质结合的抗体(如结合其它细胞因子或细胞表面分子的抗体)，一种或多种细胞因子，可溶性TNFoc受体(见例如PCT出版物No.WO94/06476)和/或一种或多种能够抑制TNFoc产生或抑制其活性的化学药剂(诸如PCT出版物No.W093/19751中所述的cyclohexaneylidene衍生物)，优选药剂是氨甲蝶呤。抗体优选能够特异性结合人TNFcc的重组人抗体。本发明抗体的特征是以高亲和力和低解离动力学与hTNFa结合，而且能够中和hTNFa活性，包括hTNFcx诱导的细胞毒性(体内和体外)和hTNFoc诱导的细胞活化。这些抗体可以是全长的(如IgGl或IgG4抗体)，也可^L包含抗原结合部分(如Fab,F(ab')2,scFv片段或单结构域)。本发明最优选的重组抗体命名为D2E7,其轻链CDR3结构域包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，重链CDR3结构域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列(在附录B中列出)。优选地，D2E7抗体轻链可变区(LCVR)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列，重链可变区(HCVR)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。这些抗体在美国专利No.6090382中有描述，其全文在此引入作为参考。在一个实施方案中，本发明提供了治疗其中TNFa活性有害的失调的方法。这些方法包括每两周皮下施用一次抗TNFa抗体，抑制人TNFcc活性而治疗失调。失调可以是例如脓血症、自身克疫性疾病(如类风湿性关节炎、变态反应、多发性硬化、自身免疫性糖尿病、自身免疫性色素层炎以及肾病综合征)、感染性疾病、恶性肿瘤、移植排斥或移植物抗宿主疾病、肺失调、骨失调、肠道失调或心脏失调。在另一实施方案中，本发明提供了治疗其中TNFa活性有害的失调的方法。这些方法包括通过皮下施用抗TNFoc抗体和氨曱蝶呤，抑制人TNFoc活性，从而治疗失调。在一方面中，氨曱蝶呤与抗TNFa抗体一同施用。在另一方面中，在施用抗TNFcx抗体之前施用氨甲蝶呤。在另一方面中，在施用抗TNFa抗体之后施用氨甲蝶呤。在一优选实施方案中，用于治疗其中TNFa活性有害的失调的抗TNFa抗体是人抗TNFa抗体。更优选的是，通过每两周皮下施用分离的人抗体或抗体的抗原结合部分来进行治疗。优选地，抗体或其抗原结合部分以&为1x10-8M或更小，K。ff速率常数为1xIO'V秒或更小从人TNFa解离，这两者都是由表面等离子共振(surfaceplasmonresonance)测定；而且按照标准的体外L929检测方法以1(35。为1x10—7M或更低中和人TNFa细胞毒性。更优选地，分离的人抗体或其抗原结合部分以K。ff为5xl(TV秒或更小，更优选地以K。ff为1xlO"V秒或更小，从人TNFcc解离。更优选地，分离的人抗体或其抗原结合部分，按照标准的体外L"9检测方法检测，以1(:5。为1x10-8M或更低，进一步优选以IC5。为1xj0一M或更低，更进一步优选以ICs。为]x10"。M或更低，中和人TNFa细胞毒性。再另一实施方案中，本发明提供了通过给受试者每两周皮下施用人抗体或其抗原结合部分来治疗其中TNFa活性有害的失调的方法。所述抗体或其抗原结合部分优选具有下列特征a)由表面等离子共振测定，以K。ff为1x10-3/秒或更小从人TNFa解离；b)具有轻链CDR3结构域，其包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或通过在l，4,5,7或8位进行单一丙氨酸替代，或在1,3,4,6，7，8和/或9位进行1至5个保守氨基酸替代由SEQIDNO:3修饰的氨基酸序列；c)具有重链CDR3结构域，其包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，或通过在2,3，4,5,6,8,9,10或11位进行单一丙氨酸替代，或在2,3,4，5,6,8，9,10,11和/或12位进行I至5个保守氨基酸替代由SEQIDNO:4修饰的氨基酸序列；更优选地，抗体或其抗原结合部分以K。ff值为5xl(TV秒或更小从人TNFoc解离。进一步优选地，抗体或抗体的抗原结合部分以K。ff值为1x10，秒或更小从人TNFoc解离。在另一实施方案中，本发明提供了治疗其中TNFa活性有害的失调的方法。这些方法包括每两周给受试者皮下施用人抗体或其抗原结合部分。抗体或其抗原結合部分优选包含LCVR区和HCVR区，所述LCVR区具有CDR3结构域，其包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或通过在l,4，5，7或8位进行单一丙氨酸替代由SEQIDNO:3修饰的氨基酸序列；所迷HCVR区具有CDR3结构域，其包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，或通过在2,3,4,5,6,8,9，10或11位进行单一丙氨酸替代由SEQIDNO:4修饰的氨基酸序列。进一步优选地，LCVR区还具有CD2结构域，该结构域包含SEQIDNO:5的氨基酸序列，而HCVR还具有CD2结构域，该结构域包含SEQIDNO:6的氨基酸序列。再进一步优选地，LCVR区还具有CDR1结构域，该结构域包含SEQIDNO:7的氨基酸序列，而HCVR具有CDR1结构域，该结构域包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明提供了通过每两周给受试者皮下施用分离的人抗体或其抗原结合部分来治疗其中TNFa活性有害的失调的方法。所述抗体或抗体的抗原结合部分优选包含LCVR区和HCVR区，所述LCVR区包含SEQIDNO:1的氨基酸序列；而所述HCVR区包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体具有IgGl重链的恒定区或IgG4重链的恒定区。在另一实施方案中，抗体是Fab片段、F(ab')2片段或单链Fv片段。在另一实施方案中，本发明提供了用于治疗失调的方法，该方法通过每两周给受试者皮下施用一种或多种抗TNFcc抗体或其抗原结合部分而使受试者获益。所述抗体或其抗原结合部分优选包含LCVR区或连同HCVR区，所述LCVR区具有CDR3结构域，其包含选自SEQIDNO:3，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:〗4,SEQIDNO:15，SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:]9,SEQIDNO:20，SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:24,SEQIDNO:25,SEQIDNO:26的氨基酸序列；而所述HCVR区具有CDR3结构域，其包含选自SEQIDNO:4,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30，SEQIDNO:31,SEQDNO:32，SEQIDNO:33，SEQIDNO:34和SEQIDNO:35的氨基酸序列。本发明的另一个方面涉及包含药物制剂的试剂盒，所述药物制剂包含药物组合物。该试剂盒包含抗TNFoc抗体和药学上可接受的载体。试剂盒内附有每两周皮下施用治疗失调的药物组合物的i^明，其中施用抗丁NFoc可使患者获益。在另一个方面中，本发明涉及包含药物制剂的试剂盒，所述药物制剂包含药物组合物，所述试剂盒进一步包含抗TNFoc抗体、氨曱蝶呤以及药学上可接受的载体。试剂盒内附有皮下施用治疗失调的药物组合物的说明，其中施用抗TNFa抗体可使患者获益。本发明的另一方面提供了一种含有药物组合物的预装的注射器，所述药物组合物包含抗TNFa抗体和药学上可接受的敎体。在另一方面中，本发明提供了一种含有药物组合物的预装的注射器，所述药物组合物包含抗TNFoc抗体、氨甲蝶呤和药学上可接受的载体。附图简述15图1A和IB显示了患类风湿性关节炎(RA)患者在每周皮下施用一次D2E7抗体，共施用12周后的美国风湿病学会20(ACR20)和ACR50反应结果(图1A)，或在隔周皮下施用一次D2E7抗体和氨甲蝶呤，共施用24周后的美国风湿病学会20(ACR20)和ACR50反应结果(图1B)。这些资料表明隔周施用与每周施用一样有效。图2显示了患类风湿性关节炎患者在隔周皮下施用一次D2E7抗体和氨甲蝶呤，施用24周后的ACR20、ACR50和ACR70反应结果。掛3显示了患类风湿性关节炎患者在隔周皮下施用一次D2E7抗体和氨甲蝶呤，施用24周后的疼痛关节计数pA)和肿胀关节计数(3B)随时间的结杲。图4显示了患类风湿性关节炎患者在隔周皮下施用一次D2E7抗体和氨曱蝶呤，施用24周后的体检结果简表(SF-36)。RP,身体状况(rolephysica]);PF,身体功能；BP,身体疼痛；GH,总体健康状态；V,活力；SF,社会功能；RE,情绪状况；和ME,精神健康。图5显示了患类风湿性关节炎患者在静脉注射一次D2E7抗体和氨甲蝶呤后ACR反应的百分比。发明详述本发明涉及治疗失调的方法，在所述失调中施用抗丁NFoc抗体对患者有益，所述方法包括施用分离的人抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分以高亲和力、低解离速率和高的中和能力与人TNFa结合，从而治疗失调。本发明的各个方面涉及用抗体和抗体片段进行治疗，以及它们的药物组合物。为了使本发明更易于理解，首先定义某些术语。本文所用术语"用药(dosing)",是指施用一种物质(如抗TNFa抗体)以获得治疗目的(如治疗TNFa相关的失调)。'本文所用术语"两周一次用药方案"，"两周一次用药"，"两周一次施用"，是指为获得治疗目的(如治疗TNFa相关的疾病)而给受试者用药(如抗TNFa抗体)的时间间隔。两周一次用药方案并不包括每周一次用药方案。优选每9-19天用药一次，进一步优选的是每11-17天用药一次，更优选的是每13-15天用药一次，最优选的是每14天用药一次。本文所用术语"联合治疗"是指施用两种或两种以上的治疗物质，如抗TNFcx抗体和氨甲蝶呤。氨甲蝶呤可以与抗TNFct抗体同时施用，也可以在施用抗TNFcx抗体前施用，或者在施用抗TNFcc抗体后施用。本文所用术语"人TNFcx"(缩写为hTNFoc或hTNF),是指一种人的细胞因子，该因子以分泌形式存在时分子量为17kD,以膜相关形式存在时分子量为26kD,生物活性形式是由17kD的分子以非共价键方式结合的三聚体形式存在。TNFoc的结构在如Pennica，D等(1984)Nature312:724-729;Davis,J.M.等(1987)Biochemistry26:1322-1326和Jones，E.Y.等Nature338:225-228中有进一步的描述。人TNFa包括重组人TNFa(rhTNFcc),该蛋白可以通过标准的重组表达方法制备或购自商品化的产品(R&Dsystems,catalogNo.210-TA,Minneapolis,MN)。本文所用术语"抗体"，是指由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中两条重链(H)和两条轻链(L)通过二硫键相互链接。每条重链又由重链可变区(縮写为HCVR或VH)和重链恒定区组成，重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成；每条轻链又由轻链可变区(縮写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成，轻链恒定区由CL一个结构域组成。VH和VL又进一步的细分为超变区，命名为互补决定区(CDH),分散分布的较保守的区域，命名为框架区(FR)。每条VH和VL又由三个CDR区和4个FR区组成，从氨基端至羧基端按照下列'顺序排列FR1,CDR1，FR2,CDR2，FR3,CDR3,FR4。本文所用的术语抗体的"抗原结合部分"(或简写为"抗体部分")，是指抗体的一个或多个片段，该片段保留了特异性与抗原(如hTNFcc)结合的能力。抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来实现。抗体的"抗原结合部分"一词所包含的结合片段实例，包括(l)Fab片段，由VL、VH、CL和CHI结构域组成的单价片段；(2)F(ab，)2片段，由两个Fab片段在铰链区通过一个二硫键结合在一起的双价片段；(3)由VH和VL组成的Fd片段；(4)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(5)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，由VH结构域组成；(6)分离的互补决定区(CDR)。虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由独立的基因编码，但通过重组方法，可以用合成的接头链接而成为一个蛋白，其中的VL和VH配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见Bird等(1988)Science242:423-426;以及Huston等(19S8)Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。这类单链抗体也包括在抗体的"抗原^合部分"中。其它形式的单链抗体，如diabodies也包括在内。Diabodies是双价、双特异性的抗体，其中VH和VL结构域表达在单一的多肽链上，但由于所用的接头太短而不能使同一条链上的两个结构域配对，因而迫使其与另一条链上的互补结构域配对而产生了两个抗原结合位点(参见Holliger,P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA卯:6444-6448;Poljak，R丄等(1994)Structure2:1121-1123)。进一步来讲，抗体或其抗原结合部分可以是一个大的免疫粘附分子的部分，可以由抗体或抗体部分通过共价或非共价方式与一个或多个其它的蛋白或多肽连接形成。这类免疫粘附分子的实例包括，用链霉抗生物素核心区制得的scFv的四聚体(Kipriyanov,S.M.等(1995)HumanantibodiesandHybridomas6:93-101)和用一个半胱氨酸残基，一个标记肽和C末端多聚组氨酸标记而制成的双价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov,S.M.等(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。用常规技术如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分別消化完整抗体，可以从完整抗体制备抗体部分，如Fab和F(ab')2片^爻。而且，应用如本文所述的标准重组DNA技术，.可以制备抗体、抗体部分和免疫粘附分子。本文所用的术语"人抗体"，包括那些具有从人种系(germline)免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如体外随机或位点特异性的突变或体内细胞突变)，如在CDR区，尤其是在CDR3区。然而，本文所用的"人抗体"，并不包括那些CDR区序列源自其它哺乳动物种类(如鼠)的种系>然后移植至人框架序列的抗体。本文所用的术语"重组人抗体"，包括那些通过重组方法制备、表达、创造或分离的所有人抗体，如用重组表达载体转染宿主细胞表达的抗体(在下面第二部分详述)，分离自重组、组合人抗体文库的抗18体(在下面第三部分详述)，分离自转入人免疫球蛋白基因的转基因动物(如.鼠)的抗体(参见Taylor，L.D等(1992)Nucl.AcidsRes.20:6287-6295),或者是通过其它涉及人免疫球蛋白基因序列剪切至其它DNA序列的方法而制备、表达、创造或分离的抗体。这类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在某些实施方案中，对这类重组人抗体进行体外诱变(或，当使用转入人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因而这类重组人抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样一些序列，它们来源于人种系VH和VL序列且与之相关，但不是体内人抗体种系所有组成部分(repertoire)中天然存在的序列。本文所用的"分离抗体"，是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(如特异性结合hTNFoc的分离抗体，基本上不含与除hTNFa外的抗原特异性结合的抗体)。然而，特异性结合hTNFcx的分离抗体可以与其它抗原(如源于其它物种的hTNFa)有交叉反应性(下面将进一步讨论)。而且，分离的抗体可以基本上不含其它的细胞物质或化学物质。本文所用的"中和抗体"(或"能够中和hTNFcc活性的抗体")，是指能够与hTNFa结合并导致其生物活性被抑制的一类抗体。hTNFcc生物活性的抑制，可以通过4企测hTNFa生物活性的一种或多种指标来测定，如检测hTNFcc诱导的细胞毒性(无论体内还是体外)，hTNFa诱导的细胞活化以及hTNFa与其受体的结合。这些hTNFa的生物活性指标可以通过本领域已知的几种体内或体外标准方法中一种或多种测定(见实施例4)。优选通过hTNFa诱导的L929细胞的细胞毒性的抑制测定抗体中和hTNFa活性的能力。作为一种附加或可选的hTNFa活性指标，可测定抗体抑制hTNFa诱导HUVEC上ELAM-1的表达能力，作为hTNFa诱导细胞活化的量度。本文所用的术语"表面等离子共振"，是指一种光学现象,'可通过检测生物传感器基质(matrix)中蛋白浓度的变化实时地分析生物特异性反应，比如用BIAcore系统(PharmaciaBiosensorAB，Uppsala,SwedenandPiscataway,NJ)。进一步的描述参见实施例1和J加ssonU.等(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26;J加ssonU.等(1991)Biotechniques11:620-627;Johnsson，B等(1995)J.Mol.Recognk.8:125-]31;和Johnsson,B.等(1991)Ana1.Biochem.198:268-277。本文所用的术语"K。ff，，，是指抗体从抗体/抗原复合物上解离下来的解离速率常数。本文所用的术语"Kd",是指特定抗体-抗原反应的解离常数。本文所用的术语"核酸分子"，包括DNA和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，优选双链的。本文在提及编码与hTNFa结合的抗体或抗体部分(例如VH、VL、CD3)的核酸时所用的"分离的核酸分子"，是指一种核酸分子，其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列没有编码可结合非hTNFa的抗原的抗体或抗体部分的其它核苷酸序列，所述其它序列可以天然位于人基因组DNA序列的两侧。比如，本发明的分离的编码抗TNFoc抗体VH区的核酸序列不包括编码结合非hTNFa抗原的其它VH区的序列。本文所用的术语"载体"，是指能够转运与其连接的另一种核酸分子的核酸分子。载体类型之一是"质粒，，，是一种环状双链DNA环，能够连接附加的DNA片段。另一类型的载体是病毒载体，其中附加的DNA片段连接至病毒基因组。某些载体在引入的宿主细胞中能够自主复制(如具有细菌复制启动子的细菌载体和游离的哺乳动物载体)。其它的载体(如非游离的哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合进宿主细胞的基因組，随基因组的复制而复制。而且，某些载体能够表达其连接的基因。这类载体在本文中称为"重组表达载体"(或简称"表达载体，，)。总的来说，重组DNA技术中所用的表达载体通常是质粒。在本文中，"质粒"和"载体"可以混用，因为质粒是最常用的载体。然而，本发明也包括其它形式的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们同样具有一样的功能'。本文所用的术语"重组宿主细胞"(或简称"宿主细胞")，是指引入重组表达载体的细胞。应理解，这一术语包括的不仅是特指的受试者细胞，而且包括其传代细胞。由于突变或环境影响在随后的传代中会发生某些修饰，这样事实上其传代细胞可能与亲代细胞不一样，但仍属于本文所用的"宿主细胞"范畴。在下面的各个小部分中详细描述本发明的不同方面。I.结合人TNFoc的人抗体本发明提供了用抗TNFct抗体而治疗失调的方法，这些方法包括每两周皮下施^一次分离的人抗体或抗体的抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分可以与人TNFcx以高亲和力、低解离常数和高中和能力结合。本发明的人抗体优选重组的、具有中和活性的人抗TNFoc抗体。本发明最优选的重组中和抗体在本文称为D2E7(D2E7VL区氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，D2E7VH区氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)。D2E7抗体的性质在Salfeld等的美国专利No.6090382中已经描述过，在本文中引入作为参考。一方面，本发明涉及用抗TNFoc抗体治疗失调，治疗包括每两周皮下施用一次分离的D2E7抗体或抗体部分、D2E7相关抗体和抗体部分，或与D2E7抗体具有相当的特性的人抗体或抗体部分，所述特性如可以与人TNFa以高的亲和力结合并具有低的解离动力学和高的中和能力。在某一方案中，本发明提供了用分离的人抗体或抗体的抗原结合部分进行治疗的方法，抗体以&为1x10—sM或更小，K。ff速率常数为1x10—3/秒或更小从人TNFa上解离，这二者都由表面等离子共振测定，而且用体外标准L929^佥测方法检测中和人TNFa细胞毒性的ICs。为lxlO々M或更小。进一步优选的分离人抗体或其抗原结合部分的K。,'f为5x]0々秒或更小，或进一步优选K。ff为1x](T4/秒或更小。再优选的分离的人抗体或抗原结合部分，用体外标准的L929检测方法检测其中和人TNFcc细胞毒性的IC^为1x10-8]^或更小，再一步优选的IC^为1x10一M或更小，再优选的IQ。为1x]0-1GM或更小。在某一优选的方案中，抗体为分离的重组人抗体或其抗原结合部分。本领域中众所周知，抗体的重链和轻链的CDR3结构域在抗体与抗原的结合特异性/亲和性中起重要作用。因而本发明的另一方面涉及施用抗TNFoc抗体治疗失调的方法，其中施用人抗体方法是皮下施用，该抗体与hTNFcc结合的解离动力学常数低，其重链和轻链CDR3结构域在结构上与D2E7—致或相关。D犯7VLCDR3区的第9位可以是丙氨酸或苏氨酸，这基本上不影响其K。ff值。相应地，D2E7VLCDR3区的共有基元包含Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQIDNO:3)的氨基酸序列。另外D2E7VHCDR3区的第12位可以是酪氨酸或天冬酰胺，这基本上不影响K。ff值。相应地，D2E7VHCDR3区的共有基元包含V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/NXSEQIDNO:4)的氨基酸序列。而且，如实施例2所证实的，D2E7抗体的轻和重链CDR3结枸域，用单个丙氨酸替代(在VL的CDR3区位置1,4,5,7或8或在VH的CDR3区位置2,3,4,5,6，8,9,10或11替换)，基本上并不影响K。ff。进而，本领域的技术人员将意识到既然D2E7抗体VH和VLCDR3结构域的氨基酸可以用丙氨酸替代，那么在保留抗体低解离常数的前提下，CDR3区内的其它氨基酸的替代也是可能的，尤其是用保守的氨基酸替代。本文所用的"保守氨基酸替代"，是指某一氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基所替代。本领域的具有相似侧链的氨基酸残基家族已经确定，包括石威性侧链(如，赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，酸性侧链(如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷极性侧链(如甘氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，非极性侧链(如丙氨酸，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)以及芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸，色氨酸和组氨酸)。D2E7VL和/或VHCDR3区内的保守替代优选不超过1~5个；D2E7VL和/或VHCDR3结构域内的保守替代进一步优选不超过1~3个。另外，保守氨基酸的替代不应在与hTNFa结合的关键位置上，D2E7抗体VL的CDR3区的第2和5位的氨基酸和VH的CDR3区的第1和7位的氨基酸似乎对抗体与hTNFa的相互作用很重要，因此优选这些位置的保守氨基酸不被替代(虽然在D2E7抗体VLCDR3第5位氨基酸用丙氨酸替代也可以接受，如上所述)(参见美国专利No.6090382)。相应地，在另一实施方案中，'本发明提供了治疗失调的方法，其通过每两周皮下施用一次分离的人抗体或其的抗原结合部分而进行。抗体或其抗原结合部分优选包含下列特征a)与人TNFoc的解离常数K。ff为1xi0'V秒或更小，由表面等离子共振测定。b)其轻链CDR3.结构蜂包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或用丙氨酸'在l,4,5,7或8替代犯QIDNO:3的氨基酸序列后的修饰，列或在1,3,4,6,7,8和/或9位置上举行，1~5个保守氨基酸替代修饰的序列。c)重链CDR3结构域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，或用丙氨酸在2,3,4,5,6,8,9,10或11替代SEQIDNO:4的氨基酸序列后的修饰序列或在2,3,4,5,6,8,9,10,11或12位置上进行1~5个保守氨基酸替代修饰的序列。更优选的抗体或抗体的抗原结合部分与人TNFa解离K。ff值为5xl(TV秒或更小；进一步优选抗体或抗体的抗原结合部分与人TNFa解离K。ff值为.1x10-V秒或更小。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗失调的方法，通过每两周皮下施用一次分离的人抗体或其的抗原结合部分而进行治疗。'抗体或抗原结合部分，优选其轻链可变区(LCVR)CDR3结构域包含SEQIDNO:3的氨基酸序'列，或用丙氨酸在l,4,5,7或8替代SEQIDNO:3的氨基酸序列后的修饰序列，优选其重链可变区(HCVR)CDR3结构域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，或用丙氨酸在2，3,4,5,6,8,9,10或11替代SEQIDNO:4的氨基酸序列修饰序列。优选LCVR进一步包含一个CDR2区，该区包含SEQIDNO:5的氨基酸序列(即D2E7抗体的VL中的CDR2区)以及HCVR进一步包含CDR2区，该区包含SEQ.IPNO:6的氨基酸序列(即D2B7抗体的VH中的CDR2区〗。再进一步优选LCVR进一步包含一个CDR1区，该区包含SEQIDNO:7的氨基酸序列(即'D2B7抗体的VL中的CDR1区)以.及HCVR进一步包含一个CDR1区，该区包含SEQIDNO:S的氨基酸序列(即D2E7抗体的VH中的CDR1区)。VL区的框架区优选来自VkI人种系家族，更优选来自A20人抗体产生种系家族Vk基因，最优选美国专利No.6090382中图1A和IB中所示的D2E7的VL框架区序列。VH区的框架区优选来自Vtf人抗体产生细胞族，更优选.来自人抗体产生细胞DP31的VH基因，最优选美国专利No.6090382中图2A和2B中所示的D2E7的VH框架区序列。本发明的再一个实施方案中提供了治疗失调的方法，通过每两周皮下施用一次分离的人抗体或其的抗原结合部分而进行治疗。抗体或抗原结合部分，优选其轻链可变区(LCVR)包含SEQIDNO:]的氨基酸序列(即D2E7VL),优选其重链可变区(HCVR)包含SEQIDNO:2的氨基S吏序列(即D2E7VH)。在某些实施方案中，抗体包含重链的恒定区，如IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE,IgM或IgD的恒定区；重链恒定区优选IgGl或IgG4的重链恒定区，而且抗体包含轻链恒定区，无论是K链还是人链的恒定区。优选地，抗体包含ic轻链恒定区。另外，抗体部分可以是例如Fab片段或是单链Fv片段。在另外的实施方案中，本发明提供了治疗失调的方法，通过每两周皮下施用一次分离的人抗体或其的抗原结合部分而进行治疗。抗体或其抗原结合部分优选包含D2E7相关的VL和VH的CDR3结构域，例如下列的抗体或抗原结合部分，其中轻链可变区(LCVR)具有CDR3结构域，其包含的氨基酸序列选自SEQIDNO:3，SEQIDNO:11,SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16，SEQIDNO:17，SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20，SEQIDNO:21,SEQIDNO:22，SEQIDNO:23,SEQIDNO:24，SEQIDNO:25和SEQIDNO:26,或重链可变区(HCVR)具有CDR3结构域，其包含的氨基酸序列选自SEQIDNO:4，SEQIDNO:27,SEQIDNO:28，SEQIDNO:29，SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34和SEQIDNO:35。(如另一个肽或蛋白)。相应地，被发明的抗体或抗体部分包含本文所述的人抗hTNFoc抗体的衍生物或其它修饰体，包括免疫粘附分子。比如，本发明的抗体或抗体部分可以有效地结合(通过化学偶联、基因融合以及非共价连接等)到一个或多个其它的分子实体上，如另一种抗体(如双幹异性抗体或diabody)、检测试剂、细胞毒性试剂、药物和/或蛋白或肽上，其中蛋白或肽能够介导抗体或抗体部分与另一种分子(如链霉抗生物素核心区或多聚组氨酸标记)相连接。异性抗体)可荻得一种衍生抗体。适于交连的物质包括那些具有异质双官能，具有两个不同的反应基团并被合适的间隔物分开的物质(如m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimideester)或同质双官能基团(3口disuccinimidylsuberate)。这些连接物可从PierceChemicalCompany,Rockford,IL公司获得(pl4-36)。能够与本发明抗体或抗体部分连接的可检测试剂包括焚光化合物。代表性的荧光检测试剂包括荧光素、异硫氰荧光素，若丹明、5-二甲胺-l-萘磺酰氯，藻红蛋白等。抗体也可以与4企测性的酶生成衍生物，如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等。当抗体与可检测性的酶生成衍生物时，可以通过添加另外一种酶能够利用而产生可检测反应产物的试剂而进行检测。比>,当存在辣才艮过氧化物酶检测试剂时，加入过氧化氢和联苯胺就可产生可^:测的颜色反应。抗体也可以和生物素生成4汙生物，然后通过间-接地才佥测亲和素或链亲和素来检测。II.抗体表达本发明的抗体或抗体部分能够通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白的轻链和重链而制备。为了表达重组抗体，用一个或多个携带编码免疫球蛋白抗体轻链和重链的DNA片段的表达载体转染宿主细胞，这样在宿主细胞中就可以表达轻链和重链，优选的宿主细胞能够分泌表达物至培养细胞的培养基，从而可以回收培养基而制备抗体。正如Sambrrok,Fritsch和Maniatis编著的分子克隆实'验室操:作手册，第二版，冷泉港，纽约(19S9);AusubelF.M.等编箸的分子生物学操作程序，Greene出版社(1989)以及Boss等的美国专利No.4816397中所描述的，标准的重組DNA技术可用于获得抗体的轻链和重链基因，然后将这些基因克隆入重组表达载体，介导这些载体进入宿主细胞。为了表达D2E7或D2E7相关的抗体，首先需要获得编码轻链和重链的可变区DNA片段。这些DNA片段可以通过聚合酶链反应(PCR)扩增和修饰抗体生产细胞的轻链和重链可变区而获得。本领域中，扩增人轻链和重链可变区基因的种系DNA序列是众所周知的(参见"Vbase，，人germline序列数据库；参见KabatEA等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest第五版,USDepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242;Tomli励nI.M.等(1992)"theRepertoireofHumanGermlineVHSequencesRevealsaboutFiftyGroupsofVHSegmentswithDifferentHypervariableLoops"J.Mol.Biol.227:776-798;以及Cox.J.P丄.等(1994)"ADirectoryofHumanGermliiieV78SegmentsRevealsaStrongBiasintheirUsage"Eur.J.Immunol.24:827-836;这些文献内容在本文中引入作为参考)。为了获得编码D2E7或D2E7相关抗体重链的DNA片段，可用标准PCR方法从人种系VH基因中VH3家族中的一员扩增。最优选扩增DP-31VH种系序列。为获得编码D2E7或D2E7相关抗体轻链的DNA片段，可用标准PCR方法从人种系细胞VL基因中VkI家族中的一员扩增。最优选扩增A20VL种系基因。基于上述文献所揭示的核酸序列，用标准的方法设计扩增DP-31VH和A20VL序歹'j的PCR引物。一旦获得了种系VH和VL片段，可以突变成本文所述的编码D2E7或D2E7相关的氨基酸序列。首先比较种系VH或VLDNA编码的氨基酸序列和D2E7或D2E7相关VH和VL的氨基酸序列，找出与D2E7或D2E7相关抗体序列不同的氨基酸，然后根椐基因密码子确定需突变的核酸.，适当的突变获得的DNA序列而获得突变的种系序列，该序列编码D2E7或D2E7相关抗体的氨基酸。种系序列突变由标准的方法完成，如PCR介导的突变(其中突变的核酸置于PCR引物中，这样PCR产物就包含了突变)或定点突变。一旦荻得了编码D2E7或D2E7相关抗体的DNA片段(如上所述，通过抗体生产细胞的VH和VL扩增和修饰获得)，可以进一步通过标准重组DNA技术操作这些DNA片段，比如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL和VH的DNA片段可操作性连接至编码另一种蛋白的DNA片段上，如抗'体的恒定区或一个柔性接头上。在此意义上，"可操作性连接"一词，是指两个DNA片段连接使得两段DNA编码的氨基酸序列保持在框架中。分离的编码VH区的DNA可以转化成全长的重链基因，方法是可操作性地连接编码VH的DNA至另一个编码重链恒定区(CH1,CH2和CH3)的DNA分子。人重链恒定区的序列在本领域是已知的(参见KabatEA等(1991)SequencesofProteinsofIrnnmno〗ogicalInterest第五版，USDepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242),而且包含这些区域的DNA片段可以通过标准的PCR扩增方法获得。重链恒定区可以是IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgA,IgE,IgM或IgD的恒定区，但最优选的是IgGl或1gG4的恒定区。对Fab片段的重链基因，编码VH的DNA可操作性的连接至另一仅编码重链CH1恒定区的DNA分子上。分离的编码VL区的DNA可以转化成全长的轻链基因(和Fab轻链基因)，方法是可操作性的连接编码VLDNA至另一个编码轻链恒定区CLDNA分子。人轻链恒定区序列在本领域是已知的(参见KabatEA等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest第五版,USDepartmentofHealthandHumanServices,NTHPublicationNo.91-3242)，而且包含这些区域的DNA片段可以通过标准的PCR扩增方法获得。轻链恒定区可以是K链或人链恒定区，但最优选的是K链的恒定区。为构建scFv基因，可将编码VH和VL的DNA片段可操作性连接至编码一柔性接头的片段上，如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3,这样VH和VL就可以表达成一条连续的单链蛋白，其中VL和VH区被柔性接头连接在一起(参见Bird等(1988)Science242:423-426;Huston等(1988)ProcNatlAcadSciUSA85:5879-5883;McCafferty等Nature(19卯)3復552-554)。为表达本发明的抗体或抗体部分，如上述获得的编码部分或全部轻链和重链的DNA,可以插入表达载体，这样基因就被可操作性的连接至转录和翻译调控基因。在本文中，"可操作性连接"表达的意思是抗体基因连接至载体后，载体中转录和翻译调控基因就能够如同设计的功能一样调节抗体基因的转录和翻译，选择的载体和表达调控序列需与宿主细胞相容。抗体的轻链基因和重链基因可插入独立的载体，或更为普遍的是将两段基因插入同一表达载体。抗体基因可用标准方法插入表达载体(如连接抗体基因片段和载体上互补的酶切位点，或如果没有限制性酶切位点时用钝端连接)。在D2E7或D2E7相关的轻链和重链序列插入之前，表达载体可已经携带有抗体的恒定区基因序列。比如，一种转化D2E7或D2E7相关VH和VL序列为全长抗体基因的方法是将它们分別插入至含编码轻链和重链恒定区的表达载体中，这样VH片段就可操作性的连接至载体内CH片段上，而VL片段就可操作性的连接至载体内CL片段上。另外的或可选择性的做法是重组表达载体可编码信号肽，这样利于宿主细胞分泌抗体链。'抗体链基因可被克隆入载体，就使信号肽与抗体链基因连接并保持了氨基酸读码框架不变。信号肽可以使免疫球蛋白的信号肽或异源的信号肽(即源于非免疫球蛋白的蛋白信号肽)。除抗体链基因外，本发明重组表达载体携带调控序列，能够调节抗体链在宿主细胞中的表达。"调控序列"包括启动子、增强子和其它表达控制元件(如多聚腺甘酸信号)，这些序列控制抗体基因的转录或翻译。这些调控序列在i午多文献中有详述，比如在Goeddel所著的GeneExpressionTechnology:MethodsInEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)。本领域的技术人员可以理解表达载体的设计，包括调控序列的选择，取决于如要转化的宿主细胞、欲表达的蛋白表达状况等。优选的调控哺乳动物细胞表达的序列包括能够指导蛋白在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，如源于巨细胞病毒(如CMV的启动子/增强子)，猴病毒40(SV40)(^。SVM启动子/增强子)，腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。关于病毒调控元件的详尽描述以及序列，参见Stinski的美国专利No.5168062,Bell的美国专利No.4510245以及Schaffner等的美国专利No.49686"。除抗体链基因和调控序列外，本发明的重组病毒载体可携带其它的序列，如调控载体在宿主细胞中复制的序列(如复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因利于将转入载体的宿主细胞筛选出来(参见Axel等的美国专利No.4399216、4634665和5179017)。比如，通常的选择性标记基因'赋予转入载体的细胞以药物抗性，如抗G4i8、潮霉素和氨甲蝶呤抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(将氨甲蝶呤用于筛选和扩增培养dhfr-的宿主细胞)以及neo基因(用于G418筛选)。为了表达轻链和重链，用标准技术可将编码轻链和重链的表达载体转染一种宿主细胞。术语"转染"的不同形式包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的广泛技术，如电穿孔、磷酸钧沉淀、DEAE-右旋糖苷转染等。虽然理i仑上无论原核还是真核细胞都可能表达本发明的抗体，但最优选的是真核细胞表达抗体，尤其优选哺乳动向于组装和分泌出正确折叠的、有克疫学活性的抗体。有研究报告称抗体基因的原核病毒不能有效制备高产的活性抗体(BossMA和WoodCR(1995)ImmunologyToday6:12-13)。优选的表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(包括dhfr-CHO细胞，在Urlaub和Chasin(1980)ProcNatlAcadSciUSA77:4216-4220中有说明，用DHFR筛选标志，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)MolBio159:601-621),NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体转入哺乳动物宿主细胞后，将其培养一段时间使抗体在宿主细胞中表达而获得抗体，最优选的是细胞将抗体分泌至培养细胞的培养基中。然后用标准的蛋白纯化方法从培养基中回收。宿主细月包可用于生产完整抗体的部分，如Fab片^殳或scFv分子。可以理解上述方法的任何变通都包括在本发明的范围之内。比如，可能需要用编码本发明轻链或重链的DNA(但不是两个)转染一宿主细胞。重组DNA技术也可用于去除部分或全部的编码轻链和重链中对结合TNFoc不是必需的DNA。从这样剪切后的DNA分子表达的分子也包括在本发明抗体范畴。另外，通过标准的化学交连方法将本发明的抗体与第二种抗体交连而生产出双功能抗体，其中一条轻链和一条重链是本发明的抗体，另一条轻链和另一条重链是特异性结合另一种抗原而非hTNFa的抗体。在优选的表达本发明抗体或抗原结合部分的重组表达系统中，编码抗体轻、'重链的重组表达载体用磷酸钙介导的转染方法转入dhfr-CHO细胞中，重组表达载体中抗体轻链和重链基因可操作性的连接至CMV增强子/AdMLP启动子等调控元件，以使基因的转录水平提高。重组表达载体同时也携带DHFR基因，可以用氨甲蝶呤筛选/扩增转染了载体的宿主细胞。然后培养筛选出的宿主细胞，让其表达抗体的轻链和重链并从培养基中回收完整的抗体。标准的分子生物学技术用于制备重組表达载体，转染宿主细胞，婶选转染细胞，培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体in.重组人抗体的选择除D2E7或其抗原结合部分或本文所述的D2E7相关抗体外的重组人抗体，可以通过筛选重组联合抗体文库而分离，优选scFv嗟菌体展示文库，该文库是用源于人淋巴细胞mRNA制备的VL和VHcDNA构建的。本领域内，制备和篩选这类文库的方法是已知的(如thePharmaciaRecombinantPhageAntibodySystem,catalogno.27-9400-01"以及theStratageneSurfZAPphagedisplaykit,catalogno.240612)。从下列文献中可以找出确实可行的制备和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例，如Ladner等的美国专利No.5223409;Kang等的PCT出版物W092/18619;Dower等的PCT出版物W091/17271;Winter等的PCT出版物WO92/20791;Markland等的PCT出版物WO92/15679;Breitling等的PCT出版物WO93/01288;MaCafferty等的PCT出版物WO92/0〗047;Garrard等的PCT出版物WO92/09690;Fuchs等(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay等(1992)HumAntibodHydridoma3:81-85;Huse等(1989)Science246:1275-1281;McCafferty等Nature(19卯)348:552-554;Griffins等(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkins等(1992)J.MolBiol226:889-896;Clackson等(1991)Nature352:624-628;Gram等(1992)PNAS89:3576-3580;Garrard等(1991)Bio/Tedmology9:1373-1377;Hoogenboom等(1991)NucAcidRes19:4133-4137;以及Barbas等(1991)PNAS88:7978-7982。在一优选实施方案中，为了分离具有高亲和力以及低解离常数的与hTNFoc结合的人抗体，首先施用具有高亲和力以及低解离常数的、与hTNFa结合的鼠抗hTNFa抗体(如MAK195杂交瘤，其保藏号为ECACC87050801)筛选具有相似结合hTNFa活性的人轻链和重链序列，所用方法为Hoogenboom等的PCT出版物WO93/06213中所述的表位印迹方法，该方法中所用文库优选scFv文库，文库的制备与筛选参见McCafferty等的PCT出版物WO92/01047,McCafferty等Nature34S:552-554;以及Griffiths等(1993)EMBOJ12:725-734。优选用重组人TNFoc作为抗原筛选scFv抗体文库。一旦筛选出人VH和VL片段，可以进行"混合和匹配"实验，即将选出的不同对的VL和VH片段用于筛选其与hTNFcc的结合，筛选出优化的VL/VH对。此外，为进一步提高亲和力和/或降低从hTNFcc的解离常数，可对优选出的VL/VH对的VL和VH片段进行随机突变，优选在VH和/或VL区的CDR3区突变，其过程类似于体内体细胞突变过程，该过程对应于天然免疫反应中抗体亲和力的突变。体外亲和力突变可以用分別与VHCDR3和/或VLCDR3互补的PCR引物来扩增VH和VL区而实现，其中在引物的某位置嵌入随机的四核甘酸，这样获得的编码VH和VL的CDR3区的PCR产物中就引入了随机突变。这些随机突变的VH和VL片段再用于hTNFa结合的筛选，选出具有高亲和力以及低解离常数的与hTNFa结合的序列。从重组的免疫球蛋白展杀文库中篩选、分离出本发明的抗hTNFa抗体后，从噬菌体包装体(如，从噬菌体基因组)中回收编码选出的抗体核酸序列，然后亚克隆入其它的表达载体，方法为标准重组DNA技术。如果愿意，可对该核酸可以进一步^^喿作，以转化成本发明的其它的抗体形式(如与编码克疫球蛋白的其它结构域的核酸连接，比如恒定区)。为了表达从联合文库中筛选的重组人抗体，可将编码抗体的基因克隆入重组表达载体，然后转入哺乳动物宿主细胞，这在上面第二部分中已详细论述过了。IV.药物组合物和药物施用本发明的抗体和抗体部分可以配伍至给受试者施用的药物组合物中，适合的方法为本文所述，如每两周皮下定量施用。通常，药物纽合物包含本发明的抗体(或抗体部分)和/或氨甲蝶呤以及药学上接受的载体。本文所用的"药学上可接受的载体"包招^壬意和全部的溶剂、分散介质、包衣、抗生素与抗真菌药物、等渗和吸收援释药物等，这些物质是生理学上相容的、适用于本文所述的给受试者的用药方法。药学上可接受的载体实例包括水、盐水、磷酸盐緩冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等的一种或多种，以及这些物质联用。多数情况下，组合物中优选施用的物质包括等渗试剂，如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的载体实例可能进一步包含少量的附加物质，如增湿或乳化试剂、保护剂或緩冲液，这些物质可以提高抗体或抗体部分的保存限期或有效性。本发明的组合物可以多种形式出现，包括比如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(注射和输注溶液)，分散剂或悬液，片剂，丸剂，粉剂，脂质体以及栓剂。优选的形式因施用组合物的预想模式而定。优选的组合物是注射和输注溶液形式，如类似于用其他抗体^皮动克疫人时所用的组合物。用药的优选方式是胃肠外方式(如静脉注射，皮下注射、腹膜注射、肌肉注射)。优选实施方案中，通过静脉注射和输注方式施用抗体。在另一优选实施方案中，通过肌肉注射方式施用抗体。在特别优选实施方案中，通过皮下注射方式施用抗体(如每两周皮下注射方式用药一次)。治疗组合物在制造和存储时，通常必须是无菌而且稳定的。这些组合物可以配制成溶液、微乳化剂、分散剂、脂质体或其它适于高浓度施用的预定结构。无菌注射溶液可通过将活性化合物(抗体或抗体部分)以所需的浓度在合适的溶剂中溶解后，与需要的其它联用组分的一种或多种配伍，然后过滤除菌。通常，分散药剂是通过将活性组分与无茵的载体配伍后制备，载体包含基本的分散基质和其它所需的乳化组分。制备无菌注射溶液用的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，以获得含有活性的组分以及前述的过滤的添加组分。溶液适当的流动性可以通过使用，如卵磷脂等的包衣，或使用分散剂维持所需的颗粒大小或通过使用表面活性剂等维持。延援注射组分的吸收可以通过在组分中添加延緩吸收的制剂，比如单石更脂酸盐和凝胶。尽管对于多数治疗应用而言，优选的途径/模式是皮下注射，但本发明抗体和抗体部分的许多施用方法在本领域内都是已知的。如本领域内技术人员理解的一样，用药途径和/或模式取决于想要的结杲。在某些实施方案中，活性组分与载体制备在一起，载体将阻止化合物的快速释放，包括比如植入、皮肤贴剂以及微胶嚢用药等可控释放制剂。生物降解性的、生物兼容性的多聚体，如乙烯乙酸乙烯酯，聚乙二醇(PEG)，聚酐，聚雍乙酸，胶原，polyorthoesters和聚乳酸等都可使用。许多制备这些制剂的方法已经申请专利或对本领域的技术人员而言是已^p的。参见Sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems,J.R.Robinson编箸,MarcelDekker,Inc.，NewYork,1978。在某些实施方案中，本发明抗体或抗体部分可以口服，如与无活性的稀释液或可同化、消化的载体一起。化合物(和其它需要的组分)也可以包在硬或软的胶嚢壳中，压縮在片剂中或配伍至受试者饮食中。为了口服治疗，化合物可以掺入赋形剂，而且以可消化的片剂、咀嚼片、片剂、胶嚢、药液、悬浮液、糖浆、薄膜等方式施用。为了在消化道应用，可以用其它物质包裹本发明的化合物或共用施用，以免其失活。附加的活性化合物也可以配制进该组合物中。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分与一种或多种附加治疗药物配伍或共同施用。比如，本发明的抗体或抗体部分可以与氨甲蝶呤配伍或共同施用，可以与一种或多种结合其它抗原的抗体(如，与细胞因子或细胞表面分子结合的抗体)，一种或多种细胞因子，可溶性TNFoc受体(参见PCT出版物WO93/06476)和/或一种或多种抑制hTNFa产生或其活性的化学物质(如PCT出版物WO93/197501cyclohexaneylidene的衍生物)。再者，本发明的一种或多种抗体可以与前述的两种或两种以上的治疗剂施用。这类联合治疗便于施用小剂量的治疗剂，因而避免了可能的毒性或与不同的单治疗剂施用带来的相关问题。本发明抗体或抗体部分与其它治疗药物的联用将在第IV部分中进一步详细讨论。可以与本发明抗体或抗体部分联用的、治疗类风湿性关节炎的药物非限制性实例包括非类固醇抗炎性药物(NSAIDs);细胞因子抑制性抗炎性药物(CSAIDs);CDP-571/BAY-10-3356(人源化的抗TNFot抗体；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFcx抗体；Centocor);75kdTNFR-IgG(7'5kd的TNF受体-IgG融合蛋白；ImmuneK:;参见Arthritis&Rheumatism(1994)Vol.37,S295;J.InvestMed.(1996)vo1.44,235A);55kdTNFR-IgG(55kd的TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche);IDEC-CE9.1/SB210396(非消耗性灵长化抗CD4抗体；IDEC/Smith幻ine;参见Arthritis&Rheumatism(1995)Vol.38,S185);DAB486-IL-2和/或DAB389陽IL-2(IL2融合蛋白；Seragen;参见Arthritis&Rheumatism(1993)Vol.36,1223);Anti-tac(人源化抗IL-2Rot;ProteinDesignLabs/Roche);IL-4(才元炎性因子；DNAX/Schermg);IL-10(SCH52000;重组IL10,抗炎性因子；DNAX/Schermg);化-4;IL-10和/或IL-4激动剂(如激动抗体)；IL-1RA(IL-1受体拮抗剂；Synergen/Amgen);TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白；参见Arthritis&Rheumatism(〗996)vol.39，No.9(supplement),S284;Amer.丄Physiol.-HeartandCirculatoryPhysiology(1995)vol268，pp37-42;R974301(IV型磷酸二酯酶抑制剂；参见Arthritis&Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S282);MK-966(C〇X-2抑制齐'j;参见Arthritis&Rheumatism(1996)vol39,No.9(supplement)，S81);IIoprost(参见Arthritis&Rheumatism(1996)voD9，No.9(suppIement),S82);氨甲蝶呤；酞胺哌p定酮(参见Arthritis&Rheumatism(1996)vol.39，No.9(supplement),S282)和狀胺口底口定g同相关药物(例如Celgen);leflunomide(抗炎性和细胞因子抑制剂；参见Arthritis&Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement)，S131;InflammationResearch(1996)vol.45,pp.103-107);氨甲环酸(纤'溶酶原激活抑制剂，参见Arthritis&Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S284);T-614(细胞因子抑制剂；参见Arthritis.&Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S282);前列腺素El(参见Arthritis&Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S282);Tenidap(非类固醇类抗炎药，参见Arthritis&Rheumatism(1996)vol.39,No.9(s叩plement),S280);Naproxen(非类固醇类抗炎药；参见NeuroReport(1996)vol.7,pp.1209-1213);美洛昔康(非类固醇类抗炎药)；布洛芬(非类固醇类抗炎药)；吡罗昔康(非类固醇类抗炎药)；二氯芬酸(非类固醇类抗炎药)；indomethacin(非类固醇类抗炎药)；水杨酸偶氮磺胺吡梵(参见Arthritis&Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S28j);硫唑嘌呤(参见Arthritis&Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement)，S281);ICE抑制剂(白介素1p转化酶抑制剂)；zap-70和/或lck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或lck抑制剂)；VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂(血管内皮细胞生长因子抑制剂或血管内皮细胞生长因子受体；血管生成抑制剂)；类皮质酮抗炎性药物(例如SB203580);TNF蛋白转化酶抑制剂；抗白介素2抗体；白介素11(参见Arthritis&Rheumatism(1996)vol.39,No.9(supplement),S296);白介素13(参见Arthritis&Rheumatism(1996)vol.39,No.9(suppIement),S308);白介素〗7(参见Arthritis&Rheumatism(1996)vol.39,No.9(s卿Iement),S120);gold;青霉胺；氯奎；羟氯喹；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；环孢霉素；全身淋巴放射治疗药物；抗胸腺细胞球蛋白；抗CD4抗体；CD5-毒素；口服肽和胶原蛋白；氯苯扎利二钠；细胞因子调控药物(CRAs)HP228和HP466(HoughtenPharmaceuticals/>司)；ICAM-1二疏代磷酸酯的反义寡聚脱氧核酸(ISIS2302;Isis医药厶、司)；可溶性补体受体1(TP10;T细胞科学公司)；泼尼松；奥古蛋白；硫酸葡糖胺聚糖；美满霉素；抗白介素2受体抗体；海产品和植物脂类(鱼和植物种子脂脉酸；参见Deluca等(1995)Rheum.Dis.Clin.NorthAm.21:759-777);金诺芬；保泰松；甲氯芬那酸；氟奋那酸；静脉用免疫球蛋白；齐留通；麦考酚酸(RS-61443);tacroHmus(FK-56);西罗莫司(雷怕霉素)；氨普立糖(therafectin);克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷)和阿扎立平。可以与本发明抗体或抗体部分联用的、治疗炎性肠道疾病的药物的非限制性实例包括budenoside;表皮生长因子；类皮质酮；环孢菌素，水杨酸偶氮磺胺吡啶；氨基水杨酸盐；巯基嘌呤；硫唑p票呤；metronidazole;脂加氧酶抑制剂；氨基水扬酸；奥沙拉秦；巴柳氮；抗氧化剂；血栓素抑制剂；白介素1受体拮抗剂；抗白介素1p单抗；抗白介素6单抗；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶-咪唑化合物；CDP-571/BAY-10-3356(人源化的抗TNFoc抗体；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFcc抗体;Centocor);75kdTNFR-IgG(75kd的TKF受体-IgG融合蛋白；Immunex;参见Arthritis&Rheumatism(1994)Vol.37,S295;J.Invest.Med.(1996)vo,44235A);55kdTNFR-IgG(55kd的TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)IL-10(SCH52000;ScheringPlough);IL-4;IL-10和/或IL-4激动剂(如激动抗体);白介素ll;葡糖芬酸或葡聚糖连接的泼尼松龙，地塞米松或布德松前药；ICAM-1二硫代磷酸酯的反义寡聚脱氧核酸(ISIS2302;Isis医药公司)；可溶性补体受体1(TP10;T细胞科学公司)；緩释氨基水杨酸；氨曱蝶呤；血小板活化因子(PAF)拮抗剂；环丙沙星和利诺卡因。可以与本发明抗体或抗体部分联用的、治疗多发性硬化病的药物的非限制性实例包括类皮质酮；脱氢皮质醇；甲基脱氬皮质醇；咪唑硫噤呤；环磷酰胺；环孢菌素；氨甲蝶呤，4-氨基吡啶；替托尼定；干扰素-(3la(Avonex;Biogen);干扰素3〗b(BetaseronTM;Chiron/Berlex);共聚物l(Cop-l;Copaxone;TevaPharmaceuticalIndustries,Inc.);高压氧法；静脉用免疫球蛋白；clabribine;CDP-571/BAY-〗0-3356(人源化的抗TNFoc抗体；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFcc抗体；Centocor);75kdTNFR-IgG(75kd的TNF受体-IgG融合蛋白；Immunex;参见Arthritis&Rheumatism(1994)Vol.37,S295;J.Invest.Med.(1996)vol44235A);55kdTNFR-IgG(55kd的TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche);IL-10;IL-4;IL-10和/或IL-4激动剂(:^激动抗体)。可以与本发明抗体或抗体部分联用的、治疗败血病的药物的非限制性实例包括高渗盐溶液；抗生素；静月永用y免疫球蛋白；连续血液滤过；K青霉烯(如米诺配能)；如TNFcc、IL-1p、IL6和/或IL8细胞因子的拮抗剂；CDP-571/BAY-10-3356(人源化的抗TNFa抗体；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFcc抗体；Centocor);75kdTNFR-IgG(75kd的TNF受体-IgG融合蛋白；Immunex;参见Arthritis&Rheumatism(1994)Vol.37，S295;J.Invest.Med.(1996)vol.44,235A);55kdTNFR-IgG(55kd的TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche);细胞因子调控药物(CRAs)HP228和HP466(HoughtenPharmaceuticals公司)；SK&F107647(小分子肽；SmithKlineBeecham);四价丙咪腙CNI-1493(PicowerInstitute);组织因子途径抑制剂(TFPI;Chiron);PHP(化学修饰的血色素；APEXBioscience);铁鳌合剂和鳌合物，包括二乙撑三胺五乙酸-铁(III)复合物(DTPA铁(III);MolichemMedicmes);利索茶碱(合成的小'分子甲基黄嘌p令；CellTherapeutics公司)；PGG-葡聚糖(水溶性的卩1,3葡聚糖；Alpha-Beta技术公司)；载脂的载脂蛋白A-l;手性异羟肟酸(合成的能够抑制脂质A生物合成的抗菌素)；抗内毒素抗体；E5"l(合成的脂质A拮抗剂；EisaiAmenca公司)；rBPI^(重组的人杀菌/渗透性增强蛋白的N末端片段)；以及合成的抗内毒素肽(SAEP;BiosYnth研究实验室)。可以与本发明抗体或抗体部分联用的、治疗成人呼吸窘迫综合征的药物的非限制性实例包括抗IL-8抗体；表面活性剂替代疗法；CDP-571/BAY-10-3356(人源化的抗TNFct抗体；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFcx抗体；Centocor);75kdTNFR-IgG(75kd的TNF受体-IgG融合蛋白；Immunex;参见Arthritis&Rheumatism(1994)Vol.37,S295;J.I腦st.Med.(1996)vo1.44235A);55kdTNFR-IgG(55kd的TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)。本发明药物组合物包含"治疗有效量"或"预防有效量"的本发明抗体或抗体部分。"治疗有效量"是指在一定剂量和必需的一段时间下，有效地达到预期的治疗效果的量。抗体或抗体部分的治疗有效总量可#4居如疾病状态、年龄、性别或个体体重以及抗体或抗体部分在每个个体内诱导预期反应的能力等因素而不同。治疗有效量同时也是一种抗体或抗体部分治疗效果要大于其带来的任何毒性或有害性的剂量。"预防有效量，，是指在一定剂量和必需的一段时间下，有效地达到预期的预防效果的量。通常，由于预防用药是预先或在发病的早期给受试者用药，所以预防有效量低于治疗有效量。用药方案可以调整以达到最佳效果(如治疗或预防效果)。比如，一次大剂量用药、一段时间内分几次用药或根据治疗情形的紧迫程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制的胃肠外组合物施用方便、剂量统一，这是其最大的优点。本文所用的剂量单位形式是指不连续剂量，且该剂量是适于给哺乳动物受试者治疗用的单个剂量单位；每个单位含有预定量的活性化合物，与所需的药学载体一起，预计可以产生预期的治疗效果。本发明的剂量单位方式直接由下列因素确定和决定(a)活性化合物的特性，要达到的确切的治疗或预防效果；(b)化合物领域的内在限制，如一种活性化合物对每个个体治疗的敏感性。>'例如，本发明抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的非限制性范围是10100毫克，较优选的是20-80毫克，最优选的约40毫克。应当注意剂量值可随要緩解的病情类型以及严重程度变化而变化。对于确切的个体，在一段时间内按照个体需要以及施用药物的人或监督用药人的专业判断，用药方案应当调整，这都是应当能够理解的，本文提供的剂量范围仅是实例性的，并不是对所保护组合物的范围或应用的限制。V.本发明抗体的应用本发明抗hTNFoc抗体或其部分，具有结合hTNFa的活性，因此用常规的克疫学检测方法可检测hTNFa(如血清或血浆等生物样本中的)，所述免疫学检测方法如酶联免疫吸附检测法(ELISA)、放免检测(RIA)或免疫组织化学检测。本发明提供了4全测生物样本中hTNFa的hTNFoc结合的或不结合的抗体或抗体部分，进而检测生物样品中的hTNFa。抗体可以用可检测的底物直接或间4矣标记，利于^全测结合或未结合的抗体。可用的可检测底物包括各种酶、互补基团、焚光物质、发光物质和放射性物质。适用的酶的实例包括辣根过氧化物酶、-威性磷酸酶、P半乳糖苷酶或乙酰胆;威酯酶；适用的互补基团实例包括链亲和素/生物素和亲和素/生物素；适用的荧光物质实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的一个实例包括鲁米诺；适用的放射性物质包括1251、1311、"S或3H。除标记抗体外，生物体液中的hTNFa可以用竟争性免疫检测法检测，该方法使用标记了可检测物质的重组人TNFa作为标准和未标记的抗TNFa抗体。在该检测中，生物才羊品、标记的rhTNFa标准品和抗TNFoc抗体结合联用，测定结合至未标记抗体的、标记的rhTNFa的量，生物样品中的hTNFa的量与结合在抗TNFot抗体上的标记的TNFcc的量呈反比。本发明的D2E7抗体也可以用于检测来源于非人的其它种的TNFcc，尤其是来源于灵长类(如黑猩猩，狒狒，绒，猕猴和恒河猴)以及猪和鼠的TNFcc,因为D2E7能够与这些TNFcx结合。本发明的抗体和抗体部分能够在体内外中和hTNFa的活性(参见美国专利No.6090382)。而且至少本发明的某些抗体，如D2E7抗体，能够中和其它物种的hTNFcc。因此，本发明的抗体或抗体部分可用于抑制hTNFoc活性，如在含hTNFot的细胞培养物、以及具有与本发明抗体交叉反应的TKFa的人或其它哺乳动物(如黑猩猩，狒狒，绒，猕猴和恒河猴以及猪和鼠)中。在一个实施方案中，本发明提供了抑制TNFcc活性的方法，该方法包含施用本发明的抗体或抗体部分与TNFa作用，从而抑制TNFa活性。优选的TNFoc是人TNFa。例如，在含有或怀疑含有TNFcx的细胞培养物中，可将本发明的抗体或抗体部分加入培养液中以抑制其中hTNFa活性。在优选的实施方案中，本发明提供了治疗失调的方法，其中施用抗TNFot抗体是有益的，所述方法包括每两周给受试者皮下施用一次本发明的抗体或抗体部分，来治疗疾病。在特别优选的实施方案中，抗体的施用是按每两周皮下施用一次抗体。在另一个特别优选的实施方案中，施用氨甲蝶呤前，施用过程中和施用后，皮下施用抗体。优选的受试者是人。此外，受试者可以是表达与本发明的抗体交叉反应的TNFa的哺乳动物。受试者也可以是引入hTNFcc的哺乳动物(如施用hTNFa或表达hTNFa转基因的动物)。本发明的抗体为治疗目的而给人受试者施用(下面进一步讨论)。本发明的抗体也可为医治动物目的而给表达TNFa的非人哺乳动物(如灵长类、猪或鼠)施用，该动物表达的TNFa与所用抗体有交叉反应，或作为人类疾病的一种动物模型而施用。对于后者，这种动物模型对于评价本发明抗体的疗效是有用的(如测试施用剂量和时间)。本文所用的术语"一种失调，其中施用抗TNFoc抗体是有益的"包括下列疾病或其它失调，即该病患者体内的TNFa的存在是或怀疑是该病病理学的发病原因或对该病恶化起作用，或者已有证据表明另一种抗TNFoc抗体或其抗体部分成功用于治疗该疾病。因此，由于TNFa活性有害致病的一种疾病，是一种可通过抑制TNFcx活性预期能够緩解该病症状和/或进牙呈的疾病。这类疾病可^皮i正明，如，患这种疾病的患者个体的生物体液中的TNFcc'浓度增高(如患者的血清、血浆、滑液等的TNFcx浓度升高)，这一特点可以用如上所述的抗TNFa抗体检测。不少疾病中TNFa活性有害。下面将进一步讨论治疗特定疾病中的抗体或抗体部分的施用A.败血症定，这些生物学效应包含血压过低，心肌抑制，血管泄漏综合症，器官坏死，刺激有害的第二介质的释放和激活凝血过程(参见Tracey和Cerami等(1994)A腿RevMed45:491-503;Russell,D.和ThompsonR.C.等(1993)Curr.Opin.Biotech.4:714—721)。因此，本发明人抗体或抗体部分可用于治疗任何临床发病的败血症，包括感染性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒症和中毒性休克综合征。此外，为了治疗败血症，本发明的抗TNFcx抗体或抗体部分可以与一种或多种其它可进一步緩解败血症的治疗药物联用，这些药物如白介素1抑制剂(如PCT出版物W092/16221和W092/17583),细胞因子白介素6(参见PCT出版物WOW/in^)或血小板活化因子的拮抗剂(参见欧洲专利申请出版物EP374510)。另外，在优选的实施方案中，给患败血症的个体施用本发明的抗TNFoc抗体或抗体部分时，其血清或血浆IL6浓度达到500pg/ml以上，较优选的为1000pg/ml。B.自身免疫性疾病肿瘤坏死因子在各种自身免疫性疾病的病理学中起一定的作用。(参见Tracey和Cemmi,见上；ArendW.P.和DayerJ-M(1995)ArthRheum.38:151-160;FavaR.A.等(1993)ClinExpImmunol,94:261-266)。TNFoc也参与了糖尿病患者体内胰岛细胞死亡的启动以及调控胰岛素抗性(参见上述Tracey和Cerami;PCT出版物WO94/08609)。TNFcx也参与了多发性硬化症患者体内，对少突胶质细胞细胞毒性的介导和诱导炎症斑块(参见上述Tmcey和Cemmi)。嵌合抗体和人源化鼠抗hTNFa抗体已经通过了临床上治疗类风湿性关节炎的实验(参见ElliottM丄等(1994)Lancet344:1125—1127;ElliottM丄等(1994)Lancet344:1105-1110;RankinE.C.'等(1995)Br.J.Rheumatol.34:334-342)。那些与炎症有关的疾^病，包括类k湿性关节炎，类类风湿性脊推炎，骨关节炎，痛风性关节炎，多发性硬化症，自免性糖尿病，自免性色素层炎和肾病综合征。虽然对某种疾病，在炎症部位局部施用抗体或疡局部涂药，'、单独或与环。己;克亚基4生物联用ripc;出版物W093/19751所述)是有效的，但通常为系统用药。C.传染病在多种传染病观察到肿瘤坏死因子参与了介导的生物学效应。比如，TNFa与疟疾中脑部炎症和毛细血管血栓以及梗塞有关(参见上述Tracey和Cerami);TNFa也与脑膜炎中脑部炎症有关，包括血脑屏障障碍，触发感染性休克以及激活静脉栓塞(参见上述Tmcey和Cerami);TNFa也与获得性免疫缺陷综合症(AIDS)中的恶疾、激活病毒复制以及介导中枢神经系统损伤有关(参见上述Tracey和Cerami);因此，本发明的抗体或抗体部分可用于治疗的传染病，包括细菌性脑膜炎(参见欧洲专利申请出版物EP585705)，脑型疾，艾滋病和艾滋病相关复征(ARC)(参见欧洲专利申请出版物EP230574),以及移植后的巨细胞病毒感染(参见FietzeE等(l"4)Tmnsplanation58:675-80)。本发明的抗体或抗体部分也可用于緩解与传染病相关的症状，包括感染(如流感)所致的发热和肌痛以及感染后的恶疾(AIDS或ARC后继发的)D.移植肿瘤坏死因子是同种移植排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)的关键因素，并且介导一种有害反应，这种反应在施用直接与T细胞受体CD3结合的大鼠抗体0KT3可抑制肾移植排斥反应中观察到(参见上迷Tracey和Cemmi;Eason,J.D.等(1995)Transplanation59:300-305;SuthanthiranM.和StromT.B.(1994)NewEngl.J.Med.331:365-7"。因此，本发明的抗体或抗体部分可用于抑制移植排斥，包括同种异体移植排斥和异种移植排斥以及抑制GVHD。虽然本发明的抗体或抗体部分可以单独施用,但优选与一种或多种能够抑制同种异体移植排斥或抑制GVHD的药物联用。比如，在某一实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可以与0KT3联用，抑制OKT3诱导的反应。在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗体部分与一种或多种抗体联表面分子CD25(白介素2受体-oc),CDlla(LFA-l),CD54(ICAM-1)，CD4,CD45,CD28/CTLA4,CD80(B7-l)和/或CD86(B7-2)。在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗体部分与一种或多种通用的免疫抑制剂如环磷酰胺A或FK506联用。E.恶性肺瘤肿瘤坏死因子与恶性胂瘤所致的恶疾、刺激肿瘤生长、增强肿瘤转移可能性以及介导的恶性肿瘤细胞毒性有关(参见上述Tracey和Cemmi)。因此，本发明的抗体或抗体部分可用于恶性胂瘤治疗，抑制肿瘤生长或转移和/或緩解肿瘤后的恶疾。本发明的抗体或抗体部分可以系统施用或在肿瘤部^fi局部用药。F.肺病肺瘤坏死因子与成人呼吸窘迫综合征的病理学有关，包括白细胞-内皮细胞活化，导致对肺细胞的细胞毒性以及诱导血管泄漏综合症(参见上述Tracey和Cerami)。因而，本发明的抗体或抗体部分可用于治疗不同的肺病，包括成人呼吸窘迫综合征(参见PCT出版物W091/04054),肺休克，慢性肺炎，肺部肉状瘤病，肺纤維化和硅肺病。抗体或抗体部分可以系统施用和在肺部表面局部施用，如作为气溶剂施用。G.肠道疾病肿瘤坏死因子与炎性肠道疾病的病理学有关(参见Tracy,K.J.等(1986)Science234:470-474;SunX-M等(1998)J.Clin.Invest81:1328-1331;MacDonaldT.T.等(1990)Clin.Exp.Immunol.81:301-305)。嵌合的鼠抗TNFcx抗体已经通过治疗局限性肠炎临床实-验(vanDullemenH.M.等(1995)Gastroenterology109:129-135)。本发明的人抗TNFcx抗体或抗体部分也可用于治疗肠道疾病，如特发性肠道炎症，包括局限性肠炎和溃疡性结肠炎。H.心脏疾病缺血(参见欧洲专:申请出版物6;453898)和心;(心肌衰弱)(参见卩(:丁出版物WO94/20139)。I.其它疾病TNFcc的活性有害。这些疾病和失调的与TNFoc参与了疾病的病理学有关，因此可以应用本发明的抗体或抗体部分治疗，其实例包括炎性骨失调和骨吸收障碍(参见BertoliniD.R.等(1986)Nature319:516-518;KonigA.等(1998)J.BoneMiner,Res.3:621-627;Lerner,U.H.和OhlinA(1993)丄BoneMiner.Res.8:147-155;和ShankerG.和Stern,P.H.(1993)Bone14:871-876),肝炎，包括酒精性肝炎(参见McCIainC丄和CohenD.A.(1989)Hepatology9:349-351;FelverM.E.等(1990)Alcoho1.Clin.Exp.Res.14:255-259;和HansenJ.等，Hepatology20:461-474)和病毒性肝炎(参见Sheron,N.等(1991)J.Hepatol.12:241-245;和HussainM丄等(1994)J.Clin.Pathol.47:1112-1115),凝血障碍(参见vanderPoll,T.等(1990)N.Engl.J.Med.322:1622—1627;和vanderPoll,T.等(1991)Prog.Clin.Biol.Res.367:55-60)，烧伤(参见Giroir,B.P.等(1994)Am.J.Physiol.267:HI18-124;和LiuX.S.等(1994)Bums20:40-44),再输注损伤(参见Scales,W.E.等(1994)Am.丄Physiol.267:Gl122-1127;Serrick，C.等(1994)Tmnsplanation58:1158-1162;和YaoY.M.等(1995)Resuscitation29:157-168),瘢痕瘤形成(参见McCauleyR丄.等(1992)JClinImmunol12:300-308),瘢痕组织形成和发热。本发明将通过下面的实施例进一步阐明，但这些实施例不应当解释为一种限制。本发明中所引用的参考文献、专利以及公开的专利申请的内容，在本文中引入作为参考。实施例1用抗TNFoc抗体治疗皮下施用D2E7后的效力本研究中，24例患活动类风湿性关节炎每周施用一次施用D2E7抗体(n-，18)或安慰剂(n-6),剂量为0.5毫克々>斤，途径为皮下注射，时间达3个月。参与本研究的患者平均患病10.1年，在治疗前疾病活动分值(DAS)为4.87和平均3.4DMARDs(diseasemodifyingantirheumaticdrugs);这又相当大的程度上反映了疾病的活动度。用D2E7抗体治疗有反应的患者，继续公开标记(open-label)的治疗；而对0.5毫克/公斤剂量没有反应或失去了DAS反应患者，在本研究进行12周后提高至1毫克々i^斤，途径仍是皮下注射。第一位参加的患者接受60次注射，并持续60周的研究。皮下注射剂量效率与静脉注射相似。在治疗的第一周内，高达78%的患者达到DAS和ACR20反应。以0.5毫克/亳升剂量皮下施用D2E712周，与基线相比，有54。/。的关节肿胀(SWJ)减轻，关节压痛(CRP)61%减轻，CRP减轻39%,而所有的指标与安慰剂组相比都升高。完成本研究的安慰剂对照期后，患者持续用维持效力的抗体治疗长达14个月。因此这些结果表明皮下施用D2E7,剂量为0.5毫克/公斤/周，可以安全地自己施用，而且局部耐受性不4f。施用D2E7和氨曱蝶呤本研究中，患者除施用正在施用的(氨甲蝶呤)MTX外，接受皮下或静脉注射安慰剂或D2E7，剂量为1毫克々>斤。54位患者参加本研究，18位接受D2E7和安慰剂静脉注射，18位接受静脉注射安慰剂和皮下注射D2E7，18位患者接受静脉或皮下注射安慰剂。患者仅在他们无可见反应状态时，接受第二剂量药物，但第一剂量后不得早于4周。此后，所有患者都接受公开标记的每两周一次皮下注射D2E7抗体。本研究的研究总体统计学特征包括平均患类风湿性关节炎11.1年，用药前平均3.6DMARDs(不是氨甲蝶呤)和本研究开始时DAS平均为4.8L到29天时，72%静脉注射D2E7治疗患者和44%皮下注射D2E7治疗患者获得了DAS标准反应，相比较而言，安慰剂治疗的患者只有28%患者达到标准(见图5)、本研究有反应的患者中，至29天时28%安慰剂治疗患者维持ACR20反应，而对应的有72%静脉注射D2E7治疗患者和67%皮下注射D2E7治疗患者，他们的ACR20反应持续一至三个月。实施例2皮下施用抗TNFcx抗体的全身剂量每周皮下施用一次D2E7本研究有284名类风湿性关节炎患者参加，设-计目的为确定皮下施用D2E7的、优化全身剂量。患者每周随机接受20,40或80毫克的D2E7或安慰剂，施用12周。安慰剂治疗后的患者转用D2E7,剂量为40毫克/周。'接近49%的患者在施用20毫克时达到ACR20,55%的患者在施用40毫克时达到ACR20，54。/。的患者在施用80毫克时达到ACR20(见图]A)。接近23%的患者在施用20毫克时达到ACR50,27%的患者在施用40毫克时达到ACRJO,20%的患者在施用80亳克时达到ACR50,而接受安慰剂的患者仅有2%达到ACR50。这些资料表明说明，皮下施用D2E7,尤其在剂量为40毫克/周时，获得良好的反应。实施例3:每两周皮下施用一次抗TNFa抗体每两周皮下施用一次D2E7以不同的剂量在隔周皮下(s.c.)施用安慰剂或D2E7并持续与MTX联用24周后，研究对氨曱蝶呤部分反应的类风湿性关节炎患者的临床效杲、安全性、免疫原性和耐受性。研究设计对氨曱蝶呤效果不明显或对其耐受的类风湿性关节炎患者，进行有安慰剂对照、双盲、随机、多中心的研究。在试验期间，患者持续施用恒定剂量的氨甲蝶呤，以及按照下面所述的特定的内在标准的剂量范围。本研究由两部分组成1)在施用第一剂量的药物前四周为一賴"药力消散期"，在此期间DNARDs(氨甲蝶呤除夕卜)消退；(z)"安慰剂控制期"，在此期间67位患者随机分配成四组接受安慰剂，20毫克、40毫克、80毫克的D犯"作为全身总剂量)的治疗，隔周皮下给药，用药长达24周。每个剂量的研究药物分两次皮下注射，注射剂量位L6ml/次。患者第一次用药由医务人员给药，并作为培训患者的一个环节。随后在医务人员的直接观察下由患者自己用药四周。此后，在研究地点外由患者自己、或由患者指定的受训人员或医务人员用药。每次临床评估后分发给患者小或5周的药量。患者连续在第一、二、三、四、六、八、十二、十六、二十和二十四周进^f亍关节检查，检查由不知情的、与治疗医生无关的辅助人员进行。本研究有271名类风湿性关节炎患者参加。本研究的总体适度的代表了北美严重类风湿性关节炎患者的情况70%女性，大部分年龄超过40岁。该总体有本领域中技术人员根据标准选择出来，如患者必须接受类风湿性关节炎的诊断，按照1987年修订的美国风湿学会(ACR)标准定义来诊断(参见附录A)结果图1B和2-4表明每两周皮下施用一次D2E7，且与氨甲蝶呤联用，在24周内减轻类风湿性关节炎征兆和症状方面明显好于安慰剂。统计分析表明，所有D2E7三种剂量与每周施用安慰剂相比明显有效，而且40和80毫克剂量的D2E7比20毫克剂量效率更高。等价方案本领域内的那些技术人员，将认识到或仅通过常规的试验就能够确定有许多和本发明所述特定方法等价的方案。这类等价方案包括在下面的权利要求中。附录A类风湿性关节炎的ACR定义类风湿性关节炎(RA)的1987年分类标准和功能<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>如果他或她包含表7中5个亚类中类风湿性关节炎的一个以及由其医生临床诊断为类风湿性关节炎的患者认为是类风湿性关节炎。标准l、2和3必'须是至少6周出现的症状。ArthritisandRheumatism,vol31No.3(March1988)附录BSEQIDNO":AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly1S10'isAspArgLeuAlaTyrAlaSOSerGly65ValThrlieThrCysTrpTyrGinGinl*ys3SArgAlaSerGinGlylieArgAsnTyr30ProGlyLysAla40AlaSerThrLeuGinSet;GlyValProssserGlyrm:Asp70GluAspValAlaThrPheGlyGin100GluValGinLeuThrTyr85GlyThrPheThrLeuThr!Ue75TyrCysG!LnAxrgTyr'SOLysvalGlu21eLysi05ProLysLeuLeulie45SerArgPheSerGlySOSerSerLeuGinProAsnArgAlaProTyr95ValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyArg1S.1015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaS，rGlyPheThrPheAspAspTyr202530MetHisTrpValArgGinMaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045Al-lieThrTrpAsnSerGlyHislieAspTyrAlaAspSerValSOSSSO.GlyArgPheThrlieSerArgAspAsnAlaLyaAsnSerLeuTyr70'.75.80LeuGinMetAsnSerLeuArjAlaGiuAspThrAlaValTyrTyrCys8S90S5AlaLysValSerTyrLauSerThrAlaSerSefLeuAspTyrTrpGly100105110GinGlyThrLeuValThrVal-SerSerIIS120SerGlu65SEQIDNO:3'-GinArg"iyrAsnArgAlaProTyrXaaSEQ工DNO"'-ValserTyrSerThrAlaSerSLeuAspXaaSEQIDNO:5:AlaAlaSarThx*LeuGinSerS￡Q工DWO'.S',AlalieThr丁rpAsnSerGlyJi工slieAspzyrAlaAspSetValGl\i1Sio'isGlySEQIDNO:7;ArgAlaSerGinGlylieArgAanTyrLeuAla15L0A印TyrAlaMetHisAfip工leGinA印ArgVaiLeuAl為3SxyrAlaAla506SGlySerGluAspVslAlaPheGlyMetThrGinSerProSex*SerThr*lieThsrCysArgAlaSerdj;TyrC3inG工nLysProGlyLysAla40SerThrI^uSerGlyValParo5SGlyThrAspPheThrI*euThr工leAlaThrTyorTyarCys<;1rLysTyj~85SOGinGlyrhrLysValGiu工leLysSearJvlaSerlieG工yGlylieArgrAsjiTyr30ProLysLeuLeuI"SerArgPheSerGly。SrSearLeuGinPro7ianSej:AlsP-oTyrGinValGinLeuValGluSerGlyGlySerLeuArgLeuSerCys20AlaMetHisTrpValArg35SerAlalieThrTrpAsn50GluGlyArgPAlaVal￡S70LeuGinMetAsnSerLeuThrLysAlaSerTyrLeu100AlaAlaSer25GinAlaPro40Ser55GlyHisGlyLS:UVa丄GlyPheThrGlyLysGlylieAspTyr60GinProGlyArg15PheAspAspTyr30LeuAspTrpVal4SAlaAspSerValGinGlyThrLeuValThrValIISArgAspAsnAlaLysAsnAlaLeuTyr"80ProGluAspThrAlaValTyjrTyrCysThrSerSerSerLeuAspAsiiTrpGly105SerSer120SEQI￡)NO:11:GinLysTyrAsnSerAlaProTyrAlaSEO工DNO:l2,GinLysTyrAsnArgAlaProTyrAlaSSQIDNO-13-GinLysTyrGinArgAlaProTyrThx*SEQIDNO:14:GinLysTyrSerSerAlaProTyrThrSEQIDNO.-1S:GinLysTyrAsnSerAlaProTyrThrSEQIDMO:lS:GinLysTyrAsnArgAlsProTyrThrSEQ工DNO:17:GinEysTyrAsnSerAlaProTyr.TyrSEQIDNO:18:GinLysTyrAsnSerAlaProTyrAsnSEGIDN0:1S:GinLysTyrThrSerAlaProTyrTharSEQIDNO:20:GinLysTyrAsnArgAlaProTyrAsnSEOIDWO:2工GinLysTyrAsnSerAlaAlaTyrSerS印ZDNO:22:GinGinTyrAsnSerAlaProAspThrSEQID:23:GinLys.TyrXsnSerAspProTyrThxS印工。NO:24:GinLysTyrlieSerAlaProTyarThrSEQ.工DWO:25:GinLysTyrA^nArgProPtoTyrThrSE;Q工DNO:25:GinArgTyrAsnAxgAlaProTyrAla1SAla3"TyrLeu.;Se:rThrSSerSerAspA^n1510S￡Q工DNO:2S:AlaSerTyrLeuThrS6xSerLeuAspLysIS10SEQIDWO:2$;AlaSerTyrl^uSerThrSerSersesri^uAspTyr1510SEQIDNO:30:AlaSerTyrLeuSerThrSerSerSerLeuAspAsp1510AXaSerTyrSecThrPheSerX*euAspTyr1S.AlaserTyrLauSThrSerSerSerHisTyr15工DSEQIDNO:33:AlaSerPheLeuSerThirSej:serSerLeuGluTyr1510AlaSerTyrLeuSearTharAlaSei:SerLeuGluTyrIS10S￡QIONO:35;Va工5erTyrLeuSearThrAlaSetrserLftuAspAsni5ioSEQIDNO。"GACATCCA(3ATGW:CCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACC"MCACTT(STCGGGCAAGTOlGGGCATCASAkATTXCTTAGCCTGGTWCAGOJUAACCA12GGGAAAGCCCCTAAQCTCCTC3ATCTATQCTGCATCCACTTTGCAJVTCAGGGCTCCCATCT181'CGGTTCAGTGC3CAGTGGATCT(SGGACAGATTTCACTCTCACCATCW3CAGCCTACAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAGGTATAACCGTCCACCGTATACTTTTGGCCAG30"SE0IDNO:37;GAGGTGCAGCTGGTCGAOTCTGGG(3幼GGCTTGGTACAGCCCGGCAG<3TCCCTGAGACTCS"TCCTGTGCGGCCTCTGGATTCXCCTTTOATOATTATGCCATGCACTOGGTCC(:JCAAGCT121'CCAGGGAAGGQCCTOGAATC3GGTCTCAGCXATCACTTCGAATAGTGGTCAcatagactao118"GCGGACTCTGTOOAGGGCCGATTCACCA^C:tccagagacaACGCCAAC3AACtCCCTGTAT2"1CTGCAAAT(3AACWTCrGAGAGCTGAfiGATACGGCCGTATATTACTGTGCGAAASTCTCG30'lTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTATTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCC5TCTOS3Si,序列表<]10〉Abbott-BiotechnologyLtd.etal.<〗20〉施用抗-TNFalpha抗体的方法<130>BBI-168PCG40〉PCT/US02/17790<141>2002…06..05<150>60/296961<151>2001-06-08<160>37<]70〉FastSEQforWindowsVersion4.0〈210〉〗<211〉107<212>PRT<23〉人<400〉1AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSer1510AspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinGlylieArg202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeu354045TyrAlaAlaSerThrLeuGinSerGlyValProSerArgPhe505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeu657075GluAspValAlaThrTyrTyrCysGinArgTyrAsnArgAla8590ThrPheGlyGhiGlyThrLysValGlulieLys,J00105<210>2<211>121<212〉PRTValGly15AsnTyrLeulieSerGlyGinPro80ProTyr9554〈213>人〈2CluVa]GinLetiVa.lGluSerGlyGlyGlyLeuValGli)ProGlyArgJ51015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAspAspTyr202530AlaMetHisTrpValArgGhi八la'ProGlyLysGlyLeuGlu丁rpVal354045SerAlalieThrTrpAsnSei-GlyHislieAspTyrAlaAspSerVa505560GluGlyArgPlieThrlieSerArgAspAsnAlaLysAsnSerL_euTyr65707580I，(;].nMet.AsnSei-LeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysValSerTyrLeuSerThrAlaSerSerLeuAspTyrTrpGlyK)O105noG〗n()lyThrLeuVeiIThrValSerSer115120<210>3<21J>9<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223〉u丁变轻链CDR3<22〗〉VARIANT";w〉(9)<223>Xaa=Tl)]-^Ala<<I00>3Gin.'U-gTyrAsnArgAlaProTyrXaaI5<2I0>'l<2J'J>12<2J2〉PRT<2]3〉人工序列〈22()><223〉可变重链CDR3<220><221〉VARIAMT<222〉(12)<223>XticiTyru又Asn<400〉4ValSerTyrl,euSerThrAaSerSerLeuAsp_XaaI510<210>5<211>7<212〉PRT<2I3〉人《100〉5A丄aA丄siSerThrLeuGinSer15<210〉6<211〉17<212〉PRT<2KO人"00〉6AlalieThrTrpAsnSerGlyHislieAsp.TyrAlaAspSerValGit151015'<210〉7〈212〉PRT<213〉人"00〉7ArgAlaSerGinGlylieArgAsnTyrLeuAla1510<210>8<211>5<212>PFT<213>人<400〉8AspTyrAlaMetHis15<210>9<211〉107<212〉PRT<213>人<400〉9Asplie]AspArgLeuAlaTyrAla50Ser(;J.y65GluAspAlaPheGl.nMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerlieGly51015ValThrlieThrCysArgAlaSerGinGlylieArgAsiiTyr202530TrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeu.Leulie354045AlaSerThrLeuGinSerG.l.yVa]ProSerArgPheSerGly5560GlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro707580AlaThrTyrTyrCysGinLysTyrAsnSerAlaProTyr859095GinGlyThrLysValGlulieLys〗00105SerValGly<210〉10<211>121<22>PRT<213〉人57<400>10GinValGinLeuVal-GluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyArg]51015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyFheThrPheAspAspTyr202530AlaMet,HisTrpValArgGinAlaProGlyLysG].yLeuAspTrpVal354045SerAlalieThrTrpAsnSerGlyHislieAspTyrAlaAspSerVal505560GluGlyArgPheAlaValSerArgAspAsnAlaLysAsnAlaLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgProGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095ThrLysAlaSerTyrLeuSerThrSerSerSerLeuAspAsnTrpGly100105110Gin(;lyThrLeuValThrValSerSer115120<210>11<2U>9<212〉PUT<213〉人<400>11GinLysTyrAsnSerAlaProTyrAla.15<210>12<21丄〉9<212〉PRT<213〉人<400〉12GinLysTyr1AsnArgAlaProTyrAla5<210〉13<2U〉9<2〗2>PRT<213〉人<400〉13GhiLysTyrGinArgAlaProTyrThrI5<210〉M<211〉9<212〉PRT<213〉人<400〉14GinLysTyrSerSerAlaProTyrThr■J5<210〉15<211>9<212〉TOT<213>人<400〉15GinLysT)tAsnSerAlaProTyrThr]5<210>16<211〉9<212〉TOT<213>人<400>16G].nLy.sTyrAsnArgPro丁yrThr15<210〉〗7<211>9<212>PRT<213>人<400>17、(;ln1-ysTyrAsriSeTA.laP.roTyrTyr15<210〉.18<2U>9<2〗2〉PRT<213>人"00〉18GinLysTyrAsnSerAlaProTyrAsn]5'<210〉19<211〉9<212〉PRT<213〉人<400〉19GinLysTyrThrSerAlaProTyrThr15<210〉20<211〉9<212〉PRT<213〉人<400>20GinLysTyrAsnArgAlaProTyrAsn]5<210〉2'i<211〉9<212〉PRT<213〉人<400>21GinLysTyrAsnSerAlaAlaTyrSer<210〉22<211〉9<212〉PRT<213〉人<400〉22GinGinTyrAsnSerAlaProAspThr15<210〉23<21丄〉9<212〉PRT<213〉人<400>23GinLysTyrAsnSerAspProTyrThr]5<210>24<211>9<212〉PKT<213〉人<400〉24GnLysTyrlieSerAlaProTyrThrJ5<210>25<211>9<212〉PRT<213〉人<400〉25Wi]LysTyrAsnArgProProTyrThr15<210〉26<211>9<212〉PKT<213〉人<400〉26G]nArg丁yrAsnArgAlaProTyrAla61<210〉27<211〉12<212〉PRT<213〉人<400〉27Ala.Ser丁yr1LeuSerThrSerSerSerLeuAspAsn510<210〉28(211〉12<212〉PRT<213〉人<400>28AlaSerTyrLeuSer了hrSerSerSerLeuAspLys1510<210〉29<211〉12<212〉PRT<213〉人<400>29Ala.SerTyrLeuSerThrSerSerSerLeuAspTyr510<210〉〈211〉<212〉(213〉3012PRT人<4()CT>30A]aSerTyrLeuSerThrSerSerSerLeuAspAsp]510<210〉31<211〉12<212〉PKT<213〉人<400〉31AlaSerTyrUuSerThrSerPheSerUuAspTyr]510〈210〉32<211〉12<212〉PRT<213〉人<400〉32AlaSer丁yrLeuSerThrSerSerSerLeuHisTyr1530〈210〉33<211〉12<212〉PRT<213〉人<柳>33AlaSerPheLeuSerThrSerSerSerLeuGluTyr1510<210>34<21]〉12<212〉PRT<213〉人<400〉34AlaSerTyrLeuSerThrAlaSerSerLeuGluTyr1510<210>35<211〉12<212>PRT<213>人<400〉35ValSerTyrLeuSerThrAlaSerSerLeuAspA.sn1510<210〉36<21〗〉321<212〉DMA<213〉人<400>36ga.catccagatgacccagtctccatcctccatcacttgtcgggcaag卞'cagggcatcagagggaaagcccctaagctcctgatctatgctcggU,cagtggcagtggatctgggacagatga.aga.tgttgcaacttattactgtcaaaggctgtctgcatctgtaggggacagagtcacc60aattacttagcctggtatcagcaaaaacca120gcatccactttgcaatcaggggtcccatct180ttcactctcaccatcagcagcctacagcct240tataaccgtgcaccgtatacttttggccag300321<210〉37<21〗〉363<212〉DNA〈213〉人<400〉37ga.ggtgcagctggtggagtctgggggaggct,GCtgtgcggcctctggattcacctttgatccagggaagggcctggaatgggtctcagctgcggact,ctgtggagggccgattcacca"tcctgcaaatgaacagt'ctgagagctgaggatt,accttagcaccgcgtcctcccttgacCatttggtacagcccggcaggtccctgagactc60gattatgccatgcactgggtccggcaagct120atcacttggaatagtggtcacatagactat180tccagagaoaacgccaagaactccctgtat240acggccgtatattactgtgcgaaagtctcg300tggggccaaggtaccctggtcaccgtctcg3603636权利要求1.一种治疗人类受试者中的失调的方法，其中疾病可用TNFα抗体治疗，所述方法包括给人类受试者每两周施用一种组合物来治疗失调，其中所述组合物包含抗TNFα抗体或其抗原结合部分。2.权利要求l中的方法，其中施用是通过皮下注射进行的。3.权利要求l中的方法，其中所迷抗TNFot抗体或其抗原结合部分是人抗TNFa抗体。4.权利要求3中的方法，其中由表面等离子共振测定，人抗体或其抗原结合部分以Kd为lxlO"M或更低，K。ff速率常数为lxl(T3/秒或更低从人TNFa上解离，而且在标准的体外L929;f佥测方法中以1(35()为1x10-M或更低中和人TNFa细胞毒性。5.权利要求3中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分以K。ff速率常数为5x]0—V秒或更低从人TNFa上解离。6.权利要求3中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分以K。ff速率常数为x10—V秒或更低从人TNFa上解离。7.权利要求3中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分，在标准体外L929检测方法中，以IC5o为1x10-8M或更低中和人TNFcx细胞毒性。8.权利要求3中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分，在标准体外L929检测方法中，以I&。为1x10—9M或更低中和人TNFa细胞毒性。9.权利要求3中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分，在标准体外L929检测方法中，以IC5。为1x10-'。M或更^f氐中和人TNFcx细胞毒性。10.权利要求3中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分是一种重纟i抗体或其重组的抗原结合部分。'11.一种在人受试者中抑制人TNFcx活性的方法，所述人受试者患有其中TNFa活性有害的失调，所述方法包括每两周施用一种组合物，所述组合物包含人抗TNFa抗体，其中人抗体或其抗原结合部分具有下列特征a)由表面等离子共振测定，以K。ff速率常数为lxi0々秒或更低从人TNFcc上解离；b)具有轻链CDR3结枸域，其包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或通过在.l，4,5,7或8位进行单一丙氨酸替代，或在l,3,4,6，7,8和/或9位进行1至5个保守氨基酸替代由SEQIDNO:3修饰的氨基酸序列；c)具有重链CDR3结构域，其包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，或通过在2,3,4,5,6,8,9,10或11位进行单一丙氨酸替代，或在2，3,4,5,6,8,9，10,11和/或12位进行1至5个保守氨基酸替代由SEQIDNO:4修饰的氨基酸序列。12.权利要求ll中的方法，其中施用是皮下施用。13.权利要求11中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分以K。ff速率常数为5x10—V秒或更低从人TNFa上解离。14.一种在人受试者中抑制人TNFoc活性的方法，所述人受试者患有其中TNFoc活性有害的失调，所述方法包括每两周皮下施用一种组合物，所述组合物包含人抗TNFcc抗体，其中人抗体或其抗原结合部分具有轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR),轻链可变区具有CDR3结构域，该结构域包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或通过在l,4,5,7或8位进行单一丙氨酸替代由SEQIDNO:3修饰的序列；重链可变区具有CDE3结构域，该结构域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，或通过在2，3，4，5,6,8，9,10或11位进行单一丙氨酸替代由SEQIDNO:4修饰的序列。15.权利要求l4中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分的LCVR进一步具有包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的CDR2结构域，HCVR进一步具有包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的CDR2结构域。16.权利要求l4中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分的LCVR进一步具有包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的CDR1结构域，HCVR具有包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的CDR1结构域。17.—种在人受试者中抑制人TNFcx活性的方法，所述人受试者患有其中TNFcc活性有害的失调，所述方法包括每两周皮下施用一种组合物，所迷组合物包含人抗TNFcx抗体，其中所述人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)，和包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。18.权利要求17中的方法，其中人抗体具有IgGl重链恒定区。19.权利要求17中的方法，其中人抗体具有IgG4重链恒定区。20.权利要求17中的方法，其中人抗体是Fab片段。21.权利要求7中的方法，其中人抗体是单链Fv片段。22.—种在人受试者中抑制人TNFct活性的方法，其中所迷人受试者患有其中TNFa活性有害的失调，所述方法包括每两周皮下施用一种组合物，所述组合物包含人抗TNFa抗体，其中所述人抗体或其抗原结合部分具有轻链可变区(LCVR)或重链可变区(HCVR)，轻链可变区具有CDR3结构域，该结构域包含选自SEQIDNO:3、SEQJDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:〗4、SEQIDNO:〗5、SEQIDNO:16、SEQIDNO:〗7、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26的氨基酸序列；重链可变区具有CDR3结构域，该结构域包含选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33和SEQIDNO:34的氨基酸序列。23.—种在人受试者中抑制人TNFa活性的方法，所述人受试者患有其中TNFa活性有害的失调，所述方法包括每两周皮下施用一种组合物，所述组合物包含人抗TNFcc抗体，其中所述人抗体是D2E7抗体或其抗原结合部分。24.—种试剂盒，它包含一种制剂，所述制剂包含a)—种药物组合物，其包含抗TNFa抗体和药学上可接受的载体；b)每两周施用一次药物组'合物以治疗失调的说明，其中抗TNFa抗体或其抗原结合部分在治疗失调时有效。25.权利要求24中所述的试剂盒，其中抗体包含权利要求222任一项中的抗体或其抗原结合部分。26.—种包含药物组合物的预装注射器，所述药物组合物中包含抗TNFcx抗体和药学上可接受的载体。27.权利要求26中的注射器，其中人抗体包含权利要求2-22任一项中的抗体或其抗原结合部分。28.—种治疗失调的方法，其中抗TNFa抗体或其抗原结合部分在治疗失调时有效，所述方法包括给人受试者皮下施用一种组合物，所迷组奋物包含抗TNFa抗体或其抗原结合部分以及氨甲蝶呤，用以治疗失调。29.4又利要求28中的方法，其中氨曱蝶呤与抗TNFa抗体或其抗原结合部分一起施用。30.;i:又利要求28中的方法，其中氨曱蝶呤在施用抗TNFoc抗体或其抗原结合部分前施用。31.权利要求28中的方法，其中氨甲蝶呤在施用抗TNFoc抗体或其抗原结合部分后施用。32.一又利要求28中的方法，其中抗TNFoc抗体是人抗TNFcx抗体或其抗原结合部分。33.;f又利要求28中的方法，其中由表面等离子共振测定，人抗体或其抗原结合部分以、为1x10—SM或更低，K。ff速率常数为1x10力秒或更低从人TNFa上解离，而且在标准的体外L929检测方法中以1(35。为1x10-7M或更低中和人TNFoc细胞毒性。34.^^又利要求28中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分以K。ff速率常数为5x10-V秒或更低从人TNFct上解离。35.权利要求28中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分以K。ff速率常数为1x10—V秒或更低从人TNFa上解离。36.^又利要求28中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分，在标准体外L929检测方法中，以lCso为1x10_8M或更低中和人TNFa细刀包毒性。37.权利要求2'8中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分；在标准体外L929检测方法中，以IQ。为1x10-9M或更低中和人TNFa细月包毒l生。38.权利要求28中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分，在标准体外L929检测方法中，以iq。为1x10-'。M或更低中和人TNFC(细月包毒性。39.权利要求28中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分是一种重组抗体或其重组的抗原结合部分。40.权利要求28中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分能够抑制人TNFcc诱导的ELAM-1在人脐带静脉内皮细胞上的表达。41.一种在人受试者中抑制人TNFa活性的方法，所述人受试者患有其中TNFcx活性有害的失调，所述方法包括给人受试者施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFoc抗体，其中所述人抗体或其抗原结合部分具有下列特性a)由表面等离子共振测定，以K必速率常数为lxio々秒或更低从人TNFa上解离；.b)具有轻链CDR3结构域，其包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或通过在l,4,5'7或8位进行单一丙氨酸替代，或在1，3,4,6,7,8和/或9位进行1至5个保守氨基酸替代由SEQIDNO:3修饰的氨基酸序列；c)具有重链CDR3结构域，其包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，或通过在2,3,4,5，6,8,9，10或11位进行单一丙氨酸替代，或在2,3，4,5,6,8,9,10,11和/或12位进行1至5个保守氨基酸替代由SEQIDNO:4修饰的氨基酸序列。42.权利要求41中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分以K。ff速率常数为5x10—V秒或更低从人TNFa上解离。43.权利要求41中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分以K。ff速率常数为1x10力秒或更低从人TNFa上解离。44.一种在人受试者中抑制人TNFcc活性的方法，所述人受试者患有其中TNFcx活性有害的失调，所述方法包括施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFa人抗体，其中人抗体或其抗原结合部分具有轻链可变区(L'CVR)和重链可变区(HCVR),轻链可变区具有CDR3结枸域，该结构域包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或通过在1,4,5,7或8位进行单一丙氨酸替代由犯QIDNO:3修饰的序列；重链可变区具有CDR3结枸域，该结构域包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，或通过在2，3,4,5,6,8,9,10或11位进行单一丙氨酸替代由SEQIDNO:4修饰的序列。45.权利要求44中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分的LCVR进一步具有包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的CDR2结构域，HCVR进一步具有包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的CDR2结枸域。46.权利要求44中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分的LCVR进一步具有包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的CDR1结构域，HCVR具有包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的CDR1结构域。47.—种在人受试者中抑制人TNFa活性的方法，所述人受试者患有其中TNFoc活性有害的失调，所述方法包括施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFa抗体，其中所述人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR),和包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。48.权利要求47中的方法，其中人抗体具有IgGl重链恒定区。49.权利要求47中的方法，其中人抗体具有IgG4重链恒定区。50.权利要求47中的方法，其中人抗体是Fab片段。51.权利要求47中的方法，其中人抗体是单链Fv片段。52.—种在人受试者中抑制人TNFcc活性的方法，所述人受试者患有其中TNFa活性有害的失调，所述方法包括施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFoc抗体或其抗原结构部分，其中所迷人抗体或其抗原结合部分具有轻链可变区(LCVR)或重链可变区(HCVR),轻链可变区具有CDR3结构域，该结构域包含选自SEQIDNO:3、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26的氨基酸序列；重链可变区具有CDR3结构域，该结构域包含选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDN〇32、SEQIDNO:33和SEQIDNO:34的氨基酸序列。.53.—种在人受试者中抑制人TNFcx活性的方法，所述人受试者患有其中TNFoc活性有害的失调，所述方法包括施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFoc抗体，其中所迷人抗体是D2E7抗体或其抗原结合部分。54.—种试剂盒，它包含一种制剂，所述制剂包含a)—种药物组合物，其包含抗TNFct抗体或其抗原结合部分、氨曱蝶呤和药学上可接受的载体；和b)皮下施用用于治疗失调的药物组合物的说明，所迷失调中TNFa活性是有害的。55.权利要求54中的试剂盒，其中所述抗体包含权利要求32~51中任一项中的抗体或其抗原结合部分。56.—种包含药物组合物的预装注射器，所述药物组合物中包含抗TNFa抗体、氨甲蝶呤和药学上可接受的载体。57.权利要求56中的注射器，其中所述抗体包含权利要求32~52^壬一项中的抗体或其4元原结合部分。58.权利要求1或28中的方法，其中所迷失调是败血症。59.权利要求1或28中的方法，其中所迷抗体与细胞因子白介素6(IL七)一起给人受试者施用，或以血清或血浆IL-6浓度在500pg/ml以上给人受试者施用。60.权利要求1或28中的方法，其中所述失调是自身免疫性疾病。61.权利要求60中的方法，其中自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、类风湿性脊推炎、骨关节炎和痛风性关节炎。62.权利要求61的方法，其中自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。63.权利要求60的方法，其中自身免疫性疾病选自变态反应、多发性硬化病、自免性糖尿病、自免性色素层炎和肾病综合征。64.权利要求1或28的方法，其中失调是一种传染病。65.权利要求1或28的方法,'其中失调是移植排斥或移植物抗宿主病。66.权利要求1或28中的方法，其中失调是恶性肿瘤。67.权利要求1或28中的方法，其中失调是肺病。68.权利要求1或28中的方法，其中失调是肠道失调。69.权利要求1或28中的方法，其中失调是心脏失调。70.权利要求1或28中的方法，其中失调选自炎性骨病、骨吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、凝血障碍、烧伤、再输注损伤、瘢痕瘤形成、瘢痕组织形成和发热。71.—种试剂盒，其包含a)—种药物组合物，'其包含抗TNFcc抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体；b)—种药物组合物，其包含氨曱蝶呤和药学上可接受的载体；c)皮下施用抗TNFa抗体药物组合物和在施用抗TNFa抗体药物组合物之前、之后或同时施用氨甲i某呤药物组合物的i兌明。72.权利要求71的试剂盒，其中抗TNFoc抗体或其抗原结合部分是D2E7抗体或其抗原结合部分。全文摘要本发明公开了治疗其中TNFα活性是有害的失调的方法，所述方法是通过每两周皮下施用人抗体，优选重组人抗体而进行的，所述抗体特异性地结合人肿瘤坏死因子α(hTNFα)。抗体可以与氨甲蝶呤一起施用或不一起施用。这些抗体对hTNFα有高的亲和力(例如K_d＝10^-8M或更低)，低的解离速率(例如K_off＝10^-3/秒或更低)和体外、体内中和hTNFα活性。本发明的抗体可以是全长抗体或其抗原结合部分。本发明也包括含有药物组合物的和施用说明的试剂盒，和含有药物组合物的预装的注射器。文档编号A61P19/08GK101574520SQ200910145369公开日2009年11月11日申请日期2002年6月5日优先权日2001年6月8日发明者J·肯佩尼,R·维斯,S·A·菲斯科夫申请人:艾博特生物技术有限公司