专利名称：一种冻干脂质体、其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，更具体地说，本发明公开了包裹SiRNA和连接人源化 抗HER2单克隆抗体的脂质体、其制备方法和用途。
背景技术：
目前，由3β-[Ν_(Ν，，N，-二甲氨基乙基)氨甲酰基]胆固醇(DC-Chol)和二油 酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)组成的阳离子脂质体(DC-chol/DOPE脂质体)由于具有生物相容 性和低细胞毒性而被认为是最有效的基因递送系统之一。但是，DC-chol/DOPE脂质体的进 一步发展因其低转染效率，低血清稳定性和短循环寿命而受到严重阻碍。阳离子脂质体的短循环寿命可用通过在其表面连接聚乙二醇(PEG)来克服。 siRNA是一种有2广23个碱基对的双链RNA分子，可以特异性的沉默相关基因的表达，从而 对肿瘤等基因突变性疾病进行治疗。由于单纯的siRNA分子并不能进入细胞中，需要和阳 离子脂质体等基因载体复合后才能进入细胞。然而，阳离子脂质体进行PEG化后，将严重的 阻碍siRNA内吞和内涵体逃逸，导致转染效率大大降低。因此，需要优化阳离子脂质体的 PEG程度，来克服siRNA的释放障碍。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的申请人进行了大量的实验，利用纳米技术和抗体偶 联技术制备成了一种内包裹siRNA外连接抗HER2抗体Fab，片段的冻干脂质体。本发明公开了 1、外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab’片段内包裹siRNA的冻干脂质体；2、制备上述脂质体的方法，包括2. 1用薄膜分散法和抗体连接技术制备人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段连接 的冻干脂质体；2. 2将siRNA和冻干脂质体孵育后得到内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆 抗体Fab’片段的冻干脂质体。3、上述冻干脂质体在制备治疗和\或预防高表达HER2抗原的乳腺癌药物中的用 途。本发明选择具有良好的生物相容性的脂质材料作为制备脂质体的生物相容性脂 质材料。类似地，利用本发明公开的方法，还可以得到内包裹了 SiRNA外部连接其它人源 化抗体(其它的片段也可以)的冻干脂质体，这些人源化抗体可以为重组人源化抗HERl单 克隆抗体(rhuMAbHERl)等等。在本发明中，如没有特别说明，LPIL指的是连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片 段的冻干脂质体，PIL为连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab’片段的未冻干脂质体，LPL指 的是未连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻干脂质体，PL为未连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab’片段的未冻干脂质体。本发明还公开了上述内包裹SiRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的 冻干脂质体的制备方法，包括以下两个步骤(I)用薄膜分散法制备人源化抗HER2单克隆抗体Fab’片段连接的脂质体PEG 化的 DC-Chol/DOPE 免疫脂质体(PIL)的制备方法由 DC-chol (3 β _[Ν_(Ν，， N，- 二甲氨基乙基)氨甲酰基]胆固醇)，DOPE ( 二油酰磷脂酰乙醇胺)，Mal-PEG-DSPE (马 来酰亚胺化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)和mPEG-DSPE(甲氧基化聚乙二醇二硬脂 酰磷脂酰乙醇胺)以摩尔比5-0. 5X) (49.5-0.5X) 1 X(X %代表mPEG-DSPE 在总脂质中的摩尔比)(0. 5 < X 组成的多室脂质体通过脂质-薄膜水化法制备 (Zheng X, Lu J, Deng L, Xiong Y，Chen J. Preparation and characterization of magneticcationic liposome in gene delivery. Int J Pharm 2009 ；366 :211-217)，月旨 质膜用IOmM的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)水化来形成多室脂质，形成的多室脂质体通过 室温手握式挤出器(Avestin，Ottawa)挤出形成单室纳米级脂质体，挤出过程是通过逐渐 减小膜的孔径大小(从200，100和80nm) (Nucleopore, Whatman)来进行的，每个孔径循 环挤出十次。另外，抗-HER2 Fab，通过与亚氨基噻吩盐酸盐2-iminothiolane以摩尔比 100 1 (2-iminothiolane :Fab，)进行巯基化，抗-HER2 Fab，的巯基个数通过 ElIman，s 法测定。然后，巯基化的抗_HER2Fab’与制备好的包含马来酰胺基团的脂质体(即上述的 单室纳米级脂质体)以摩尔比1/10(抗-HER2 Fab，/Mal-PEG-DSPE)相混合，混合物在有 氮气的情况下室温孵育2小时得到PIL。接着，未结合的抗-HER2 Fab’通过用PBS作为洗 脱液的葡聚糖凝胶G-75 (Pharmacia，Uppsala，Sweden)的凝胶层析方法去除。最后得到的 PIL收集在外水体积部分，用0. 22 μ m滤膜除菌，4°C保存。非靶向PEG化的DC_Chol/D0PE 脂质体(PL)通过和PIL相同的方法制备，除了 Mal-PEG-DSPE用mPEG_DSPE (市场购得)代 替。磷脂浓度通过硫氢铁铵方法测定，DC-胆固醇浓度通过相应的磷脂浓度计算。低压冻干 PIL(LPIL)或冻干PL(LPL)，冻干的具体步骤为DC-胆固醇浓度为0. 8 μ g/ μ 1的PIL或PL 与5. 4 μ g/ μ 1蔗糖(蔗糖终浓度为9 %，重量/体积比)混合，VirTiS AdVantageTMBencht0p Freezer冻干机冻干16 18小时，整个冻干过程包括预冻过程和冷冻干燥过程，预冻过程 在低于-40°C下冷冻，时间不少于60min ；冷冻干燥过程温度按从_40°C按5°C逐渐升高至室 温，每个阶段干燥时间为30min 180min，真空度为50mTorr 200mTorr。(II)将siRNA和脂质体孵育后得到内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗 体Fab’片段的冻干脂质体siRNA溶解在DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的双蒸水中，终浓度为20 μ M。然后， siRNA溶液(9 μ 1)用DEPC处理水稀释到一定体积(9 90 μ 1)。对于冻干脂质体，LPL或 LPIL (含有7. 2 72 μ gDC-胆固醇)用一定量的siRNA稀释液(9 90 μ 1)重新水化，室 温静置20分钟就可以得到内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻干 脂质体。对于非冻干脂质体，PL或PIL (9 90 μ 1，包含7. 2 72 μ g DC-胆固醇)与相同 体积(9 90 μ 1)的siRNA稀释液混合，室温静置20分钟。包埋过程在使用前立即进行。利用本发明得到内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻干 脂质体进行了一系列实验，实验结果表明内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体 Fab'片段的冻干脂质体具有良好的HER2细胞靶向性、基因沉默活性和转染效率，达到了本发明的目的。本发明得到的内包裹SiRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻干脂 质体可以用于制备抗肿瘤药物，特别是特异性靶向结合HER2抗原高表达的肿瘤细胞，如乳 腺癌等。
图1，内包裹SiRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻干脂质体的制 备过程示意图。图2，图2-1 连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的脂质体和HER2 Fab，分 子筛分离图；图2-2 未连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的脂质体和HER2 Fab'分 子筛分离图；图2-3 蛋白质电泳证实连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab’片段脂质体的 HER2 Fab，连接。图3，图3-1 :2. 5% PEG LPIL的转染效率；图3-2 4% PEG LPIL的转染效率。图4，图4-1 不同PEG含量的LPIL和PIL的转染效率；图4-2 不同PEG含量的 LPIL和PIL的基因沉默效率。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。人源化抗HER2 单克隆抗体通过 Li B，Wang H, Zhang D, et al. Construction and characterization of a high-affinity humanized SM5-lmonoclonal antibody. Biochem Biophys Res Commun 2007 ；357 (4) :951-6 ^11^ ' , ffi Protein A ￠^ 达人源化HER2单克隆抗体的CHO细胞(中国仓鼠卵巢癌细胞)的细胞上清进行亲和层析 后得到。抗 ΗΕΚ2 ^ ，片段通过 GaoJ，Kou G，Wang H, et al. PE38KDEL_loaded anti_HER2 nanoparticles inhibitbreast tumor progression with reduced toxicity and immunogenicity. Breast Cancer Res Treat 2008 ;115 :29-41 提供的方法得到。FAM-siRNA, NC-siRNA、HER2_siRNA 均购自上海吉玛制药公司其他原料和试剂未标明来源的均为市售。实施例1 内包裹SiRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻干脂质 体的制备PEG 化的 DC-Chol/D0PE 免疫脂质体(PIL)的制备DC_chol，DOPE, Mal-PEG-DSPE 和 mPEG-DSPE 以摩尔比 5-0. 5X) (49. 5-0. 5X) 1 X 代表 mPEG-DSPE 在总脂 质(总脂质的量为8μ mol)中的摩尔比，X的值取0.5,1,1. 5,2,2. 5，3，则总PEG的含量占 总脂质的1.5%，2%，2.5%，3. 5%，4%)组成的多室脂质体通过脂质-薄膜水化法制备，首 先将将8 μ mol的总脂质加入到2ml的氯仿之中，37°C水浴旋蒸30 35min，成膜后用N2吹 尽痕量氯仿，得到干燥的脂质薄膜。脂质膜用Iml的IOmM的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7. 4) 水化来形成多室脂质体，形成的多室脂质体通过室温手握式挤出器(Avestin，Ottawa)挤 出形成单室纳米级脂质体，挤出过程是通过逐渐减小膜的孔径大小(从200，100和80nm) (Nucleopore, Whatman)来进行的，每个孔径循环挤出十次。另外，抗-HER2 Fab，通过与亚氨 基噻吩盐酸盐2-iminothiolane以摩尔比100 1 (2-iminothiolane :Fab，)进行巯基化，抗-HER2 Fab，的巯基个数通过Ellman，S法来测定。然后，巯基化的抗-HER2 Fab，与制备好 的包含马来酰胺基团的脂质体以摩尔比1/10(抗-HER2 Fab，/Mal-PEG_DSPE，包含马来酰 胺基团的脂质体即上述的单室纳米级脂质体)相混合，混合物在有氮气的情况下室温孵育 2小时得到PIL。未结合的抗-HER2 Fab’用PBS作为洗脱液的葡聚糖凝胶G_75 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)的凝胶层析方法去除。得到的PIL收集在外水体积部分，用0. 22 μ m滤膜 除菌，4°C保存。非靶向PEG化的DC-Chol/DOPE脂质体(PL)通过和PIL相同的方法制备， 除了 Mal-PEG-DSPE用mPEG_DSPE代替。磷脂浓度通过硫氢铁铵方法测定。DC-胆固醇浓度 通过相应的磷脂浓度计算。低压冻干PIL(LPIL)或冻干PL(LPL)，冻干的具体步骤为DC-胆 固醇浓度为0. 8 μ g/ μ 1的PIL或PL与5. 4 μ g/ μ 1蔗糖(蔗糖终浓度为9%，重量/体积 比)混合，VirTiS Advantage Benchtop Freezer冻干机冻干16 18小时，整个冻干过 程包括预冻过程和冷冻干燥过程。预冻过程在低于_40°C下冷冻，时间不少于60min ；冷冻 干燥过程温度按从_40°C按5°C逐渐升高至室温，每个阶段干燥时间为30min 180min，真 空度为50mTorr 200mTorr。制备示意图见图1。siRNA(可以为FAM_siRNA或NC-siRNA 或HER2-siRNA)溶解在DEPC处理过的双蒸水中，终浓度为20 μ Μ。然后，siRNA溶液(9 μ 1) 用DEPC处理水稀释到一定体积(9 90 μ 1)。对于冻干脂质体，LPL或LPIL (含有7. 2 72 μ gDC-胆固醇)用一定量的SiRNA稀释液(9 90 μ 1)重新水化，室温静置20分钟就可 以得到内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab’片段的冻干脂质体。对于非冻 干脂质体，PL或PIL (9 90 μ 1，包含7. 2 72 μ g DC-胆固醇)与相同体积(9 90 μ 1) 的siRNA稀释液混合，室温静置20分钟。包埋过程在使用前立即进行。通过kta Sizer 3000HS粒径仪测量PIL的粒径为150nm。实施例2 脂质体表面HER2 Fab，的测定试验HER2 Fab，连接到脂质体表面后，用SDS-PAGE (十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 电泳法)验证其表面的连接量和完整性。凝胶在160v恒压条件于Tris-甘氨酸-十二烷 基磺酸钠缓冲液中进行电泳，然后用考马斯亮蓝染色、脱色，最后干胶。结果如图2-1和2-2所示，两峰完全分离开来，说明PIL或PL能够分离出游离HER2 Fab，抗体.由于拖尾峰包含游离HER2 Fab，抗体，而PIL相比PL而言，拖尾峰更低，结果表 明HER2 Fab，抗体确实通过Mal-PEG-DSPE连接到脂质体上。此结果是针对含2. 5% PEG的 PL 和 PIL 而言的，而对于含 1. 5% PEG,2% PEG,2. 5% PEG,3% PEG,3. 5% PEG,4% PEG(分 别和实施例1中X取值0. 5、1、1· 5、2、2· 5、3相对应)而言均得到相似的结果。HER2 Fab， 抗体在脂质体表面的连接量和完整性通过SDS-PAGE得到验证(结果见图2-3，对比未做处 理的HER2 Fab，抗体(泳道1- ，PIL表面的HER2 Fab，抗体的分子量更大些(泳道4_9)， 可以得出结论，HER2 Fab'抗体通过Mal-PEG-DSPE连接到脂质体上后在凝胶中泳动速率变 慢，LPIL也得到相似的结果，表明了冻干程序并没有破坏HER2 Fab，抗体的连接，但是HER2 Fab'抗体并没有连接到不含马来酰胺连接键的PL或LPL上。利用包裹siRNA后的PIL、PL、LPIL(实施例产品)进行试验，结合也和以上结果相 同。实施例3 体外转染试验转染效率的分析实验按下述步骤进行SK_BR3细胞(购自美国ATCC，ATCC号 HTB30)于48孔板中以6X IO4个细胞/孔的密度培养过夜，将实施例1得到的内包裹
6FAM-siRNA的脂质体与细胞(每孔0. 4ug siRNA, siRNA最终浓度为IOOnM)孵育6小时后 用胰蛋白酶消化，洗涤，用流式细胞仪进行荧光计数。基因沉默效率的分析实验按以下步骤进行SK_BR3细胞于48孔板中以6X IO4个 细胞/孔的密度培养过夜，将实施例1得到的内包裹NC-siRNA或HER2-siRNA的脂质体与 细胞(每孔0. 4ug siRNA, siRNA最终浓度为IOOnM)孵育6小时后更换新鲜的细胞培养液， 48小时后，用胰蛋白酶消化细胞，洗涤后加入C225(抗体药物国家工程研究中心提供)(终 浓度为5ug/ul)于4°C共孵育45min，洗涤细胞，加入FITC标记的羊抗人IgG(H+L)于4°C共 孵育30min，洗涤细胞，FCM检测细胞表面HERl表达。由于HERl在HER2过表达的SK-BR3 细胞表面适度表达，并且能够用FCM很容易检测蛋白表达，故HERl常在基因沉默分析中作 为一个理想的靶点(C225的作用来源于此)。另外，siRNA用Lipo2000按照生产化标准步骤进行转染，所有siRNA的转染除特 殊说明外均用含10% FBS细胞培养液进行。结果显示，不同DC-chol/siRNA质量比下脂质体的转染效率为了获得最好的脂 质体转染效率，应该对阳离子脂质和siRNA的质量比(或摩尔比)进行优化，之所以选择 一系列的DC-chol/siRNA的质量比是因为比例太低导致不稳定的脂质体-siRNA复合物形 成且转染效率低，当比例太高时形成了过量的复合物也呈现下降的转染效率，如图3所示， LPIL的转染效率在每一个比例时均高于PIL，这表明冻干再水化法能显著的提高PIL的转 染效率。LPIL和PIL的转染效率均高于各自的对照(LPL和PL)，这表明连有HER2 Fab，抗 体能显著提高脂质体与过表达HER2抗原细胞的亲和力。而且所有脂质体的转染效率并不 随着DC-chol/siRNA的质量比的增加而增加，并且在DC-chol/siRNA的质量比为10时达到 最大，因此，包封siRNA的LPIL，PIL，LPL，PL如无特别说明均是以DC-chol/siRNA的质量比 为10为标准制备的。PEG化程度对脂质体基因沉默的影响对脂质体进行PEG化是能够延 长半衰期的较为实际的方法，但是PEG化同时也能强烈的降低转染效率。为此，我们制备了 不同PEG含量的脂质体考察PEG化程度对转染效率的影响，结果显示PEG化LPIL的转染效 率并没有降低(图4-1)，含3% PEG LPIL转染效率最低，但是，3. 5% PEG和4% PEG LPIL 的转染效率逐渐增加，PIL的转染效率比LPIL的要低。如图4-2所示，2. 5% PEG LPIL有最 高的HERl基因沉默效率，其它PEG含量的LPIL也显示出了较高的沉默效率。这些结果表 明了对于2. 5% PEG LPIL能够获得更好的基因沉默效率，冻干再水化法、HER2 Fab，抗体、 优化PEG含量均是不可缺少的。
权利要求
1.一种内包裹SiRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻干脂质体。
2.权利要求1所述的内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻 干脂质体，为内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻干的PEG化的 DC-chol/DOPE 脂质体。
3.权利要求2所述的内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻干 脂质体，其中DC-chol/siRNA的质量比为10。
4.权利要求广3任一所述的内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段 的冻干脂质体，其中PEG含量在总脂质中的摩尔比为1. 5%、％。
5.权利要求4所述的内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻干 脂质体，其中PEG含量在总脂质中的摩尔比为2. 5%。
6.权利要求广5所述的任一内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段 的冻干脂质体的制备方法，包括a)用薄膜分散法和抗体连接技术制备人源化抗HER2单克 隆抗体Fab’片连接的脂质体并进行冻干得到冻干脂质体，b)将siRNA和冻干脂质体孵育 后得到内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻干脂质体。
7.权利要求6所述的内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段的冻干 脂质体的制备方法，其中步骤a)中冻干步骤包括预冻过程和冷冻干燥两个过程，预冻过程 在低于-40°C下冷冻，时间不少于60min ；冷冻干燥过程温度按从_40°C按5°C逐渐升高至室 温，每个阶段干燥时间为30min 180min，真空度为50mTorr 200mTorr。
8.权利要求广5所述的任一内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab，片段 的冻干脂质体在制备抗肿瘤药物中的用途，其中肿瘤为特异性靶向结合HER2抗原高表达 的肿瘤细胞。
9.权利要求8所述的用途，其中肿瘤为乳腺癌。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，本发明公开了一种内包裹siRNA外连接人源化抗HER2单克隆抗体Fab’片段的冻干脂质体、其制备方法和用途；本发明公开的冻干脂质体具有良好的HER2细胞靶向性、基因沉默活性和转染效率，可以用于制备抗肿瘤药物，特别是特异性靶向结合HER2抗原高表达的肿瘤细胞，如乳腺癌等疾病。
文档编号A61P35/00GK102100916SQ20091020201
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者孙靖, 李博华, 谈珉, 郭亚军, 陈建明, 高洁 申请人:上海抗体药物国家工程研究中心有限公司