专利名称：用于治疗血管病的hmgb1蛋白抑制剂和/或拮抗剂的制作方法
用于治疗血管病的HMGB1蛋白抑制剂和/或拮抗剂本申请是申请日为2002年3月12日、申请号为02806567. 0、发明名称为"用于治
疗血管病的HMGB1蛋白抑制剂和/或拮抗剂"的发明专利申请的分案申请。 本发明涉及分子生物学领域，特别是使用HMGB1蛋白抑制剂和HMGB1拮抗剂治疗
血管病，包括由于血管成形术引起的血管病。 HMGB1蛋白(在2001年前称作HMG ;Bustin， 2001， TrendsBiochem. Sci. ，26， 152-153)是HMG盒家族的原形蛋白，其特征在于存在称作HMG盒的DNA结合区。HMG1是一 种小的25KD蛋白，有215个氨基酸，在哺乳动物中有一个高度保守的序列。HMGB1分子被组 织划分成三个区两个DNA结合区，HMG盒A和盒B，它们后面是由30个谷氨酸和天冬氨酸 的残基组成的COOH酸性末端。盒A和盒B是具有80个氨基酸的片段(29%相同的，65% 相似的)，有一个L形状的三维结构(Hardman等人，1995， biochemistry, 34 :16596-16607 ; Read等人，1993， Nucleic Acids Res. ， 21 :3427-3436 ;Weir等人，1993， EMBO J. ， 12 : 1311-1319)。 HMGBl原来被认为是一种遍在表达的大量的核蛋白。它在每一个核里面超过了 1 百万个拷贝，且非序列特异性结合双链DNA。然而，HMGBl与特定的DNA结构结合有很强的 亲和力，例如扭折或弯曲DNA和四向连接体(four-way junctions)。然而HMGBl通过与几 个不同的DNA结合蛋白的相互作用能被招募到双链DNA上。当结合到双链DNA上时，它诱 导了结构变形，允许核蛋白复合物的形成，在这种情况下，几个DNA结合蛋白彼此间相互接 触，而同时又结合到各自的DNA相关位点上(Miiller等人，2001，EMB0 J. ，16 :4337-4340和 其它此处引用的参考文献)。他8131-/-小鼠的表型与此模型一致(Calogero等人，1999， Nat. Genet. ，22 :276-280)。 最近HMGBl在细胞核外的另一个作用引起了注意HMGB1在内毒素引发的致死现 象以及小鼠中急性肺炎中作为晚期介质物；同时在败血病人血清中HMGBl水平升高是一个 预测标志(国际专利申请号W000/47104)。 HMGBl能够由培养的巨嗜细胞和垂体细胞应激 于细胞因子和细菌内毒素而分泌(Abraham等人，2000， J. Immunol. ，165 :2950-2954 ;Wang 等人，1999， Surgery (St. Luis) ， 126 :389-392 ;Wang等人，1999， Science, 285 :248-251) HMGBl从鼠红白血病细胞中的释放与细胞的分化是相关的，在这些细胞上发现蛋白质以细 胞膜结合的形式存在(Passalacqua等人，1997，FEBSlett. ，400 :275-279 ;Sparatore等人， 1996， Biochem. J. ，320 :253-256). —种称作amphoterin的蛋白，与HMGBl序列相同，已经
在大脑中被发现，那里它被发现存在于神经元细胞的细胞质和细胞核中以及在细胞外的空 间中。如果外源地加入，HMGBl调节神经突的突起，成神经细胞瘤和神经胶质瘤的层粘连 蛋白依赖性迁移就会被HMGBl的抗体抑制(Fages等人，2000， J. Cell Sci. ， 113 :611-620 ; Merenmies等人，1991， J. Biol. Chem. ，266 :16722-16729 ;Parkkinen等人，1993， J.Biol. Chem. ，268 :19726 :19738 ;Rauvala等人，1988， J. Cell Biol. ，107 :2293-2305)。 HMGBl和 纤溶酶原激活系统，特别是和t-PA(组织型血纤维蛋白溶酶原活化因子)的相互作用增强 了纤溶酶的形成(Parkkinen和Rauvala， 1991， J. Biol. Chem. ，266 :16730-16735)。细胞夕卜 的基质蛋白的降解在细胞迁移过程中是很重要的一个步骤，由HMGBl促进的细胞外蛋白酶活性增加能够使细胞迁移。 HMGB1被鉴定为一种结合RAGE受体(高级糖化终产物的受体)的配体(Hori等人，1995' J. Biol.Chem. ，270 :25752-25761)。 RAGE是免疫球蛋白超家族的多配体受体，可以在很多细胞类型中被表达，包括内皮细胞、平滑肌细胞、单核吞噬细胞和神经元(Brett等人，1993， Am. J. Phathol. ， 143 :1699-1712 ;Ne印er等人，1992， J. Biol. Chem. ， 267 :14998-15004)。它参与几种不同的病理过程，例如糖尿病，淀粉样变性，和动脉粥样硬化(Schmidt等人，1999， Circ. Res. ，84 :489-197) 。 HMGB1和RAGE的相互作用诱导神经突突起，这两种蛋白在胚胎发育中共同定位在不断延伸的神经突的前沿(Huttunen等人，1999，J. Biol. Chem. ，274 :19919-19924)。可以观察到阻止HMGB1和RAGE的相互作用能抑制肿瘤块的生长和迁移；这种相互作用的抑制能够抑制促分裂原活化蛋白(MAP)激酶的激活和基质金属蛋白酶的表达，这些分子与肿瘤的增殖和侵入十分相关(Taguchi等人，2000，Nature, 405 :354-360)。 而且，已知HMGB1的抑制剂(即Glicyrrhizin)可以用作抗炎剂。(Sakamoto等人，2001， Biol. Pharm. Bull. ， 24 (8) ， 906-911 ;Yoh等人，2002， Dig. Dis. Sci. ，47(8)，1775-1781)。 本发明的发明人证明HMGB1对平滑肌细胞(SMC)具有有力的生物学作用，平滑肌细胞是其中RAGE表达在表面上的细胞类型中的一种。血管SMC细胞是大血管中最多的细胞；它们位于血管中膜，血管中膜内嵌在细胞外基质中。在完整血管中，SMC细胞处于一种收縮状态，显示了一种表型，即不具有负责血管壁的刚性和弹性的维持和血压控制的细胞分裂和迁移。 机械或炎症损伤后，当内皮被破坏，SMC细胞转变成一种合成表型，经历细胞分裂和细胞迁移。SMC细胞从血管中膜迁移到血管内膜，导致了内膜增厚，在很多血管疾病的病理生理学中起到了一个重要的作用，例如冠状血管成形术后的动脉粥样硬化和再狭窄。在合成状态，SMC也产生了大量的细胞外蛋白酶、生长因子和细胞因子，分泌一种纤维状的细胞外基质。血管壁受伤以后，几种生长因子和/或化学引诱物通过循环单核细胞、巨嗜细胞和血小板或者通过损伤的内皮细胞的释放能够诱导SMC细胞从收縮转变到合成表型，它能够指引SMC细胞朝着血管内膜迁移。在这些因子中，bFGF是最重要的因子之一，但是，SMC细胞也能够应激于生血管剌激物而开始迁移。(Schwartz, 1997， J. Clin. Invest. ，99 :2814-2816 ;Van Leeuwen，1996， Fibrinolysis,10 :59-74)。 试图去定义HMGB1诱导RSMC细胞迁移的作用和机制，发明者证明HMGB1是一种强的化学引诱物，它能够诱导它们的细胞形状改变和细胞骨架再组织。这些情况通过加入一种抗RAGE的抗体和通过百日咳毒素被抑制，暗示RAGE和Gi/o蛋白都可能参与该通路。此外，HMGB1促进磷酸化ERK1和2蛋白迁移到细胞核中的证据表明涉及MAP激酶通路。接着，证明了 HMGB1由很多损伤或坏死细胞类型释放出来，包括内皮细胞。 因此，HMGB1具有一个在血管损伤后能够促进动脉粥样硬化和再狭窄的分子的所有特点。 发明者也证明了HMGB1片段(相应于HMG盒)比完整的全长分子具备更高的效能，
甚至HMG盒家族的其它蛋白质的HMG盒功能域也能够诱导出相同的作用。 结果，能阻断HMGB1和它的RAGE受体之间的相互作用的每一种分子(即属于抑制
4剂类别的全部分子抗体或抗体片段，四向(fouriay)DNA ;属于HMG盒拮抗物类别的全部
分子包含HMG盒功能域的HMGBl片段分子)能有效地用于药理制剂生产以避免、延缓或者
抑制血管上皮损伤引起的甚至由于血管成形术引起的动脉粥样硬化和再狭窄。 HMGBl结合分子或HMGBl抑制剂可以由用于血管成形术手术的器械注射或释放，
或者所述的分子能够被结合到器械的表面上。 本发明的目的是提供能阻断HMGBl和RAGE的相互作用的分子在用于治疗血管疾病的治疗剂的制备中的用途。 在本发明的优选实施方案中，所述的分子在所述的手术中或手术后从导管、外科器械或血管成形术的支架中释放出来。 结合附图和下面详细的描述，本发明进一步的特点和优点将会更加地清楚。
在附图中
图1显示了使用改进的Boyden室完成的趋化性分析中HMGBl对RSMC的趋化活性。100%值对应的是在没有任何剌激物的条件下迁移的细胞数(随机细胞迁移)。数值代表平均值士SD(n = 3)。图1-A显示了 RSMC对从小牛胸腺中提纯的HMGBl的浓度依赖的迁移反应。图1-B显示了纯化自小牛胸腺或表达于酵母中的HMGBl蛋白与化学引诱物预LP和bFGF的趋化作用比较。图1-C显示了抗HMGBl的抗体对预LP-和HMGBl-诱导的迁移的作用。星号(*)表示这样的处理，即其中，student's t-检验中，迁移反应与对照的统计学差异大于P = 0. 0001。图l-D显示了 RSMC对在酵母(巴斯德毕赤氏酵母(pichiapastoris))表达的HMGBl的浓度依赖性迁移反应。 图2显示了 HMGBl对RSMC形态学和细胞骨架组织的作用。图2_A显示了从小牛胸腺提纯或在酵母中或大肠杆菌中表达的HMGBl对RSMC的亚汇合(subconf luent)培养的作用。使用TRIC-毒伞素可以看到肌动蛋白丝。图2-B显示了抗HMGBl兔抗体如何抑制HMGBl剌激的细胞骨架再组织。静息细胞(状态l)显示了许多应力纤维。非静息细胞(状态2)显示了肌动蛋白细胞骨架的再组织。 图3显示了 RSMC对HMGBl的HMG盒功能域的趋化性反应。图3_A显示了对盒B和(e)盒A的浓度依赖反应，盒A和盒B都在大肠杆菌中得到表达。随机的细胞迁移设为100%迁移。数据代表平均值士SD(n = 3)。对于盒A和盒B两者，ANOVA模型中结果的统计学显著性P < 0.0001。图3-B显示了在大肠杆菌中表达的全长HMGBl、盒A+B、盒A或盒B对肌动蛋白细胞骨架组织的作用。使用TRIC-毒伞素可见肌动蛋白丝。
图4显示了 HMGBl和它的HMG盒对RSMC迁移到伤口的影响。数值100%对应于当不存在任何剌激物时细胞迁移的数量(基础迁移)。数据表示平均值士SD(N二5)。 bFGF和细菌制备的全长HMGBl处理的统计学显著性为0. 05 < p < 0. Ol，盒A和盒B处理的O. 01< p < 0. 001，小牛胸腺HMGBl处理的0. 001 < p < 0. 0001。 图5显示了 HMGBl如何结合到RSMC的表面并通过RAGE剌激细胞的运动性。图5-A显示了大量的HMGBl结合到RMSC的表面。在图5_B中显示了表达RAGE的RSMC。图5-C显示了抗RAGE的抗体如何抑制HMGBl诱导的RSMC迁移。HMGBl和加上非特异性抗体的HMGBl的处理的统计学显著性0. 001 < p < 0. 0001。 图6显示了百日咳毒素如何抑制HMGBl诱导的RSMC迁移以及肌动蛋白细胞骨架再组织。在图6-A中显示了使用改进的Boyden室完成的趋化性分析。数值100%对应不存在任何剌激物时基础细胞的迁移；数据表示平均值±SD。图6-B显示了明显的细胞骨架再组织，使用结合的TRITC-毒伞素可以看到肌动蛋白丝。 图7证明了 MAP激酶通路参与HMGBl信号传导。细胞用磷酸化ERK1/2的特异性抗体和DAPI染色，单独细胞样品用TRITC-毒伞素染色以看到细胞骨架的再组织。
图8显示了 HMGBl由坏死和损伤的细胞释放。图8_A显示了由坏死或通透的Hela细胞释放的蛋白质的蛋白质印迹分析结果；在道1和道3， HMGBl的存在是明显的。图8_B显示了坏死和活的Hela细胞的免疫荧光法分析结果。 图9显示了 HMGBl存在于内皮细胞的核中，但是没有在血管SMC的核中。在图
9-A和9-B中显示了 HMGBl存在于内皮细胞的核中，但是在用抗HMGBl的抗体染色和用
ematoxylin复染色的人体胰腺动脉切片的血管平滑肌细胞核中没有发现，以低(A)和高
(B)的放大率表示。红框表示显示在图B中的地区的位置，箭头指向SMC的核。在图9-C中
蛋白质印迹分析显示了 HMGBl在RSMC中的表达水平(与Hela细胞对照)。 图10显示了当抗RAGE抗体(1000ng/ml)存在或不存在的情况下，在使用改进的
Boyden室完成的趋化性分析中HMGBl对小鼠胚胎成纤维细胞的趋化性影响。数值100%对
应于没有任何剌激物时细胞迁移的数量(随机细胞迁移)。数据表示平均值士SD(n = 3)。 HMGBl及其衍生物的表达和纯化 第一步，必须表达和纯化HMGBl及其衍生物。全长HMGBl的表达在被pT7-7-rHMGBlcm质粒转化的大肠杆菌中完成(Prof.J. 0. Thomas所赠，Cambridge University)，纯化遵循一个众所周知的流程完成(Miiller等人，2001， Biochemistry, 40 :10254-10261)。 全长HMGBl在巴斯德毕赤氏酵母中的表达和纯化遵循一个众所周知的流程完成(Mistry等人，1997， Biotechniques， 22 :718-729)。 众所周知的质粒pRNHMGl/Ml-V176、 pT7HMGlbA和pT7HMGlbB被分别用于BoxA+BoxB、BoxA和BoxB的表达和纯化，遵循众所周知的单盒和双盒纯化过程(Bianchi等人，1992， EMBO J. ， 11 :1055-1063)。 为了证明HMGB1的趋化性作用，完成了三个独立的细胞迁移测定趋化性测定、化动性测定和体外创伤测定。研究了非静息细胞的HMGB1诱导的细胞迁移与形态改变(即肌动蛋白纤维再组织、细胞延长和细胞形状极化)之间的功能性关系。
趋化性分析 使用众所周知的流程完成趋化性分析(Degryse等人，1999， Blood，94 :649-662)。采用改进的Boyden室，其带有O. 5um孔径的过滤器(Coring, Acton， MA)，并用纤连蛋白(10ug/ml) (Roche)和胶原蛋白I (100ug/ml，在0. 5M乙酸中)处理。RSMC细胞(Dr.MarcoBertulli所贝曾，Bayer Research Laboratories, Milan)在没有血清的DMEM中培养，20. 000-40. 000细胞样品加入到Boyden室的上孔中。被测的分子在同样的不含血清的介质中稀释，加入到下孔。 使用不同的HMGBl制剂从小牛胸腺纯化的HMGBl (J. Bernu &所赠，C. S. I. C.，
Barcelona, Spain)、大肠杆菌表达的重组HMGBl和在巴斯德毕赤氏酵母上产生的轻微修饰的HMGBl形式(含有结合到N-末端的EAEAYVEF氨基酸)(Mistry等人，1997，Biotechniques, 22 :718-729)。
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如果需要，多克隆的兔抗HMGBl(Pharmingen BD， TorreyPines， CA)、来自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的百日咳毒素(PT) (Dr. M. G. Pizza所赠，I. R. I. S.，Siena)或抑制剂加入到两孔中。 整晚细胞迁移保持在37t:，接着刮掉留在滤器上表面的细胞，滤器在甲醇中固定，用含有10%龙胆紫的20%甲醇溶液进行染色。所有的实验至少做两次，每次三份。
显示在图1-A、1-B、1-C、1-D的结果是在每滤器10高密度区(high power fields)的细胞数目的平均值士SD，以对照的倍数表示。随机细胞迁移(即没有化学引诱物存在时的迁移)给予人为值100%。 用student' s_t检验对处理进行成对比较以进行统计学分析，或者用ANOVA模型评价试剂量不断增加的处理。 来自小牛胸腺的HMGB1以一种浓度依赖的方式剌激RSMC的迁移，在0. lng/ml低剂量时开始，在100ng/ml有2. 5倍最大的响应(图1_A) 。 HMGB1的影响与已鉴定的引诱剂预LP和bFGF的影响在幅度上是可比的(图1-B)。多克隆HMGB1抗体而不是非特异对照抗体能完全阻断迁移响应(图1C)，表明了这特异地归因于HMGB1。这些抗体不能改变作为正对照的化学引诱物预LP肽的影响。采用在巴斯德毕赤氏酵母中产生的重组HMGB1得到了相似的结果(图1-D)。
免疫荧光分析 15. 000-20. OOORSMC(20-40 %汇合)样品在2cm2孔中的玻璃盖玻片上接种，在加入10 % FCS的DMEM中培养24小时，用PBS冲洗，在没有FCS的DMEM中再培养24小时。用100ng/ml HMGB1在37°C以5到120分钟的不断增加的时间间隔剌激RSMC。剌激完后，RSMC用3X低聚甲醛和2X蔗糖的PBS溶液(ffl为7. 5)在室温固定20分钟，接着用0. 2% PBS-BSA清洗三次。用PH7. 4的20mM H印es、300mM蔗糖、50mM氯化钠、3mM氯化镁、0. 5% (V/V) Triton X-100在4。C通透细胞三分钟，用0. 2 % PBS-BSA清洗三次。接着RSMC用2 % PBS-BSA在37 。C孵育15分钟，用初级抗体在37 。C孵育30分钟，0. 2 %PBS-BSA清洗三次，再用2 % PBS-BSA孵育15分钟。最后，细胞用二级抗体和/或结合罗丹明(rodamin)的毒伞素染色以便看到丝状肌动蛋白；在一些情况下，使用DAPI (4'，6_diamidino_2_phenilindolo， Roche)标记核。 所有随后的孵育完成后，盖玻片用0.2% PBS-BSA清洗三次，蒸馏水清洗两次，20 % Mowiol的PBS封固，在Axiophot显微镜下分析(Carl Zeiss)。在用Zeiss40或lOOneofluar透镜的T-Max400或EPH P1600X胶巻(Eastman kodak)拍摄荧光照片。
图2-A低放大率照片显示了应力纤维含量、细胞形状和大小、细胞骨架组织在30分钟内改变，但是120分钟后回复。高放大率照片(图2-B)显示了剌激前许多清晰可见的应力纤维，并且细胞形状是非极性化的。在15-30分钟内，形态和细胞骨架组织完全改变RSMC显示了一种延伸的、极化的形态，这反映出肌动蛋白细胞骨架的空间重组。HMGB1的影响慢慢减弱1-2小时后，应力纤维含量增加回到初始的水平，细胞形态恢复到与未剌激对照细胞相似的程度。 在一些实验中，细胞用抗体或PT或抑制剂预处理一晚。正如在图2-B中所示的，HMGB1抗体完全抑制细胞骨架再组织和由HMGB1诱导的RSMC形态改变。对照抗体不能抑制HMGB1的影响。
最后，为了确定观察到的HMGBl对RSMC的影响是否实际反映从静止状态到运动状态的动态的过渡，对不同状态的细胞的比例进行定量。拍摄了低放大率照片，细胞分成了两种状态-状态l，细胞显示了典型的没有被剌激的细胞的外观，其特征在于有很大数量的应力纤维和非极化的细胞形状；-状态2， RSMC显示了应力纤维低含量、膜变皱、肌动蛋白半环或者一种延长的形状。 图2-C可清楚地看到，非剌激培养中60%细胞处于状态1，40%处于状态2 ;剌激后5分钟内，状态2的细胞的比例增加到60%， 15-30分钟后增加到80%。 HMGB1剌激后一个小时，这些比例恢复到来剌激培养状态的数值，60% RSMC处于状态1和40%处于状态2。这些数据证明了 HMGB1的影响是瞬时的，表现了从静止状态到迁移状态的变化，这些数据证实了趋化性结果HMGB1是一种RSMC的化学引诱物。
体外伤口分析 RSMC的汇合培养，在2-cm2孔中的玻璃盖玻片中生长，用PBS清洗一次，并用无血清匿EM进行FCS饥饿培养24小时。接着剌激伤口 ，用移液管的尖端在单层的中央区域划一条单线。经过处理的单层用PBS清洗一次，在没有血清的培养基中恢复48小时，该培养基含有或不含HMGB1 (100ng/ml)。接着固定细胞，用TRITC-伞毒素染色。通过拍摄低放大率的照片和计数已迁移到无细胞空间的细胞来定量分析迁移。数据代表平均值士SD，数值100%对应无任何剌激物时迁移的细胞数(基础迁移)。 图4显示，HMGB1剌激增加了 5-2倍迁移的细胞数。盒A和盒B(10ng/ml)也被检
测，两者剌激1.8倍细胞迁移。最后，与bFGF的比较表明上面所述的分子是更加有效的。假
定伤口愈合和化学趋化性、化动性可能基于同样的信号传导途径。 信号通路 然后，检测信号通路。 作为一种迁移信号，HMGB1必须到达响应的细胞并结合到受体上。为了检测HMGB1是否结合到RSMC的表面，1百万细胞被胰蛋白酶消化，在含有800ng盒A+B肽和5ug BSA的PBS中于4"培养20分钟。BoxA+BoxB多肽比内源全长HMGB1稍小，很容易在SDS-PAGE凝胶中鉴别。接着细胞成团，保留上清液；在500ul冷PBS中漂洗两次，细胞在SDS-PAGE样品缓冲液中重悬浮，IO(TC加热5分钟，上样至12% tricine-SDS凝胶(line P)，相邻的是20ul上清液(lineS)。接着凝胶印迹到Immobilon滤膜，用印度墨染色。
图5-A显示了 SDS-PAGE凝胶，从中可以计算从细胞团和上清液回收的盒A+B的数量，可以估计在单个RSMC上结合超过500000个盒A+B分子。这一结果证明胞外HMGB1可以结合RSMC，但极有可能没有反映实际的受体数目。实际上HMGB1已经显示能结合到肝素和蛋白聚糖(Bianchi， 1988， EMB0 J. ，7 :843-849 ;Nair和Jungalwala， 1997， J. Neurochem.，68 :1286-1297 ;Salmivirta等人，1992， Exp. CellRes. ，200 :444-451);因而，HMGB1也可能与RSMC产生的细胞外基质相联系，正如发明者在Hela细胞中证明的，其中由于这些细胞产生很少的细胞外基质，所以只有少量的HMGB1结合细胞。 据报道HMGB1结合到许多细胞类型表达的RAGE。为了证明RAGE存在于RSMC膜上，一百万RSMC在包含SDS-PAGE样品缓冲液(50mMra 6. 8的Tris，2% 2_巯基乙醇，4%SDS，12X甘油(glicerol)，0.05X溴酚蓝)的板上裂解，IO(TC变性5分钟，在12%丙烯酰胺上分离。采用含有25mM 5 Tris、0. 192M甘氨酸、20%甲醇的tankblot系统将分离的蛋白质印迹到Immobilon(Millipore)膜。在5%脱脂奶/TBST中于室温阻断印迹一小时(20mM Tris，PH 7. 5， 137mM氯化钠，0. 1 % Tween20) ， TBST漂洗三次，在TBST-0. 01 % BSA中与抗HMGB1抗体孵育。TBST-0.01% BSA漂洗后，用二级抗体进行孵育。使用ECL系统(Amersham)检测蛋白质。使用抗RAGE抗体(Dr. A. M. Schmidt所赠，Columbia University,NY)检测RAGE的存在。图5-B的结果证明了 RAGE存在于RSMC。而且，HMGB1诱导的化学趋化性不但能被抗HMGB1抗体抑制，而且能被抗RAGE抗体抑制，正如图5_C中显示。抗RAGE抗体阻断响应于HMGBl迁移信号的RSMC细胞骨架再组织和形态改变；无关的抗体不能够阻断细胞骨架再组织。 这些数据表明HMGB1诱导的RSMC的反应需要RAGE受体。 已知很多化学引诱物通过与异三聚体GTP结合蛋白(G蛋白)相关的膜受体而起作用，测定了 G蛋白是否参与HMGB1信号通路。使用了百日咳毒素，因为它抑制G蛋白的一个特异的亚类(Gi/o蛋白)，揭示了它们参与信号通路(Baggiolini等人，1994， Adv.Immunol. 55 :97-179 ;Haribabu等人，1999， J. Biol. Chem. ， 274 :37087-37092)。使用mPT (PT的失活突变型)作为对照。用PT或mPT(50ng/ml)预处理RSMC 6小时，用HMGB1 (100ng/ml)、BoxA或BoxB(10ng/ml)剌激30分钟。如前面所述进行化学趋化性分析。数据代表平均值±SD，数值100%代表没有任何剌激物存在的基础迁移。图6-A显示了 PT对HMGB1诱导的化学趋化性的抑制作用。这些数据显示了Gi/o蛋白参与了HMGBl控制的信号通路。图6-B显示了细胞骨架再组织，如以前所描述的方法看到肌动蛋白丝。然后，研究HMGB1诱导的信号是否涉及MAP激酶通路；实际上，已知这些蛋白由RAGE活化，它们对细胞内运动机制的调节有直接的作用。RSMC用PD98059 (50mM)预处理一小时或者未预处理，用来自小牛胸腺的HMGBl(100ng/ml)剌激30分钟，用特异的磷酸化ERK1/2的抗体(New England Biolabs，Beverly, MA)和DAPI染色。为了看到细胞骨架再组织，单独的细胞样品用TRITC-伞毒素染色。图7显示了在30分钟内，HMGB1剌激如何诱导RSMC的ERK1/2蛋白的活化和它们的核转运；与此形成对照的，磷酸化的ERK蛋白在未剌激的RSMC中几乎不能检测到，并且其位于细胞质中。而且PD98059 (MEK的选择性抑制剂，而MEK是ERK的上游调节剂)抑制HMGB1诱导的ERK磷酸化和核转运，以及RSMC迁移和细胞骨架再组织。结果，这些数据表明MAP激酶在HMGB1诱导的细胞迁移中起到了重要的作用。
细胞损伤诱导 考虑到现有技术的状况，检测了损伤细胞或正在经历坏死的细胞是否在细胞外介质中释放HMGBl。 Hela细胞和HUVEC用5um离子霉素(Sigma)禾P 20um CCCP，或mM脱氧葡萄糖和lOmM叠氮钠处理诱导坏死。在37t:进行16个小时后，根据形态，记下经历坏死的细胞数目，当它达到50%时，采集上清液。 蛋白质印迹分析时，采集处理和未处理的细胞的培养基，用Amicon Ultrafree-MC滤器浓縮50倍；用SDS-PAGE样品缓冲液溶解细胞。 免疫荧光分析中，细胞用4% PFA固定，用抗HMGB1抗体孵育，二级抗体和DAPI染色，使用0. 1 % NP-40的PBS进行细胞的透化作用。
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图8-A显示了上清液(S)和细胞团(P)的蛋白质印迹分析。HMGB1从坏死细胞和损伤细胞的上清液中回收。图8-A显示了在单个活的和坏死的Hela细胞上进行的免疫荧光分析，HMGB1没有结合到残余的坏死细胞上。 图9显示了免疫组织化学分析的结果，这些数据说明HMGB1包含在沿着人体动脉的内皮细胞的核中，但是没有在RSMC的核中(图9-A是低放大率，图9-B是高放大率)，实际上，大多数平滑肌细胞的核中包含数量无法测定的HMGB1 (图9-B的框)。图9-C蛋白质印迹法显示了与Hela细胞相对照的HMGBl在RSMC中的表达水平，说明了 RSMC的体外培养与Hela细胞相比含有少量的HMGBl。 总而言之，这些数据表明给予血管平滑肌细胞信号的HMGBl分子可能仅仅源于附近的细胞的坏死或机械损伤。 结论是，上面所述的实验数据，即本申请的基础，证明了 HMGBl核蛋白是机械损伤和/或炎症发生后血管重建的一个重要的介质，它能由损伤或坏死的细胞被动释放。
这些数据特别表明了下面的内容
HMGBl作为一种化学引诱物 同bFGF或预LP —样，HMGBl在趋化性分析和创伤分析中是很强的化学引诱物，促
进细胞形状改变和细胞骨架组织改变，这与用尿激酶原观察到的相似；这些使用特异性地
归因于HMGBl而不是由于潜在的污染物。另外，HMGB1的抗体抑制它对细胞迁移的影响，然
而非特异的对照抗体是不能这样的。 在RSMC中结合RAGE弓|发HMGBl的信号通路 上面所报道的实验显示了 RAGE在RSMC中表达，抗RAGE抗体抑制了 HMGBl对RSMC的影响。 可以确定由于ERK1/2被磷酸化并且在HMGBl的剌激下转移到细胞核，MAP激酶参与了 HMGBl诱导的RSMC细胞迁移，以及MEK抑制剂PD98059能够阻断HMGBl诱导的细胞迁移。数据也表明由于HMGBl诱导的细胞迁移能够被百日咳博德特氏菌毒素阻断，Gi/o蛋白参与到由HMGBl活化的过程。G蛋白通常缔合到七跨膜elix受体(7TM)，但是到目前为止没有描述过RAGE与G蛋白之间的直接结合。到目前为止，不知道HMGBl除了结合RAGE，是否需要结合7TM受体/G蛋白受体，或者是否G蛋白参与RAGE下游，或者参与到反馈机制中。
HMGBl旁分泌功能 HMGBl以一种非调节的方式释放，这就意味在细胞因子或脂多糖的剌激下，此时细胞被机械损伤或遭受坏死。因而，HMGB1能把单个细胞的损伤或破坏以一种旁分泌的方式用信号通知相邻的细胞。对细胞外HMGBl响应的细胞自身含有很少的HMGBl，在细胞核内几乎没有。RSMC与Hela细胞或内皮细胞相比含有很少的HMGBl，它们含有的很少的HMGBl大多位于细胞质。迁移的RSMC倾向于把HMGBl集中在细胞前沿的表面上。可以假设为了减少对它们自身的HMGBl不适当的反应的几率，对HMGBl响应的细胞含有很少的HMGBl。 HMGBl集中在迁移细胞的前沿能诱发相邻细胞的HMGBl诱导的反应参与细胞迁移的分子(例如整联蛋白，尿激酶受体或c-Src)的重新定位，是运动RSMC的特征。迁移也涉及细胞外蛋白酶的活化，HMGBl和纤溶酶原活化系统的相互作用能推动细胞在细胞外基质的迁移。
HMGBl在血管病中的作用 平滑肌细胞对HMGBl的反应性，观察到内皮细胞含有很大数量的HMGBl而血管SMC含有很少，以及遭受机械损伤的细胞释放HMGB1，所有上述的结果表明了在动脉粥样硬化和再狭窄中产生的组织再塑造过程中HMGB1可能发挥了作用。 上述特定的实验结果能够鉴别抑制HMGB1和RAGE受体之间的相互作用的分子，这也是本发明的目的，考虑到它们的结构和功能特征，这些分子被分类如下
1、 HMGB1拮抗剂HMGB1片段、比完整的全长分子更有效的HMG盒类似物和含有HMG盒功能域的蛋白，后面的两种都能够结合RAGE受体。 2、HMGB1抑制剂作为抗体或抗体片段和回向DNA的分子，它们能结合到HMG盒功能域，并避免HMGB1结合到RAGE。 这些分子有利于应用到药物制剂中，以预防、延缓或使血管上皮损伤后的动脉粥样硬化和/或再狭窄最小化，包括血管成形术后产生的那些。 此外，本发明的发明人表明HMGB1对鼠胚胎成纤维细胞有强的生物学作用。已知成纤维细胞是结缔组织的主要细胞成分，它们对连接的细胞外基质的合成和维持起作用。更特别的是，HMGB1在体外作为一种强的成纤维细胞的化学引诱物起作用，抗RAGE抗体能阻断所述的效应。 结果，每种与HMGB1同源的分子都可以作为全长蛋白质用于制备药物学制剂，该药物学试剂能正调节，从而推动和/或诱导成纤维细胞的细胞迁移。同样，为了避免、延缓或减少结缔组织的再生，能阻断HMGB1和它的RAGE受体的相互作用的每种分子(即属于抑制剂组的所有分子抗体或抗体片段，四向DNA ;和属于HMG盒拮抗物组的所有分子HMGBl片段、含有HMG盒功能域的分子)能有效地用于药物学制剂的生产。 本发明的另一个目的是HMGB1、相应于HMG盒的HMGB1片段、属于HMG盒家族的其它蛋白质的HMG盒结构域和HMG盒家族的其它蛋白质在制备治疗药物中的用途，所述治疗药物用于促进和/或诱导成纤维细胞迁移从而正调节结缔组织再生。 本发明的一部分是将能够抑制HMGB1和RAGE受体的相互作用的所有分子、拮抗物和/或抑制剂用于制备减少、延缓和避免结缔组织再生的治疗剂，正如下面的实验所指的。
成纤维细胞的趋化性分析 趋化性分析采用众所周知的方案进行(Degryse等人，1999， Blood，94 :649-662)。使用具有O. 5um孔径滤器的改进的Boyden室(Corning, Acton， MA)，用胶原蛋白I (0. 5M乙酸中100ug/ml)和纤连蛋白处理(lOug/ml) (Roche)。采用众所周知的方案培养鼠胚胎成纤维细胞(Calogero等人，1999， Nat. Genet. ，22 :276-280) ，24小时血清饥饿后，20. 000-40. OOO细胞样品加入到Boyden室的上孔中。大肠杆菌表达的重组HMGB1在同样的无血清介质中稀释，加入到下孔中。 抗RAGE抗体(lOOOng/ml) (Dr. A. M. Schimdt所赠，ColumbiaUniversity， NY)加入到两孔中。 在37°〇细胞迁移整晚，接着刮掉保存在滤器上表面的细胞，用甲醇固定滤器，10%龙胆紫的20%甲醇溶液染色。所有的实验进行至少两次，每次三份。 在图10中显示的结果是在每个滤器10个高密度区计算的细胞数目的平均值士SD，以未处理的对照的倍数表示。对随机的细胞迁移(即不存在化学引诱物时的迁移)给予人为值100% 。使用ANOVA模型来评价采用不断增加剂量的试剂的处理，从而进行统计分析。
大肠杆菌表达的重组HMGBl以一种浓度依赖的方式剌激成纤维细胞的迁移，以0. lng/ml的剂量开始，在100ng/ml有最大反应，在更高的剂量(lOOOng/ml)反应比对照的低。抗RAGE抗体(lOOOng/ml)完全阻断迁移响应(图10的图解的右侧)显示了上述现象特异性地归因于HMGBl。 HMGBl在结缔组织再生的调节中的作用 成纤维细胞对HMGBl的反应性指明了在由于创伤或外科发生的损伤后产生的结缔组织重塑造过程中HMGBl可能发挥作用。而且抗RAGE抗体阻断所述反应的事实表明在细胞表面的HMGBl和RAGE受体的相互作用是导致成纤维细胞对HMGBl的敏感性的基础。
结论 -HMGBl和/或相应于HMG盒的HMGBl片段、属于HMG盒家族的其它蛋白的HMG盒域以及HMG盒家族的其它蛋白能有利地用于正调控(即促进和/或诱导结缔组织再生)的药物制剂中。-能抑制HMGBl和RAGE相互作用的并且属于拮抗物组(能结合到RAGE受体)和属于抑制剂组(能结合HMG盒域从而阻断HMGBl结合在RAGE受体上)的每种分子可以有利地用于负调控(即阻断、延缓或减少结缔组织再生)的药物制剂中。
本发明的优选实施方案如下 l.HMG盒结合分子在制备治疗血管病的治疗试剂中的用途。 2.根据实施方案1所述的HMG盒结合分子的用途，其中所述的分子属于包含抗体或抗体片段、抑制剂和四向DNA的组。 3.与HMG盒具有序列同源性并且能结合受体的功能性HMG盒结合结构域的拮抗物分子在制备治疗血管病的治疗试剂中的用途。 4.根据一个或多个上述实施方案中所述的分子的用途，其中血管病包含在血管成形术中产生的动脉粥样硬化和/或再狭窄。 5.根据一个或多个上述实施方案中所述的分子的用途，其中所述分子由用于血管成形术的导管、外科器械或支架释放。 6. HMGBl和/或相应于HMG盒的HMGBl片段、属于HMG盒家族的其它蛋白质的HMG盒域以及HMG盒家族的其它蛋白质在制备能促进和/或诱导结缔组织再生的治疗试剂中的用途。 7.HMG盒结合分子在制备能阻断、延缓或减少结缔组织再生的治疗试剂中的用途。
8.根据实施方案7所述的HMG盒结合分子的用途，其中所述分子属于包含抗体或抗体片段、抑制剂和四向DNA的组。 9.与HMG盒具有序列同源性并且能结合受体的功能性HMG盒结合结构域的拮抗剂分子在制备能阻断、延缓或减少结缔组织再生的治疗试剂中的用途。
权利要求
HMG盒结合分子在制备治疗血管病的治疗试剂中的用途，所述血管病不包括糖尿病引起的结果，其中所述分子属于包含抗体片段、抑制剂和四向DNA但不包含sRAGE的组。
2. 与包含HMG盒A和HMG盒B的HMG盒具有序列同源性并且能结合受体的功能性HMG盒结合结构域的拮抗剂分子在制备治疗血管病的治疗试剂中的用途，所述拮抗剂分子不包 括sRAGE，并且所述血管病不包括糖尿病引起的结果。
3. 根据一个或多个上述权利要求中所述的分子的用途，其中血管病包含在血管成形术 中产生的动脉粥样硬化和/或再狭窄，但不包括糖尿病引起的结果。
4. HMGB1和/或相应于依照权利要求2的HMG盒的HMGB1片段、属于HMG盒家族的其它 蛋白质的HMG盒结构域以及HMG盒家族的其它蛋白质在制备能促进结缔组织重构的治疗试 剂中的用途。
5. 根据权利要求4所述的用途，其为在制备能诱导伤口和/或灼伤和/或褥疮愈合的 治疗试剂中的用途。
6. HMG盒结合分子在制备能阻断、延缓或减少结缔组织再生的治疗试剂中的用途，其中 所述分子属于包含抗体片段、抑制剂和四向DNA的组。
7. 与包含HMG盒A和HMG盒B的HMG盒具有序列同源性并且能结合受体的功能性HMG 盒结合结构域的拮抗剂分子在制备能促进结缔组织重构的治疗试剂中的用途。
全文摘要
描述了HMG盒结合分子以及与HMG盒具有序列同源性的分子在制备用于治疗血管病的治疗剂中的用途。
文档编号A61P9/00GK101773669SQ20091025232
公开日2010年7月14日 申请日期2002年3月12日 优先权日2001年3月16日
发明者伯纳德·德格里希, 保拉·斯卡菲迪, 苏珊·米勒, 蒂齐亚纳·博纳尔迪, 马尔科·E·比安基 申请人:Bio3研究有限责任公司;马尔科·E·比安基