专利名称：一种免疫脂质体、其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，更具体地说，本发明公开了一种单克隆抗体修饰的内 包裹蓖麻毒素的免疫脂质体、其制备方法和用途。
背景技术：
肿瘤是当今严重威胁人类健康的疾病，然而目前在临床肿瘤治疗和诊断中广泛应 用的药物还多数为非选择性药物，有些药物在常规治疗剂量下即可对正常组织器官产生显 著的毒副作用，所以提高药物的肿瘤选择性，减少其在非靶向部位的聚集是提高抗肿瘤药 物疗效的关键。减少药物对非靶向部位的毒副作用，降低药物治疗剂量并减少给药次数，从 而提高药物疗效，这种治疗方法即被称为肿瘤靶向治疗。现今在肿瘤靶向治疗领域，靶向抗 肿瘤免疫脂质体的研究正日益受到人们的普遍关注和重视。目前使用最多的免疫脂质体的配体是单克隆抗体，单克隆抗体具有高度特异的 结合细胞表面抗原的活性，这种结合不但具有很强的特异性，而且这种结合的亲和力很 高。免疫脂质体可以利用抗体的导向作用，将包裹在脂质体内部的药物定向引导至目的 组织或细胞，发挥药效，实现靶向治疗。Cetuximab是一种抗ERBBl抗原的嵌合抗体，可 以特异性地识别并结合于细胞表面的人表皮生长因子I型受体(ERBBl)。已有文献报道 ERBBl在许多实体瘤中高表达，如上皮鳞癌、肺癌、肝癌等等(参见文献Karamouzis MV, Konstantinopoulos PA, Papavassiliou AG. Targeting MET as a strategy to overcome crosstalk-relatedresistance to EGFR inhibitors.Lancet Oncol. 2009Jul ； 10 (7) 709-17.)。免疫毒素是一种由蛋白毒素和靶向性配体(抗体或抗体片断)经基因工程技术融 合形成的融合蛋白。其杀伤肿瘤细胞的机制是通过靶向性配体特异结合细胞上的受体，免 疫毒素被细胞内吞后，蛋白毒素通过抑制蛋白合成促使肿瘤细胞凋亡。然而，免疫毒素临 床治疗肿瘤的效果并未达到令人满意的程度，多数免疫毒素停止于I/II期临床试验。主 要原因如下首先，蛋白毒素具有非特异性肝毒性及血管毒性，极大的限制了免疫毒素的临 床应用；其次由于免疫毒素具有很强的免疫原性，给药后人体内会迅速出现抗毒素中和性 抗体，从而限制了其临床的重复应用。因此，在制备免疫毒素时，如何降低蛋白毒素非特异 性毒性、以及降低其免疫原性的敏感性是临床上需要迫切解决的问题。通过前期报道，将 蛋白毒素进行纳米材料进行包裹后可以有效的解决其非特异毒性和免疫原性(参考文献 Gao J, Kou G, Wang H, Chen H, Li B, Lu Y, Zhang D, Wang S, Hou S, Qian W, Dai J, Zhao J, Zhong Y, Guo Y.蓖麻毒素-loaded anti_HER2nanoparticles inhibit breast tumor progression with reduced toxicity andimmunogenicity. Breast Cancer Res Treat 2009 ；115 :29-41.)。如何利用免疫毒素和抗EGFR抗体得到靶向的免疫脂质体一直是近期本领域技术 人员的研究课题。
发明内容
本发明的申请人进行了大量的实验，利用脂质体纳米技术和抗体偶联技术制备了 一种内包裹包蓖麻毒素外连接抗EGFR抗体的PEG免疫脂质体，具有靶向性，并保持蛋白毒 素在制备过程中结构不受破坏、活性不会丧失。本发明公开了 1、一种内包裹蓖麻毒素外连接抗EGn 抗体的靶向PEG免疫脂质体。2、制备上述内包裹蓖麻毒素外连接抗EGFR抗体的靶向PEG免疫脂质体的方法，包 括2. 1用薄膜分散法包裹蓖麻毒素形成脂质体；2. 2制备巯基化的抗体；2. 3用巯基化的抗体和脂质体连接得到内包裹蓖麻毒素外连接抗EGFR抗体的靶 向PEG免疫脂质体；3、上述内包裹蓖麻毒素外连接抗EGFR抗体的靶向PEG免疫脂质体的用途为在高 表达ERBBl的肺癌、乳腺癌和结直肠癌中的应用。在本发明中，如没有特别说明，RI-LIP-CE指的是本发明公开的内包裹蓖麻毒素外 连接抗EGFR抗体的靶向PEG免疫脂质体，RI-LIP为包裹蓖麻毒素的PEG脂质体。本发明选择具有良好的生物相容性的脂质材料即CHOUcholesterol，胆固醇)、 EPC (egg phosphatidylcholine,蛋黄卵憐月旨)、IiiPEGkioo-DSPE (1，2-Distearoyl-sn—Gly cero-3-Phosphoethanolamine [methoxy (polyethyleneglycol) -2000],甲氧基聚乙 二酉享 2000- 二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺)，和 Mal-PEG2cicitl-DSPE (1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide (poly (ethylene glycol)) -2000,乙 二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)作为制备脂质体的生物相容性脂质材料。本发明公开了上述RI-LIP-CE制备方法，简要的说，包括以下两个步骤(I)采用脂质体常见的薄膜分散法来制备包裹蓖麻毒素的含马来酰亚胺基团的 PEG化脂质体，制备脂质体的材料为EPC、CHOL、mPE(i2(1(1(1-DSPE、Mal-PE(;2(1(1(1-DSPE以摩尔比为 2. 5 1. 5 0. 12 0. 04 混合；(II)采用化学偶联方法，将Cetuximab与包裹蛋白毒素的脂质体连接，连接基团 为巯基和马来酰亚胺基团。详细步骤如下(A)含马来酰亚胺基团的PEG化脂质体的制备Mf EPC、CH0L、mPEG2000-DSPE、Mal-PEG2000-DSPE 以摩尔比为 2.5 1.5 0.12 0.04，溶于适量的氯仿溶液，通过旋蒸制成脂质薄膜。将所制得的脂 质薄膜以蓖麻毒素溶液充分水化，制得脂质体混悬液，再以薄膜挤出器过膜，将收集到的样 品浓缩后得到脂质体混悬液。(B)抗体的巯基化及巯基化的抗体与脂质体的连接1 ;^ (Mamot C, Drummond DC, Greiser U, Hong K, Kirpotin DB, MarksJD, Park Jff. Epidermal growth factor receptor (EGFR)-targeted immunoliposomesmediate specific and efficient drug delivery to EGFR—and EGFRvIII-overexpressingtumor cells. Cancer Res. 2003 Jun 15 ；63(12) :3154-61.).先用 2-iminothiolane· HCl (2-亚氨基硫烷盐酸盐)将Cetuximab进行巯基化，然后将巯基化后的抗体和脂质体进行抗体连接 制备得到PEG化免疫脂质体。上述偶联反应的温度以室温为宜。类似地，利用本发明公开的方法，还可以得到外部连接其它抗体(其它的片段 也可以)的包裹了蓖麻毒素的脂质体，这些抗体可以为重组人源化抗HER2单克隆抗体 (rhuMAbHER2)等。相应地，利用本发明公开的方法，还可以利用脂质体包裹其他类型的毒素然后再 在其外部连接抗体得到各种脂质体，这些毒素可以为绿脓杆菌外毒素、白喉毒素等。本发明还提供了上述RI-LIP-CE在制备抗肿瘤药物中的应用，特别是特异性靶向 抗原ERBBl高表达的肿瘤细胞，如肺癌、结直肠癌和乳腺癌等。本发明的脂质体经体外杀伤 肿瘤细胞实验，结果证明生物靶向性良好，体外杀伤靶肿瘤细胞作用显著，显示出更好的抗 肿瘤活性。
图1为本发明的RI-LIP-CE及其未连接抗体的脂质体RI-LIP的粒径分布图，其中 图1-1为RI-LIP-CE的粒径分布图，图1-2为RI-LIP的粒径分布图；图2为本发明的RI-LIP-CE制备示意图；图3为本发明的RI-LIP-CE体外累积释放曲线图；图4为本发明的RI-LIP-CE体外细胞毒实验图，其中图4_1为对ERBBl抗原高表 达的MDA-MB-231细胞的杀伤实验结果；图4_2为对ERBBl抗原低表达的SK-BR3细胞的杀 伤实验结果。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，不应理解为对本发明的限制。MDA-MB-231 细胞(ATCC 号 HTB-26)SK-BR3 细胞(ATCC 号 HTB-30)实施例1 蓖麻毒素Ricin的分离纯化Ricin是从一种称为蓖麻(Ricinus communis)的植物所萃取出来的毒素，又称蓖 麻毒蛋白，按照文献 Song S, Xue J, Fan K, et al. Preparation andcharacterization of fusion protein truncated Pseudomonas Exotoxin A( MMMM ) inEscherichia coli. Protein Expr Purif 2005 ；44 :52-57.中公开的方法制备蓖麻毒素。实施例2 包裹Ricin的PEG化脂质体的制备将摩尔比为2. 5 1.5 0. 12 0.04 的 EPC、CHOL, mPEG2000-DSPE, Mal-PE(i2_-DSPE (总摩尔数为50ymol)溶于2. 5ml的氯仿溶液，将溶液加入到烧瓶中，充 入氮气后在真空条件下旋蒸以完全挥去有机溶剂。用MicroBCA法(Pierce公司)精确测 量Ricin的蛋白浓度，浓度范围在5 10mg/ml(水溶液)。将所制得的脂质薄膜以ang/ml 的Ricin溶液充分水化以制得得到脂质体混悬液，再以薄膜挤出器分别过400nm和200nm 的聚碳酸酯膜，然后a%phar0SeCL-4B柱将未被包裹的Ricin除去(以PBS(pH 7.4)为洗 脱液)，用1000，OOODa的超滤离心管将收集到的样品在2000rpm，6°C条件下浓缩后得到磷 脂浓度为15ym0l/ml的脂质体混悬液。未包裹蓖麻毒素的空白脂质体(连接抗体或不连接抗体)的制备方法同上，其唯一区别在于用等体积的水来代替Ricin水溶液。实施例3 抗体的修饰及修饰后的抗体与脂质体的连接(1)巯基化抗体的制备将Iml 的 Cetuximab (美国默克公司)(lmg/ml, PBS, 5mM EDTA, pH = 7. 4)和 2-IT (2-iminothiolane. HCl 2-亚氨基硫烷盐酸盐，75 μ g)混合，反应在室温条件下反应 2h (混合搅拌均勻)，巯基化的抗体通过对PBS透析除去过量的2-IT。(2)免疫脂质体的制备取Iml的包裹Ricin的PEG化脂质体(实施例2产品)和500 μ g巯基化 的Cetuximab混合后，在室温下孵育浊(摇床轻轻振摇)，继而用kphadex G_75柱 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)对游离抗体进行分离后得到RI_LIP_CE。同时，不 连Cetuximab的PEG化脂质体的处理方式除了不加抗体以外，其他的处理方法与连接 Cetuximab的PEG化脂质体完全相同，从而得到未连接抗体的脂质体RI-LIP。本发明的RI-LIP-CE及其未连接抗体的脂质体RI-LIP的粒径分布见图1。粒径测 定方法取10μ1的脂质体用去离子水溶解后，直接在仏切sizer Nano S仪器上测量即可 (Malvern instruments, UK)。实施例4 =RI-LIP-CE的体外释放实验准确量取3个不同批次的RI-LIP-CE (实施例3产品)15. 03 15. 09mg分别置 于1000，OOODa的20ml超滤离心管中，加入一定量的PBS (pH 7. 4，含0. 02 %叠氮钠)为释 放介质，置于恒温水浴摇床中，在IOOrpm振荡速度、37°C 士0. 5°C温度条件下脂质体的体外 释放度测定。测定方法如下在1、2、4、6、9、12和Mh的不同时间点，取出超滤离心管后， 在2000rpm，4°C条件下离心20min，吸出下清液，然后用PBS将超滤离心管中的PBS补足，再 以MicroBCA法测定下清液中Ricin的含量。在不加mPE(i2(1(1(1-DSPE和Mal_PEG2__DSPE的 情况下，以一般脂质体作为对照，一般脂质体制备过程如下将摩尔比为2. 5 1.5&EPC、 CHOL (总摩尔数为50 μ mol)溶于2. 5ml的氯仿溶液，将溶液加入到烧瓶中，充入氮气后在真 空条件下旋蒸以完全挥去有机溶剂。用MicroBCA法(Pierce公司)精确测量Ricin的蛋 白浓度，浓度范围在5 10mg/ml (水溶液)。将所制得的脂质薄膜以2mg/ml的Ricin溶液 充分水化以制得得到脂质体混悬液，再以薄膜挤出器分别过400nm和200nm的聚碳酸酯膜 即可得到一般脂质体。结果一般脂质体在各取样点的累积释放百分比依次为21. 68士5. 27， 49. 69士8. 64,57. 64 + 9. 36,72. 14士5. 49,82. 94 + 8. 64,89. 31 士9. 64,97. 86士2. 36 (η =3) ；RI-LIP-CE在各取样点的累积释放百分比依次为:6. M士3. 14，12. 49士3. 87， 15. 49士5. 64，18. 97士5. 67,21. 49士3. 77,25. 28士5. 49,34. 77士6. 88 (n = 3)，详见图 3。由 图可见所制备的包裹Ricin的PEG化免疫脂质体制剂可满足作为有效释放系统的需要。实施例5 =RI-LIP-CE的体外杀伤肿瘤细胞实验细胞毒性实验通过制造商(ftOmega，Madison, WI)的实验设计以细胞滴定96孔 的非放射性细胞增殖测定试剂盒进行测定(Kou G，*Gao J，Wang H，Chen H，Li B, Zhang D, Wang S, Hou S, Qian W, Dai J, Zhong Y, Guo Y. Preparation andcharacterization of paclitaxel-loaded PLGA nanoparticles coated with cationic SM5-1single-chain antibody. J Biochem Mol Biol 2007 ；40 :731-739.)。在 RI-LIP (实施例 3 制备)、RI-LIP-CE(实施例3制备)、游离蓖麻毒素(实施例1制备)或空白脂质体的条件下，将 IXlO4的乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞或SK-BR3细胞)于37°C，CO2孵育器孵育48小时 后，该法中蓖麻毒素的测定浓度从1到20，OOOpM0将不含蓖麻毒素的空白PEG化的脂质体 和PEG化脂质体(RI-LIP-CE和RI-LIP)在最高总脂浓度条件下的孵育48小时后来测定脂 质体的细胞毒性，然后将20 μ 1 MTS/PMS溶液补充到每个孔里。在37°C条件下孵育1 2 小时，在0D490nm/630nm波长以全自动定量绘图酶标仪测定每个孔中样品的吸收度。
结果显示，RI-LIP-CE对MDA-MB-231的杀伤力要强于RI-LIP和游离的蓖麻毒素， 详见图4。
权利要求
1.一种内包裹蓖麻毒素外连接抗EGFR抗体的靶向PEG免疫脂质体。
2.制备权利要求1所述的内包裹蓖麻毒素外连接抗EGFR抗体的靶向PEG免疫脂质体 的方法，包括a)用薄膜分散法包裹蓖麻毒素形成脂质体；b)制备巯基化的抗体；c)用巯基化的抗体和脂质体连接得到内包裹蓖麻毒素外连接抗EGFR抗体的靶向PEG 免疫脂质体。
3.权利要求2所述的内包裹蓖麻毒素外连接抗EGFR抗体的靶向PEG免疫脂质体的制 备方法，其中步骤a)中制备脂质体的材料为EPC、CHOL, mPEG2000-DSPE, Mal-PEG2ticici-DSPE。
4.权利要求3所述的内包裹蓖麻毒素外连接抗EGFR抗体的靶向PEG免疫脂质 体的制备方法，其中步骤a)中EPC、CHOL, mPEG2000-DSPE, Mal-PEG2000-DSPE以摩尔比为 2. 5 1. 5 0. 12 0. 04 混合。
5.权利要求1所述的内包裹蓖麻毒素外连接抗EGFR抗体的靶向PEG免疫脂质体在制 备治疗高表达ERBBl疾病的药物中的用途。
6.权利要求5所述的用途，其中高表达ERBBl疾病为肺癌、乳腺癌和结直肠癌。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明公开了一种内包裹蓖麻毒素外连接抗EGFR抗体的靶向PEG免疫脂质体、其制备方法和应用。本发明公开的内包裹蓖麻毒素外连接抗EGFR抗体的靶向PEG免疫脂质体具有生物靶向性良好、体外杀伤靶肿瘤细胞作用显著的特点，可以用于制备治疗ERBB1抗原高表达的肿瘤药物。
文档编号A61K38/16GK102100669SQ20091020201
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者张大鹏, 戴建新, 李彩辉, 王皓, 赵健, 郭亚军, 钟威, 钟延强, 高洁 申请人:上海抗体药物国家工程研究中心有限公司