专利名称：：一种过氧化物酶体增殖物激活受体-γ的天然激活剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种过氧化物酶体增殖物激活受体-Y的天然激活剂。
背景技术：
：在动脉粥样硬化中起重要作用的ox-LDL能够激活PPAR-Y转录活性，诱导ABCA1和ABCG1的表达(PPARY-LXR-ABCA1途径)[Houetal.，CellBiochemFunct，2007，25:33-44]，从而促进胆固醇的流出。ox-LDL部分脂类成分及衍生物，如9-HODE禾P13-HODE[Itohetal.，NatStructMolBiol，2008，15:924-931]，已证实是PPAR-Y的天然配体，能够调节动脉粥样硬化的发生与发展，下式A为各种PPAR天然配体的结构式AP5"~l,OxLig-l是ox-LDL的活性成分，OxLig-l在动脉粥样硬化中对PPAR-Y的影响仍未见报道。PCT/JP02/00723专利公开了利用氢谱和碳谱分析法对OxLig-l进行结构分析。丄H-顧R(500固z，CDC13)结果显示S=5.708(s，'H，H-6)，4.732-4.712(m，丄H，H-3);13C-NMR(500MHz，CDC13)结果显示S=202.03，179.03，173.01，164.05，126.89，72.04，54.88，50.04，49.89，45.47，43.18，39.52，38.74，36.23，36.06，328.84，28.54，28.01，24.89，24.61，23.87，22.80，18.91，17.29。"C-顧R表明壬二酸与7-KC发生了酯化反应。^-NMR中，7-KC上与羟基相连的碳上氢原子的化学位移发生变化(8=4.732-4.712)，也说明发生了酯化反应。虽然氢谱和碳谱分析法确定了OxLig-l氢和碳的具体位置，但该方法很难确定PPAR激活剂OxLig-l羧基(-COOH)的羟基。
发明内容本发明的目的是要证实OxLig-l具有PPAR天然配体共有的羧基结构，并且通过化学及生物学方法阐明OxLig-l激活PPAR-Y的作用机制。本发明的技术方案是一种过氧化物酶体增殖物激活受体-Y的天然激活剂，OxLig-l具有PPAR天然配体共有的羧基结构，是PPAR-Y的天然配体，下式B为OxLig-l的结构式B从B中可以看出OxLig-l具有PPAR天然配体共有的羧基。OxLig-l激活PPAR-Y的作用机制如下—、OxLig-l具有PPAR天然配体共有的羧基结构进行7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷(7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate，OxLig-l)化学结构分析的红外色谱法。由红外光谱图看出，在3449cm-工处，有一羧基的羟基峰，证明OxLig-l具有PPAR天然配体共有的羧基结构。二、OxLig-l是PPAR-Y的天然配体利用AutoDock3.0软件包对受体PPAR-a/y禾POxLig-l分子进行半柔性对接。分子对接中PPAR-a/Y与OxLig-l分子按1:1比例结合。在进行半柔性对接模拟前，使用AUTOGRID计算网格，每一次对接所用的网格长、宽和高均为100个网格点，网格包含OxLig-l分子可能作用的所有活性氨基酸残基，距离设定为0.0375nm。模拟对接过程中PPAR-a/y结构视为刚性，OxLig-l分子为柔性，OxLig-l分子内的旋转键由AUTOTORS程序识别并可以在搜索过程中任意旋转，分子对接在AutoDock软件包中进行，对接使用Lamarchian遗传算法与局部能量搜索相结合(GALS)对PPAR-a/y-OxLig-l复合物构象进行搜索。每一次均进行了IOO次对接计算，最终的计算结果从软件生成的输出文件中抽提出来。结果的选择向时考虑聚类分析(ClusteringAnalysis)的结果和AUTODOCK软件自带的AMBER评分函数打分的高低。根据对接作用能大小和几何匹配情况，对100个对接参考结构进行筛选，选择最优结合构象。结果发现，OxLig-l进入PPAR-Y配体结合腔后，是横贯于左右两个腔中，其羧4基端接近极性氨基酸位点，能与已知的极性氨基酸位点中的His449及Lys367位点形成氢键；OxLig-1另一侧的环状结构位于右侧腔中，与Met364非极性氨基酸形成疏水作用。OxLig-1与PPAR-Y的对接能量为-10.41Kcal/mol，其结构和能量值均表明OxLig-1能够在配体结合腔中稳定存在，辅助说明OxLig-l是PPAR-Y的天然配体。三、OxLig-1激活PPAR-Y的作用机制(l)OxLig-l促进PPAR-Y细胞核内转位研究表明，PPAR-Y主要存在于细胞质中，经与其配体结合进入细胞核中，参与调控基因的转录。为了检测OxLig-1是否能够活化PPAR-Y，利用20iig/mLOxLig-1作用J774A.1细胞，检测PPAR-Y表达量的变化情况。20yg/mLOxLig-1剌激细胞降低了细胞质中PPAR-Y表达量。同时，OxLig-1剌激使细胞核中PPAR-Y蛋白的表达量明显增加。当OxLig-1加入细胞lOmin时，细胞核内PPAR-Y的表达量增加的最为明显，说明PPAR-Y受OxLig-1活化发生了核转位。(2)0xLig-l促进对PPAR-Y下游的胆固醇流出相关基因表达巨噬细胞不能降解细胞内过量的脂质。PPAR-Y的部分天然配体和合成配体能够调控三磷酸腺苷结合盒转运体Al(ATPbindingcassettetransporterA1andGl，ABCAl)和载脂蛋白AI(apoAl)，促进胆固醇的流出，使细胞中的脂质保持动态平衡。在本发明的实施方案中，小鼠的RT2ProfilerPCR生物芯片结果显示，OxLig-1作用J774A.1细胞2h后ABCAlmRNA水平增加了2.73倍。另夕卜，OxLig-1也使apoAl的变化量增加34.62倍，说明OxLig-1对胆固醇流出有促进作用。本发明的有益效果是利用化学及生物学方法证实了OxLig-1是PPAR-Y的天然激活剂，并提供了OxLig-1是治疗动脉粥样硬化潜在靶点的可能性。图1为实施例1揭示OxLig-1羧基的羟基峰的红外光谱分析图。图2为实施例2分子对接分析显示OxLig-1能够在PPAR-Y配体结合腔中稳定存在构象图。图3A为实施例30xLig-l使细胞质内PPAR-Y表达减少。图3B为实施例30xLig-l使细胞核内PPAR-Y表达增加。具体实施方式实施例1红外光谱分析图揭示OxLig-1羧基的羟基峰。进行7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷(7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate，OxLig-1)化学结构分析的红外色谱法。羟基(OH)官能团的吸收出现在3600-2500cm—、由图1可以看出，OxLig-1具有一个吸收频率为3449cm-1羧基的羟基峰。因此，可以得出OxLig-1具有PPAR的天然激活剂共有的羧基峰的结论。实施例2通过化学方法阐明OxLig-1是PPAR-Y的天然配体。(l)模型的准备5从蛋白质数据库(ProteinDataBank)中获得含配体GW735与PPAR-aLBD和配体N-sulfonyl-2-indolecarboxamide与PPAR-YLBD复合物的晶体结构(PDB编号分别为2P54和2HFP)。首先将配体GW735/N-sulfonyl-2-indolecarboxamide从复合物中剥离抽出，将受体导入到AUTODOCK3.0软件包中进行必要的结构修改，包括去除水分子、加入氢原子以及加入Gasteiger-Marsili电荷等。配体OxLig-1分子的结构参数是利用Gaussian03程序在HF/6-31G*水平上优化获得的。其部分电荷是利用RESP方法对从头算Milliken电荷拟合得到的。最后分别将PPAR-a/Y和OxLig-1分子保存为PDBQT格式(包含原子类型和电荷)的文件，为对接过程做好准备。(2)分子对接利用AutoDock3.0软件包对受体PPAR-a/y禾POxLig-1分子进行半柔性对接。分子对接中PPAR-a/Y与OxLig-1分子按1:1比例结合。在进行半柔性对接模拟前，使用AUTOGRID计算网格，每一次对接所用的网格长、宽和高均为100个网格点，网格包含OxLig-l分子可能作用的所有活性氨基酸残基，距离设定为0.0375nm。模拟对接过程中PPAR-a/y结构视为刚性，OxLig-1分子为柔性，OxLig-l分子内的旋转键由AUTOTORS程序识别并可以在搜索过程中任意旋转，分子对接在AutoDock软件包中进行，对接使用Lamarchian遗传算法与局部能量搜索相结合(GALS)对PPAR-a/y-OxLig-1复合物构象进行搜索。每一次均进行了100次对接计算，最终的计算结果从软件生成的输出文件中抽提出来。结果的选择同时考虑聚类分析(ClusteringAnalysis)的结果和AUTODOCK软件自带的AMBER评分函数打分的高低。根据对接作用能大小和几何匹配情况，对100个对接参考结构进行筛选，选择最优结合构象。结果如图2所示，OxLig-l进入PPAR-Y配体结合腔后，是横贯于左右两个腔中，其羧基端接近极性氨基酸位点，能与已知的极性氨基酸位点中的His449及Lys367位点形成氢键；OxLig-l另一侧的环状结构位于右侧腔中，与Met364非极性氨基酸形成疏水作用，OxLig-1与PPAR-Y的对接能量为-10.41Kcal/mol，其结构和能量值均表明OxLig-1能够在配体结合腔中稳定存在，辅助说明OxLig-1是PPAR-Y的天然配体。实施例3通过生物学方法阐明OxLig-1激活PPAR-Y的作用机制。(1)细胞培养J774A.1细胞细胞培养于DMEM培养基中(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium,DMEM，Gibco，InvitrogenCorporation)。另外加入1.5g/L的碳酸氢钠，ImM丙酮酸钠，10%(V/V)的经热灭活的胎牛血清(Gibco)，青霉素100U/mL和链霉素100U/mL。每三天传代，接种量为1X1()6个细胞，20mL(75cm2)，于37。C，5X(V/V)C02培养箱中培养。加药前，无血清培养基作用6h。然后加入不同浓度OxLig-l(O、5、10、20和40iig/mL)，作用细胞10，30，60min。细胞加药时，OxLig-l用DMSO溶解，再按照加药浓度用培养基稀释。(2)蛋白质提取l)胞浆蛋白提取①按表3.1配制蛋白裂解液②取出药物作用后的ce11，倒掉培养基，培养瓶置于冰上。1XPBS(预冷，5-10mL/次)，洗cell3次(终止药物剌激，去除培养基)。③吸干PBS，加入lmL细胞裂解液，将细胞吹打下来，转入1.5ml离心管中。于4。C摇晃离心管15min。4°C，10000rpm离心10min，收集上清。⑤BCA法测蛋白浓度，分装成小份，-20°〇保存。2)核蛋白提取(采用碧云天核蛋白提取试剂盒)①向细胞沉淀中加入50iiL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂；②最高速剧烈vortex1530s，将细胞沉淀完全悬浮于试剂中；冰浴30min，每隔12min居lj烈vortex1530min。③4。C，12000rpm离心10min，收集上清，即为核蛋白。不同浓度的OxLig-l(O、5、10、20禾P40iig/mL)，作用不同时间(10，30，60min)后，提取J774A.1细胞的胞浆蛋白和核蛋白。(3)蛋白质印迹(Westernblot):l)样品处理将12iiL蛋白(所提Pr+PBS)禾口3yL5XSDS-PAGEloadingbuffer混匀，100°C煮沸5min。上样maker4uL，样品15uL。2)电泳恒压80V，23h。3)安装转印装置4)转膜IOOV恒压转移lh(冰浴)。5)5%(W/V)blockingbuffer封闭lh。6)primaryantibody室温孵育2h(或4。C过夜)，TBSTBuffer洗膜6次，10min/次。7)secondaryantibody室温孵育lh，TBSTBuffer洗膜6次，10min/次。8)ECL发光显色，暗室曝光，显影，定影。加入不同浓度OxLig-l(O、5、10、20禾P40iig/mL)，作用细胞10，30，60min后，Westernblot检测PPAR-Y蛋白的表达量。结果发现，OxLig-l最适合作用浓度为20iig/mL。20iig/mLOxLig-l剌激细胞降低了细胞质中PPAR-Y表达量，如图3A所示。同时，OxLig-l剌激使细胞核中PPAR-Y蛋白的表达量明显增加，如图3B所示。(4)小鼠的RT2ProfilerPCR生物芯片(购买自上海康成生物公司)实验1)按照5X105/mL，5mL接种J774A.1细胞到25cm2培养瓶中，37"培养12h;2)无血清培养基处理6h;3)加入20iig/mLOxLig-l作用细胞2小时；4)利用TRIzol法(Invirogen，Carlsbad，CA)抽提对照和20yg/mLOxLig-l作用的细胞的总RNA，2%(W/V)琼脂糖电泳检测RNA的纯度和完整性；5)使用SuperscriptIII反转录酶(Invirogen，Carlsbad,CA)对所提RNA进行反转录。并使用RneasyMinEluteCleanup试剂盒(QiagenGmbH，Hilden，Germany)去除基因组DNA污染。6)对基因组DNA进行实时定量PCR操作95。C预变性10min后，设定40个PCR扩增反应95°C15s、40°Clmin。77)运用AACt对数据进行分析，计算出OxLig-l作用组与空白对照组之间的差异水平。正值代表基因的mRNA水平上调，负值代表下调。结果如表1所示，OxLig-l促进对PPAR-Y下游的胆固醇流出相关基因ABCAl和apoAI表达，小鼠的RT2ProfilerPCR生物芯片结果显示，OxLig-1作用细胞2h后ABCAlmRNA水平增加了2.73倍。另外，OxLig-l也是胆固醇流出相关的载脂蛋白AI(apoAI)的变化量增加34.62倍，说明OxLig-1对胆固醇流出有促进作用。表10xLig-l促进对PPAR-Y下游的胆固醇流出相关基因ABCAl和apoAI表达<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求一种过氧化物酶体增殖物激活受体-γ的天然激活剂，其特征在于，OxLig-1具有PPAR天然配体共有的羧基结构，是PPAR-γ的天然配体，下式为OxLig-1的结构式2.权利要求1所述的一种过氧化物酶体增殖物激活受体-Y的天然激活剂，其特征在于，该天然激活剂激活PPAR-Y的作用机制如下一、OxLig-l是PPAR-Y的天然配体利用AutoDock3.0软件包对受体PPAR-a/y禾POxLig-1分子进行半柔性对接，分子对接中PPAR-a/Y与OxLig-l分子按1:1比例结合，在进行半柔性对接模拟前，使用AUTOGRID计算网格，每一次对接所用的网格长、宽和高均为100个网格点，网格包含OxLig-l分子可能作用的所有活性氨基酸残基，距离设定为0.0375nm，模拟对接过程中PPAR-a/Y结构视为刚性，OxLig-l分子为柔性，OxLig-l分子内的旋转键由AUTOTORS程序识别并可以在搜索过程中任意旋转，分子对接在AutoDock软件包中进行，对接使用Lamarchian遗传算法与局部能量搜索相结合对PPAR-a/Y-OxLig-1复合物构象进行搜索，每一次均进行了IOO次对接计算，最终的计算结果从软件生成的输出文件中抽提出来，结果的选择同时考虑聚类分析的结果和AUTODOCK软件自带的AMBER评分函数打分的高低，根据对接作用能大小和几何匹配情况，对IOO个对接参考结构进行筛选，选择最优结合构象；OxLig-l进入PPAR-Y配体结合腔后，是横贯于左右两个腔中，其羧基端接近极性氨基酸位点，能与已知的极性氨基酸位点中的His449及Lys367位点形成氢键；OxLig-l另一侧的环状结构位于右侧腔中，与Met364非极性氨基酸形成疏水作用，OxLig-1与PPAR-Y的对接能量为-10.41Kcal/mol，其结构和能量值均表明OxLig-1能够在配体结合腔中稳定存在；二、OxLig-1激活PPAR-Y的作用机制(1)OxLig-l促进PPAR-Y细胞核内转位当OxLig-1加入细胞lOmin时，细胞核内PPAR-Y的表达量增加的最为明显，说明PPAR-Y受OxLig-1活化发生了核转位；(2)0xLig-l促进对PPAR-Y下游的胆固醇流出相关基因表达OxLig-1作用J774A.1细胞后，ABCA1和apoAlmRNA水平显著增加，说明OxLig-1对胆固醇流出有促进作用。全文摘要本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种过氧化物酶体增殖物激活受体-γ的天然激活剂。该过氧化物酶体增殖物激活受体-γ的天然激活剂OxLig-1具有PPAR天然配体共有的羧基结构，是PPAR-γ的天然配体，下式为OxLig-1的结构式OxLig-1激活PPAR-γ的作用机制如下一、OxLig-1是PPAR-γ的天然配体利用AutoDock3.0软件包对受体PPAR-α/γ和OxLig-1分子进行半柔性对接，OxLig-1的结构和能量值均表明OxLig-1能够在配体结合腔中稳定存在，辅助说明OxLig-1是PPAR-γ的天然配体。二、OxLig-1激活PPAR-γ的作用机制OxLig-1促进PPAR-γ细胞核内转位；OxLig-1促进对PPAR-γ下游的胆固醇流出相关基因表达。本发明利用化学及生物学方法证实了OxLig-1是PPAR-γ的天然激活剂，并提供了OxLig-1是治疗动脉粥样硬化潜在靶点的可能性。文档编号A61K31/575GK101690726SQ20091018781公开日2010年4月7日申请日期2009年9月30日优先权日2009年9月30日发明者刘媛媛,刘庆平,李文哲申请人:大连大学