专利名称：一种聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒、其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，更具体地说，本发明公开了一种人源化单克隆抗体修 饰的包裹紫杉醇的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒、其制备和应用。
背景技术：
目前在临床肿瘤治疗和诊断中广泛应用的药物还多数为非选择性药物，有些药物 在常规治疗剂量下即可对正常组织器官产生显著的毒副作用，所以提高药物的肿瘤选择 性，减少其在非靶向部位的聚集是提高抗肿瘤药物疗效的关键。减少药物对非靶向部位的 毒副作用，降低药物治疗剂量并减少给药次数，从而提高药物疗效，这种治疗方法即被称为 肿瘤靶向治疗。现今在肿瘤靶向治疗领域，靶向抗肿瘤纳米药物的研究正日益受到人们的 普遍关注和重视。目前使用最多的靶向抗肿瘤纳米药物的配体是单克隆抗体，单克隆抗体具有 高度特异的结合细胞表面抗原的活性，这种结合不但具有很强的特异性，而且这种结合 的亲和力很高。免疫脂质体可以利用抗体的导向作用，将包裹在脂质体内部的药物定 向引导至目的组织或细胞，发挥药效，实现靶向治疗。SM5-1是一种抗p230抗原的人 源化单克隆抗体，可以特异性地识别并结合于肝癌细胞表面的P230抗原。已有文献报 道P230抗原在许多实体瘤中高表达，如肝癌、黑色素瘤等等(参见文献(iao J, Kou G， Chen H, Wang H, Li B, Lu Y, Zhang D, WangS, Hou S, Qian W, Dai J, Zhao J, Zhong Y, Guo Y. Treatment of hepatocellularcarcinoma in mice with PE38KDEL type I mutant-loaded poly (Iactic-co-glycolic acid)nanoparticles conjugated with humanized SM5-lF(ab' ) fragments. Mol Cancer Ther2008 ;7 :3399-407.)。所以如何利用SM5-1的特异性得到靶向抗肿瘤纳米颗粒是目前技术人员一直着 力解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的申请人进行了大量的实验，利用纳米技术和抗体偶 联技术制备成了 一种人源化SM5-1靶向、包裹紫杉醇的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒。本发明公开了 1、一种内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗 粒；2、制备上述纳米颗粒的方法，包括2. 1用溶剂挥发法制备包裹紫杉醇的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒；2. 2将人源化SM5-1抗体和聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒连接得到免疫脂质 体；3、上述制剂的用途为在高表达P230抗原的肝癌、乳腺癌和黑色素瘤中的应用。
本发明选择具有良好的生物相容性的脂质材料；聚乳酸-羟基乙酸共聚物(以下 简称PLGA)作为制备纳米颗粒的生物相容性脂质材料。本发明的发明人利用本发明得到的内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的靶 向纳米颗粒(以下简称PPS)进行了一系列实验，实验结果表明PPS较非靶向的的包裹紫杉 醇的PLGA纳米颗粒(PP)和单纯紫杉醇显示出更好的抗肿瘤活性，达到了本发明的目的。类似地，利用本发明公开的方法，还可以得到外部连接其它人源化抗体(其它的 片段也可以)的包裹了紫杉醇的PLGA纳米颗粒，这些人源化抗体可以为重组人源化抗HER2 单克隆抗体(rhuMAbHER2)等等。在本发明中，如没有特别说明，PPS指的是本发明公开的内包裹紫杉醇外连接人源 化SM5-1抗体的PLGA纳米颗粒，PP为内包裹紫杉醇的PLGA纳米颗粒。更具体的，上述内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-抗体的PLGA纳米颗粒的制备方 法，包括以下两个步骤(I)采用制备PLGA常见的乳剂-溶剂挥发法来制备包裹紫杉醇的PLGA纳米颗粒；(II)采用化学偶联方法，将人源化SM5-1与包裹紫杉醇的PLGA纳米颗粒连接。其中(I)包裹紫杉醇的PLGA纳米颗粒的制备将溶解于3ml氯仿的90mg PLGA和6mg的紫杉醇溶解于12ml的2% (质量体积 比)的PVA(聚乙烯醇)水溶液形成水包油溶液的乳剂，通过55W的超声输出Omin，冰浴条 件)进行乳化，然后通过磁力搅拌过夜以让氯仿的挥发形成纳米颗粒，最后通过30，OOOrpm 在4°C的条件下离心30min即得到包裹紫杉醇的PLGA纳米颗粒。(II)抗体与包裹紫杉醇的PLGA纳米颗粒的连接1 毫升的 PLGA 纳米球溶液(5 μ g/ μ 1，溶于 pH 6. 3 的 IOmM NaH2P04)禾口 10 μ 1 的 50mg/ml EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、10 μ 1 的 50mg/ml NHS(N_ 羟基 丁二酰亚胺)共同避光孵育20分钟后，30000g离心10分钟后除去上清，然后将溶于50mM HEPES (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)(pH 7. 4)的SM5-1 (1 yg/μ 1)加入到沉淀的纳米球中避光反 应2小时后，离心，水洗后制得连接抗体片段的纳米球(内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1 抗体的PLGA纳米颗粒)PPS。上述偶联反应的温度以室温为宜。本发明还提供了上述靶向靶向纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。特别是特异 性靶向P230抗原高表达的肿瘤细胞，如肝癌、黑色素瘤和乳腺癌等。本发明的靶向纳米颗 粒经体外杀伤肿瘤细胞实验，结果证明生物靶向性良好，体外杀伤靶肿瘤细胞作用显著；同 时对正常细胞毒性作用很小。本发明的靶向纳米颗粒具有主动靶向性，而且减少了紫杉醇 的毒性作用。
图1，内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的PLGA纳米颗粒的制备过程示意 图；图2，内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的PLGA纳米颗粒的体外累积释放曲 线图；图3，内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的PLGA纳米颗粒体外Ch_h印_3细胞毒实验图；图4，内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的PLGA纳米颗粒体外QGY7701细胞
毒实验图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。人源化SM5-1 单克隆抗体通过 LiB，Wang H, Zhang D, et al. Constructionand characterization of a high-affinity humanized SM5—1 monoclonalantibody. Biochem Biophys Res Commun 2007 ；357 (4) :951-6 中提供的方法，用 Protein A 柱对表达 人源化SM5-1单克隆抗体的CHO细胞(中国仓鼠卵巢癌细胞)的细胞上清进行亲和层析后 得到。PLGA纳米颗粒(乳酸和羟基乙酸的摩尔比为50 50，RG503，分子量为40 75kDa)购买自德国 Boehringer Ingelheim 公司。其他原料和试剂未标明来源的均为市售。实施例1 紫杉醇的萃取和定量从PLGA纳米颗粒中提取并对紫杉醇进行定量的方法参考文献 (M.D.Chavanpatil. Susceptibility of nanoparticle-encapsulated paclitaxel toP-glycoprotein-mediated drug effluxetal. Int J Pharm 320(2006) 150—156)。 IOmg 的PLGA纳米颗粒加入Iml的甲醇进行提取，放入到振荡器中以IOOrpm的速度摇晃48小 时。紫杉醇标准品曲线的制作准确量取紫杉醇标准品5mg，用IOml的甲醇溶解后放入 IOml容量瓶中，制成500yg/ml的紫杉醇对照品储备液。分别吸取0. 1,0.2,0.4,0.6, 0. 8，1. Oml对照品储备液，用甲醇定容于5ml的容量瓶中，制成浓度分别为10，20，40， 60,80,100yg/ml的标准液，作为制标准曲线时使用。紫杉醇定量的色谱条件色谱柱 phcnomenexC18O50mmX4.60mm，5ym)，甲醇-水(65 35)为流动相，流速 0. 7ml/min，检 测波长227nm，柱温25°C。采用外标峰面积法进行定量分析。实施例2 内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的PLGA纳米颗粒的制备将溶解于3ml氯仿的90mg PLGA和6mg的紫杉醇溶解于12ml的2% (质量体积比) 的PVA (聚乙烯醇)水溶液来形成水包油溶液的乳剂，通过55W的超声输出Omin，冰浴条 件)进行乳化，然后通过磁力搅拌过夜以让氯仿的挥发形成纳米颗粒。最后通过30，OOOrpm 在4°C的条件下离心30min即得到包裹紫杉醇的PLGA纳米颗粒PP。将1毫升的PLGA纳米 球溶液(5μ g/μ 1，溶于 ρΗ6· 3 的 IOmM NaH2PO4)禾口 10 μ 1 的 50mg/ml EDC (1-(3-二 甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亚胺)、10 μ 1的50mg/ml NHS (N-羟基丁二酰亚胺)共同避光孵育20 分钟后，30000g离心10分钟后除去上清，然后将溶于50mM HEPES (4-羟乙基哌嗪乙磺酸) ((pH 7. 4)的人源化单克隆抗体SM5-1 (如果制备内包裹紫杉醇的连接SM5-1抗体的PLGA 纳米颗粒用anti-⑶25 Fab’代替SM5-1) (1 yg/μ 1)加入到沉淀的纳米球中避光反应2小 时后，离心，水洗后制得内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的PLGA纳米颗粒PPS。上述 偶联反应的温度以室温为宜。制备示意图见图1。通过kta Sizer 3000HS粒径仪测量PPS的粒径，内包裹紫杉醇外连接人源化 SM5-1抗体的PLGA纳米颗粒的平均直径为178. 6士25. 9nm(mean士SD ；η = 10)。
实施例3 内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的PLGA纳米颗粒的体外释放实 验纳米颗粒的药物释放在PBS (0. 15M，含0. 1% Tween 80，pH 7. 4)中进行，将0. 5ml 的纳米颗粒(实验例2获得)(lmg/ml)放置在透析袋(截留分子量为10，OOODa, Piere)， 然后再将透析袋放置在上述IOml的PBS中。将放有IOml PBS的15ml的离心管放置在振 荡器中(lOOrpm，37°C )，然后在不同的时间点取出Iml的PBS，然后将新鲜的PBS补充进去。 然后用HPLC(同实施例1)的方法对PBS中的紫杉醇进行定量。结果在第8天的时候紫杉醇释放了 5%，在第10天释放了 8%，在第25天释放了 30%。详见图2。由图可见内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的PLGA纳米颗粒可满足 作为有效释放系统的需要。实施例4 内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的PLGA纳米颗粒的体外杀伤肿 瘤细胞实验细胞毒性实验通过制造商(ftOmega，Madison, WI)的实验设计以细胞滴定96孔 的非放射性细胞增殖测定试剂盒进行测定(Kou G，*Gao J，Wang H，Chen H，Li B, Zhang D, Wang S, Hou S, Qian W, Dai J, Zhong Y, Guo Y. Preparation andcharacterization of paclitaxel-loaded PLGA nanoparticles coated with cationic SM5-1single-chain antibody. J Biochem Mol Biol 2007 ;40 :731-739.)。在PPS(通过实施例 2 获得)，PP (通过 实施例2获得)和游离紫杉醇条件下，将IX IO4的肝癌细胞(可为高表达p230的CH-h印-3 或不表达P230的QGY7701)于37°C，CO2孵育器孵育48小时后，该法中紫杉醇的测定浓度 从1到2000 μ Μ,然后将20 μ 1MTS/PMS溶液补充到每个孔里，在37°C条件下孵育1 2小 时，在0D490nm/630nm波长以全自动定量绘图酶标仪测定每个孔中样品的吸收度。结果显示，PPS对高表达p230的CH_h印_3 (由第二军医大学国际合作肿瘤研究所 提供)的杀伤力要强于PP和游离的紫杉醇，而在不表达P230的QGY7701 (由第二军医大学 国际合作肿瘤研究所提供)细胞中我们没有看到这样的趋势。详见图3(CH-hep-3)和图 4(QGY7701)。
权利要求
1.一种内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒。
2.权利要求1所述的内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚 物纳米颗粒，其特征在于，所述内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的聚乳酸-羟基乙酸 共聚物纳米颗粒的平均直径为178. 6士25. 9纳米。
3.一种制备权利要求1或2所述的内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的聚乳 酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒的方法，包括a)用溶剂挥发法制备包裹紫杉醇的聚乳 酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒；b)将人源化SM5-1抗体和包裹紫杉醇的聚乳酸-羟基乙酸 共聚物纳米颗粒连接。
4.权利要求3所述的方法，其中步骤a)所述的用溶剂挥发法为将溶于挥发性有机溶剂 的PLGA和紫杉醇溶解于聚乙烯醇水溶液形成水包油溶液的乳剂，乳化后通过搅拌挥发有 机溶剂得到纳米颗粒，最后通过离心即得到包裹紫杉醇的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗 粒。
5.权利要求3所述的方法，其中步骤b)所述的将人源化SM5-1抗体和聚乳酸-羟基 乙酸共聚物纳米颗粒连接包括将PLGA纳米球溶液和1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚 胺、N-羟基丁二酰亚胺共同避光孵育，离心后除去上清，然后将溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸 的SM5-1加入到沉淀的纳米球中避光反应后制得。
6.权利要求1或2所述的内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的聚乳酸-羟基乙酸 共聚物纳米颗粒在制备治疗高表达P230抗原的癌症药物中的用途。
7.权利要求6所述的用途，其中高表达p230抗原的癌症为肝癌、乳腺癌和黑色素瘤。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明公开了一种内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒、其制备方法和应用。本发明公开的内包裹紫杉醇外连接人源化SM5-1抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒具有生物靶向性良好、体外杀伤靶肿瘤细胞作用显著的特点，可以用于制备治疗p230抗原高表达的肿瘤药物。
文档编号A61K9/16GK102100670SQ20091020201
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者侯盛, 张彦, 赵健, 郭亚军, 钟延强, 陈怀文, 高洁 申请人:上海抗体药物国家工程研究中心有限公司