专利名称：具有靶向功能的四氧化三锰纳米造影材料的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及纳米造影材料，具体地说是一种具有靶向功能的四氧化三锰纳米造影
材料的制备及其应用。
背景技术：
肿瘤疾病、心脑血管疾病是威胁人类健康的重大疾病，细胞与组织的检测和治疗 是当代医药、化学和生物技术领域的重要任务。核磁共振成像对疾病的诊断准确，提供的 信息量远远大于医学影像学的其他成像术，是诊断疾病的重要方法。核磁共振成像检查是 利用电子计算机对人体的断面进行图像诊断的检查法，原理是人体的细胞分子带有氢原子 核，在强磁场下给予特定的高波后会发生共振现象，产生某种高波数的电磁波，使用电子计 算机对电磁波的强弱进行处理并图像化。核磁共振成像提供的信息量远远大于医学影像学 中的其他成像技术，广泛地用于各种癌症的诊断。它对于脑内血肿、脑外血肿、脑肿瘤、颅内 动脉瘤、动静脉血管畸形、脑缺血、椎管内肿瘤、脊髓空洞症和脊髓积水等颅脑常见疾病的 检测准确，对原发性肝癌等肿瘤组织的诊断准确。从磁共振图像中我们可以得到物质的多 种物理特性参数，如质子密度、自旋_晶格驰豫时间1\、自旋_自旋驰豫时间Ty扩散系数、 磁化系数、化学位移等等。核磁共振成像没有X线，对人体没损害。多平面直接成像，对软 组织的显示能力强，成像参数多，成像方法多，可供选择的余地大，改变射频脉冲的程序、改 变脉冲的重复时间和回波时间等都可改变图像的表现，从而得到不同加权因素的图像。核 磁共振成像没有骨伪影的干扰，靠近骨骼的病变同样可显示的非常清楚。多平面直接成像 可直观地了解病变的范围、起源和侵犯的结构，对肿瘤的定位、定性、手术方案的制订及预 后的估计都有重要的意义。同时操作中人为影响因素少，可重复性大，便于会诊、对比和随 访。核磁共振成像优良的软组织对比度、多平面直接成像的优点，加上不断开发新的核磁共 振成像造影材料及成像程序的应用，都给核磁共振成像诊断肿瘤提供了良好的基础和进一 步发展的条件。 造影材料按性能分为五大类。 一为经肾排泄的造影材料，多用于泌尿系和心血管 的造影；二为经肝胆排泄的造影材料，如横番酸等；三为油脂类造影材料，如碘化油、碘苯 酯等，主要用于支气管、子宫等管道、体腔等的造影；四为固体造影材料，如硫酸钡，将其调 成混悬液吞服或灌肠用于消化道造影。以上四类造影材料密度均高于人体软组织，统称阳 性造影材料，在X线片上呈白色。第五类为气体造影材料，如空气、二氧化碳、氧气等，这类 造影材料密度低于人体软组织，属阴性造影材料，在X线片上呈黑色。现有造影材料的缺点 是通过材料的磁学性能来检测肿瘤，不具有靶向性，无法准确的使造影材料进入肿瘤细胞， 使得正常组织与肿瘤组织不能区分开来。随着医药和生物技术的发展，肿瘤疾病检测的需 要，多功能检测技术的应用越来越重要。因此发明一种新的方法制备具有靶向功能的四氧 化三锰纳米造影材料，通过靶向分子进入肿瘤细胞，准确诊断肿瘤细胞或组织是十分有价 值的。 本发明制取具有氨基功能化的水溶性四氧化三锰纳米粒子，通过定量分析其表面的氨基密度，固定有机荧光素和靶向分子在纳米粒子表面连接数量的比例，制备出具有靶 向功能的四氧化三锰纳米造影材料，不但可以作为核磁共振成像的1\造影材料，还可以应 用于细胞内部光学成像；也可以通过靶向分子进入肿瘤细胞的特向异性，通过磁学成像和 光学成像，达到对肿瘤组织检测的目的。 经广泛检索国内外专利文件和国内外公开出版物未见有与本发明技术相同的文 献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备具有靶向功能四氧化三锰纳米造影材料的方法。
本发明的另一目的是提供具有靶向功能四氧化三锰纳米造影材料在核磁共振成 像中的应用。 —种具有靶向功能的四氧化三锰纳米造影材料的制备方法，包括以下步骤
(1)将四氧化三锰纳米粒子溶于环己烷中，加入正硅酸四乙酯(TE0S)、3-氨基丙 基_三乙氧基硅烷(APS)，常温搅拌得氨基功能化的水溶性四氧化三锰纳米粒子；
(2)将上述纳米粒子和异硫氰酸罗丹明(RBITC)溶解在无水四氢呋喃中，常温搅 拌12小时； (3)将上述溶液中的沉淀物离心分离，得具有磁光双功能的水溶性四氧化三锰纳 米造影材料固体物质； (4)将叶酸、l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、N-羟基硫
代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)溶解在二甲亚砜(DMSO)配成溶液，真空搅拌30min ; (5)将步骤(3)所得磁光双功能的纳米粒子溶解到步骤(4)混合溶液中搅拌12小
时；离心分离，得表面具有荧光发光材料异硫氰酸罗丹明和靶向分子叶酸的水溶性四氧化
三锰纳米造影材料。 表面的有机发光材料异硫氰酸罗丹明和靶向分子叶酸的比例为2 : 1。 具有靶向功能的四氧化三锰纳米造影材料的应用用于核磁共振T1造影材料，通
过磁共振和荧光成像靶向肿瘤细胞。 本发明的要点是通过氨基偶联其他活性基团的方法，使得水溶性四氧化三锰纳 米材料具有荧光性质和靶向功能，通过靶向分子，对肿瘤细胞实现特异性识别；通过具有靶 向功能的四氧化三锰纳米造影材料在细胞和活体层次进行磁学、光学及肿瘤靶向等生物应 用来实现的。 本发明首先制备出单分散的、水溶性的、氨基功能化的四氧化三锰/二氧化硅核 壳结构的磁性纳米材料；然后氨基密度测试方法定量检测出纳米粒子表面的氨基数量；固 定有机荧光素(RBITC)和叶酸靶向分子在纳米粒子表面连接数量的比例，制备出具有靶向 功能的四氧化三锰纳米造影材料。本发明造影材料不但具有磁学成像应用，还有光学成像 应用，通过靶向分子进入肿瘤细胞的特向异性，应用于肿瘤细胞或组织的磁学成像和光学 成像领域。本发明显著的特征是开创性的制备出氨基功能化的水溶性四氧化三锰纳米粒 子，并且在其表面连接有机发光材料和靶向分子，使其成为具有靶向功能的四氧化三锰纳 米造影材料。本发明首先利用在其表面包裹二氧化硅外壳，制备出氨基功能化的水溶性的 四氧化三锰纳米粒子；然后通过氨基定量的连接上有机发光材料和靶向分子。本发明利用材料的磁学和光学性质在细胞和活体层次进行实验，开发出了良好的生物应用价值。不但 可以作为核磁共振成像的I\造影材料，还可以应用于细胞内部光学成像荧光造影材料；也 可以通过靶向分子进入肿瘤细胞的特向异性，通过磁学成像和光学成像，达到靶向分子对 肿瘤组织检测的目的。 本发明方法中，在连接有异硫氰酸罗丹明的四氧化三锰磁性纳米材料之前，测试 纳米粒子表面的氨基数量，以此确定投入罗丹明的量，这样不但可以产生一部分氨基偶联 叶酸靶向分子，而且可以很好的控制两种基团的比例。 本发明方法中，在接叶酸之前，把叶酸、1- (3_ 二甲氨基丙基)_3-乙基碳二亚胺盐 酸盐(EDC.HCl)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)溶解在二甲亚砜(DMS0)中激活半小 时，保证叶酸更有效的偶联到纳米粒子表面的氨基上。 本发明首先制备出单分散的、水溶性的、氨基功能化的四氧化三锰/二氧化硅核
壳结构的磁性纳米粒子，然后通过氨基密度测试方法定量检测出纳米粒子表面的氨基数
量，固定有机荧光素(RBITC)和叶酸靶向分子在纳米粒子表面连接数量的比例，制备出具
有靶向功能的四氧化三锰纳米造影材料。本发明材料具有良好的磁学性质和发光性能，生
物兼容性很好，可以通过磁共振和荧光成像靶向肿瘤细胞，在细胞内具有良好的磁学性能
和良好的光学性能；应用于核磁共振T1造影材料，靶向肿瘤细胞。本发明利用材料的磁学
和光学性质在细胞和活体层次进行实验，开发出了该材料良好的生物应用价值。
本发明创造性在于先制备出氨基功能化的水溶性四氧化三锰纳米粒子；再在其
表面连接有机发光材料和靶向分子，使其成为具有靶向功能的四氧化三锰纳米造影材料。
本发明具有创造性、新颖性和肿瘤检测技术中的广泛实用性。 本发明的优点是 1.设备简单，制备容易； 2.制备的四氧化三锰纳米造影材料具有荧光、磁性和靶向功能；
3.造影材料粒径均匀、分散性好、水溶性好； 4.具有磁、光双功能的造影材料在医药和生物等领域应用价值大。
图1是本发明不同标准浓度芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)和测试包覆二氧化硅的水溶 性四氧化三锰纳米造影材料表面氨基密度时反应的氟摩酰氯(Fmoc-Cl)的归一化的紫外 吸收光谱图，然后，通过不同标准浓度芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)与测试包覆二氧化硅的水 溶性四氧化三锰纳米造影材料表面氨基密度时反应的芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)的浓度-紫 外强度标准直线y = -0. 19466+5. 52526x(y代表紫外吸收的强度，x代表Fmoc-Cl的浓 度)，换算氨基密度，最后求出平均氨基密度为2. 2411 X 10—4mol/g。 图2是本发明中的纯异硫氰酸罗丹明配体(A)、纯叶酸配体(B)、水溶性四氧化三 锰纳米粒子(C)、单独连接异硫氰酸罗丹明的四氧化三锰纳米粒子(D)、单独连接叶酸的四 氧化三锰纳米粒子(E)以及同时具有荧光和靶向功能的水溶性四氧化三锰造影材料(F)的 紫外吸收光谱图。图2表明纳米粒子表面具有功能化基团以及基团种类280nm为叶酸配 体的吸收峰；560nm为异硫氰酸罗丹明配体的吸收峰。 图3是实施例4合成的具有靶向功能的四氧化三锰纳米造影材料不同浓度、不同时间孵育子宫癌细胞(HeLa细胞，下同)。制备的两亲超顺磁性磁共振造影材料的细胞毒 性测试结果图。将人宫颈癌细胞系海拉细胞系(HeLa)接入50mL体积的细胞培养瓶中，在 37°〇、饱和湿度、5%0)2孵箱中培养而得，培养体系为含10%胎牛血清(FCS)的达尔伯克 (氏)必需基本培养基(DMEM)培养基(含10X胎牛血清、100U/ml青霉素、100 y g/ml链霉 素和1%谷氨酰胺，PH 7. 2 7. 4)。图3表明当制备的造影材料中的四氧化三锰组分浓 度达到20 g/ml时，细胞的存活率为85%，证明制备的具有靶向功能的四氧化三锰纳米造 影材料对细胞的毒性很小。 图4是实施例1制备的水溶性四氧化三锰纳米粒子的1\加权成像图；图1由0. 5T 的磁共振成像仪测试而得，具体参数为TR/TE = 1000/60ms，选层厚度为0. 6mm，谱宽SW = 50KHz，接收机增益RG = 3。图4表明随着造影材料中Mn2+浓度的逐渐增加，核磁共振成 像图(MRI)的1\信号逐渐变亮。 图5为实施例1所制备的水溶性四氧化三锰纳米粒子在水溶液中的相对于 Mn"浓度拟合的直线图；图中直线的斜率即为横向驰豫率Rp图5表明制备的水溶性四氧 化三锰纳米粒子有较强的驰豫能力，横向驰豫率&达到0. 59mM—、一1。 图6是本发明合成的单独叶酸靶向的四氧化三锰纳米造影材料分别在HeLa细胞 (A)和乳腺癌细胞(MCF-7细胞，下同)(B)中的1\核磁共振成像图。图6由0. 5T的磁共振 成像仪测试而得，参数为TR/TE = 1000/60ms，选层厚度为0. 6mm，谱宽SW = 50KHz，接收 机增益RG = 3。图6表明对MCF-7细胞属于低表达，进入高表达的HeLa细胞较多，所以 HeLa细胞MRI图的1\信号较亮，表明靶向肿瘤细胞的效果很明显。 图7是本发明合成的连接异硫氰酸罗丹明和叶酸靶向的四氧化三锰纳米造影材 料分别在HeLa细胞(A)和MCF-7细胞(B)中的共聚焦荧光成像，以及单独连接异硫氰酸罗 丹明的四氧化三锰纳米材料在HeLa细胞(C)内的共聚焦荧光成像。本实验在室温条件下 进行，孵育细胞30分钟。图7可以很清楚的看到有靶向的纳米粒子对HeLa细胞属于高表 达的，对MCF-7细胞属于低表达，没有靶向的纳米粒子进入高表达的HeLa细胞也很少，表明 靶向肿瘤细胞的效果很明显。a为激光下的图像；b为明场下的图像；c为前两图片合并的 图象。 图8是本发明合成的连接异硫氰酸罗丹明和叶酸靶向的四氧化三锰纳米造影材 料(0 ii g/mL， 1 ii g/mL， 30 y g/mL)分别在HeLa细胞和MCF-7细胞中的细胞流式图。实验仪 器为Becton-Dickinson, CA， USA ;室温下进行的，孵育细胞30min。图8可以清楚看到有靶 向的纳米粒子存在的HeLa和MCF-7细胞数量以及荧光强度没有靶向的纳米粒子进入高表 达的HeLa细胞也很少、荧光强度很弱，表明靶向肿瘤细胞的效果很明显。
图9是本发明合成的单独叶酸靶向的四氧化三锰纳米造影材料注入小鼠体内4小 时前(a)和4小时后(b)后的核磁共振1\加权成像图。
具体实施例方式
下面通过实施例来详细说明本发明的技术内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1 : 制备二氧化硅包覆的表面有大量氨基的水溶性四氧化三锰纳米粒子。 称取表面活性剂5.8mmola-(4-壬基苯基)-"-羟基-聚(氧化-l，2-联乙烷)(Ig印al C0-520)2. 5g，放入50mL烧杯中，然后加入30mL环己烷，超声溶解。然后将实施例2制备的油溶性四氧化三锰纳米粒子配置成150ii L浓度为50mg/mL的环己烷溶液。将这两部分溶液混合，超声溶解均匀，置入250mL的三颈烧瓶中，再依次加入300 L的浓氨水，180iiL正硅酸四乙酯(TE0S)，50iiL 3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APS)，常温搅拌10小时；离心分离，用乙醇和水分别洗涤几次，得二氧化硅包覆的表面有大量氨基的水溶性四氧化三锰纳米粒子。
实施例2 : 测试水溶性四氧化三锰纳米粒子表面的氨基密度实验 用10mg实施例1中制备的纳米粒子和20mg荷甲氧羰酰氯溶解在15mL N， N_ 二甲基甲酰胺(DMF)，氮气保护，搅拌10小时。然后离心分离，甲醇洗两次，真空干燥IO小时。称取5-10mg的反应后的纳米粒子，记住质量M，加入5mL的N， N_ 二甲基甲酰胺(VI)，然后再加入2mL的哌啶(V2)，超声5分钟，离心分离；取上层清液，加入比色皿中，测紫外吸收曲线。根据标准直线，换算氨基密度为2.2411X10—4mol/g。
实施例3 : 制备具有荧光功能的四氧化三锰纳米粒子 取用水或者四氢呋喃保存的包覆好四氧化三锰纳米粒子30mg ;用刚刚除水的四氢呋喃洗涤2次或3次，以除去纳米粒子中水份；将其溶解在60mL去水四氢呋喃中，加入1. lmg的异硫氰酸罗丹明，(按照氨基密度，摩尔比纳米粒子表面氨基摩尔数RBITC =2 : 1)。把混合溶液置于lOOmL的单颈烧瓶中，然后密封，抽真空，并用氮气保护，在室温的条件下用磁力器搅拌，用锡箔纸包住单颈烧瓶，避免光照破坏异硫氰酸罗丹明B的发光性能。反应8h以上后，在12000rpm离心15min，再用无水乙醇洗涤5到6次，然后真空干燥保存。
实施例4 : 制备具有靶向功能的四氧化三锰纳米粒子 将0. lg叶酸溶解到30mL 二甲基亚砜(DMSO)中，然后力n入
0. 3mmo1 (0. 0575g) 1_ (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC. HC1)和
1. Ommol (0. 1151g)N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，将上述溶液在室温条件搅拌30分钟，密封抽真空并通N2保护，再取实施例3制备的纳米粒子25mg分散在20mL 二甲基亚砜(DMSO)中，然后逐滴加入叶酸的溶液中。将上述混合溶液搅拌IO小时，使叶酸耦联反应充分进行，最后用12000rpm离心分离，用匿SO洗涤两次，除去没有反应的叶酸。 实施例5 : 细胞内核磁成像 1.耙向组25t:时，将HeLa细胞在50 ii g/mL连接叶酸的纳米粒子耙向材料中孵育30min，然后洗去没有吞噬的材料；将该肿瘤细胞配成水溶液测试细胞的1\加权成像；
2.细胞对照组25t:时，将HeLa细胞在50iig/mL连接叶酸的纳米粒子耙向材料中孵育30min，然后洗去没有吞噬的材料，最后将该肿瘤细胞配成水溶液测试细胞的1\加权成像。 本实施例结果如图6。
实施例6 :
荧光共聚焦成像 1.耙向组25t:时，将HeLa细胞在50 ii g/mL连接荧光有机配体和叶酸的纳米粒子的靶向材料中孵育30min，然后在波长A = 488nm的激光激发下测试细胞内的发光情况； 2.细胞对照组25t:时，将MCF-7细胞在50ii g/mL靶向材料中孵育30min，然后在波长A = 488nm的激光激发下测试细胞内的发光情况； 3.材料对照25°C时，将HeLa细胞在50 y g/mL连接荧光有机配体，但不连接叶酸的纳米粒子非靶向材料中孵育30min，然后在波长A = 488nm的激光激发下测试细胞内的发光情况。 本实施例结果如图7。 以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种具有靶向功能的四氧化三锰纳米造影材料的制备方法，包括以下步骤(1)将四氧化三锰纳米粒子溶于环己烷中，加入正硅酸四乙酯(TEOS)、3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APS)，常温搅拌得氨基功能化的水溶性四氧化三锰纳米粒子；(2)将上述纳米粒子和异硫氰酸罗丹明(RBITC)溶解在无水四氢呋喃中，常温搅拌12小时；(3)将上述溶液中的沉淀物离心分离，得具有磁光双功能的水溶性四氧化三锰纳米造影材料固体物质；(4)将叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)溶解在二甲亚砜(DMSO)配成溶液，真空搅拌30min；(5)将步骤(3)所得磁光双功能的纳米粒子溶解到步骤(4)混合溶液中搅拌12小时；离心分离，得表面具有荧光发光材料异硫氰酸罗丹明和靶向分子叶酸的水溶性四氧化三锰纳米造影材料。
2. 根据权利要求1所述的具有靶向功能的四氧化三锰纳米造影材料的制备方法，其特征在于表面的有机发光材料异硫氰酸罗丹明和靶向分子叶酸的比例为2 : 1。
3. 具有耙向功能的四氧化三锰纳米造影材料的应用用于核磁共振Tl造影剂，通过磁共振和荧光成像靶向肿瘤细胞。
全文摘要
本发明属于纳米造影材料，一种具有靶向功能的四氧化三锰纳米造影材料的制备及其应用。现有造影材料的缺点是通过材料的磁学性能来检测肿瘤，不具有靶向性，无法准确的使造影材料进入肿瘤细胞，使得正常组织与肿瘤组织不能区分开来。本发明首先制备出单分散的、水溶性的、氨基功能化的四氧化三锰/二氧化硅核壳结构的磁性纳米材料；然后经氨基密度测试方法定量检测出纳米粒子表面的氨基数量；固定有机荧光素和叶酸靶向分子在纳米粒子表面连接数量的比例，制备出具有靶向功能的四氧化三锰纳米造影材料。本发明的优点是设备简单，制备容易；纳米造影材料具有荧光、磁性和靶向功能；造影材料粒径均匀、分散性水溶性好；具有磁、光双功能。
文档编号A61K49/00GK101693114SQ20091019673
公开日2010年4月14日 申请日期2009年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者庄业明, 杨仕平, 杨红 申请人:上海师范大学;