组合物、方法及试剂盒的制作方法

专利名称：组合物、方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于确定包含交叉反应抗原决定簇的免疫交叉反应分子的组合物和 方法，尤其用于确定包含交叉反应抗原决定簇的蛋白质的组合物和方法，尤其用于确定 基于血清筛选使用连续免疫激发动物的交叉反应蛋白质，包括确定交叉反应副猪嗜血菌 (H. parasuis)蛋白质的组合物和方法。也提供使用该分子诊断的组合物、疫苗及试剂盒，以 及用于预防或治疗与传染原相关的疾病、病症、状况、或其症状的方法，该传染原尤其是有 传染性的微生物，尤其用于预防和治疗与副猪嗜血菌感染相关的疾病、病症、状况、或其症 状的方法。
背景技术：
接种疫苗的原理实质上基于两个免疫关键因素，即特异性和记忆。B细胞对大部分 抗原应答的激活和分化需要多种信号驱使B细胞形成抗体分泌浆细胞或记忆B细胞，其为 介导第二次暴露于抗原的更迅速的应答做准备。记忆细胞允许免疫系统在第二次遇到抗原 时发动强烈的多的应答。这种二次应答比初次应答出现的不仅更快而且更有效。然而，由 于抗体本性是非常特异的，并且考虑到传染原的多样性，开发在许多不同类型的病原体之 间或之内表现出交叉反应的抗体仍然是重要问题。对于开发表现交叉反应抗体仍然是重要挑战的传染原的一个例子是副猪嗜血菌 (Haemophilus parasuis)，其是猪多浆膜炎和关节炎(格拉瑟病)的病原。副猪嗜血菌是 革兰氏阴性、偶尔有荚膜的、不动的、多形细菌，从患浆液纤维蛋白性的胸膜炎、心包炎、腹 膜炎、关节炎和脑膜炎的猪的浆液性渗出物分离。此生物最初由Gmsser在1910年描述， 似乎1922年第一次由Schermer和Ehrlich分离，尽管所怀疑的生物最初被称为猪嗜血菌 (Haemophilus suis)。然而，在1969年，Biberstein和White表明格拉瑟病的病原体仅需 要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。猪嗜血菌是一种既需要铁卟啉又需要烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸(NAD)的生物，因此在此疾病中不是潜在因素，新的生物通过添加前缀“副(para)”被 重新命名为副猪嗜血菌(H. parasuis)。在过去五十年间对副猪嗜血菌的表征已有重大进展。Bakos等人使用沉淀测试 鉴定四种血清型，他命名为 A-D (Nordic Veterinary Medicine，4 :241_255 (1952))。在 1986 年这四种增长到七种(J Clin Microbiol，23 :1022_1025 (1986))。Kielstein 等人， Zentralbl Veterinarmed B，38 :315_320 (1991)另夕卜添力口了六种，Rapp-Gabrielson，Am J Vet Res, 53 =659-664(1992)的工作又添加了另外五种。最后对此分类进行了改进。所有 血清型，包括具有多个命名的少数几个，基于通过特异性兔血清进行的免疫扩散测试进行 表征。结果是至少十五种血清型的名单，其已经被全球接受。不幸的是，也存在大量未分类 的分离菌。此外，许多出版物已经描述了副猪嗜血菌在具体国家中的血清型谱。已经提出 在美国、德国、日本、西班牙、加拿大和中国，血清型4和5是非常常见的。已经报道血清型 5和13在澳大利亚和丹麦流行。尚未确定副猪嗜血菌的毒力因子。将毒力大部分与血清型相关联，因为有些与较 高的发病率与死亡率相应。腹膜内感染时，已经报道血清型1、5、10、12、13和14在四日内导致高发病率与死亡率。因此，这些株被认为是高毒力的。三种血清型(即2、4和15)显 示中等水平的毒力，导致多浆膜炎而无死亡。剩余血清型被认为是无毒力的，因为受感染的 猪不显示临床疾病。已经尝试确定副猪嗜血菌的特异性毒力因子。作为巴斯德菌科 (Pasteurellaceae)的成员，人们认为一些候选者将包括荚膜、菌毛、脂多糖(LPS)，以及外 膜蛋白(OMP)。然而，目前，在副猪嗜血菌中，人们很少能将这些特性与毒力联系起来。有荚 膜的菌株在健康猪和有临床表现的动物的鼻腔中都是常见的。报告显示LPS的产生在有毒 和无毒血清型之间无显著差异，并显示含有LPS和OMP两者的递呈仅仅诱导对OMP的应答， 这在一定程度上表明LPS是不重要的。已经表明OMP产生强烈的体液应答，并且已经提出对来自此类型的保护性免疫原 候选者。存在两种普遍的OMP谱并可能与毒力相关。最大毒力血清型通过第二种谱表征， 其主要是37kDa的蛋白质。无毒血清型显示多个条带，强条带在23-40kDa之间，以及大约 68kDa的蛋白质。已经提出与副猪嗜血菌感染相关的几种其它蛋白质。已经报道了两种克隆化的蛋 白质，命名为P2和P5，它们都致免疫。令人惊讶地，P2似乎根据血清型毒力而不同，在无毒 血清型中，它主要显示为55kDa蛋白质，在有毒血清型中显示为48kDa。此蛋白质显示与流 感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的P2蛋白质同源性。其它人已经鉴定并描述了副猪 嗜血菌基因组TonB区域的上调。此区域含有对缺铁环境应答的几个基因。特别地，鉴定了 转铁蛋白结合蛋白，并显示当铁受限时被上调。由于铁在宿主中是被螯合的，已经提出此类 基因对于病原体在宿主内的存活是重要的。另外，使用多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida) 35kDa MOMP的多克隆抗体检 测到42kDa的主要外膜蛋白(MOMP)。对杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)(—种紧密相 关物种)可能相似的42kDa蛋白质分析将该蛋白质表征为与OmpA抗原相似的蛋白质。这 类可热修饰膜蛋白通过开发的针对副猪嗜血菌膜制剂的单克隆抗体进行了进一步研究。在 此实验中使用了两种单克隆抗体，一个针对35kDa 0ΜΡ，第二个针对LPS。据报道这些单克 隆抗体与常见血清型特异性反应，显示了它们作为诊断工具或潜在疫苗靶标的潜在价值。神经氨酸酶是另一个潜在毒力因子。90%以上的野生分离菌似乎产生神经氨酸 酶。该酶在副猪嗜血菌的生长晚期表达，并与必要定居受体的暴露和宿主内粘蛋白的降解 有关。副猪嗜血菌能够感染宿主的多个位点。因此，基于感染位点显示不同的临床体征。 感染的四种主要形式是格拉瑟病(纤维素多浆膜炎)、败血病(无多浆膜炎)、急性肌炎 (myositis acuta)(咬肌)以及呼吸疾病。不论感染位点或感染类型，已经报道的副猪嗜血 菌感染症状有些是普遍的。通常报道的为温度升高、情感淡漠、食欲不振。已经报道的其它 常见临床症状包括咳嗽、呼吸困难(呼吸不足)、体重减轻、跛行、协调缺失、发绀及衰竭。副猪嗜血菌在无特异病原体(SPF)群流行后已经成为主要问题。部分是由于猪生 产商业的发展(包括建立无特异病原体群)，副猪嗜血菌已经显示为经济重要病原体。一般 地，感染以幼小动物、不卫生圈养的那些或不佳喂养的那些为目标。此外，不安全运输和不 同龄猪的混杂对爆发有显著贡献。已经报道高密度动物与这些受保护畜群中相对单纯的猪 群体的结合使副猪嗜血菌诱导疾病的发病率增高。进一步使事情复杂化的是副猪嗜血菌以几种不同区域特异性血清型存在的事实。据报道暴露或接种一种血清型疫苗并不必然保护 其它血清型的感染。因此，提出开发自身疫苗控制未知血清型传播。部分由于此类问题以 及由于自身菌苗产生和猪暴露之间的延迟，出现了交叉保护疫苗的需求，该疫苗能够可靠 施用而不论区域血清型的流行。已经提出在出现临床体征时立即应用抗生素治疗副猪嗜血菌感染。不幸的是，病 原体的穿透性特征需要高剂量的抗生素发挥作用，常常在成本上是不允许的。已经尝试通过商业和自体疫苗接种来控制。副猪嗜血菌血清型的多样性使得接种 疫苗方案变得复杂，因为交叉保护是罕见的。与不可归类菌株结合，该抗原谱过多使开发疫 苗变得困难。也提出通过同源攻击疫苗进行保护。三件套蛋白的研究表明当与已知血清型和未 归类野生分离菌产生时，死菌苗产物能够对同源攻击进行保护。该研究为使用自体疫苗控 制爆发从而降低死亡率提供了线索。有些人提出使用有毒菌株保护来自于其它有毒菌株的异源攻击。一个研究报道含 有血清型4和5的二价疫苗保护血清型13和14。然而，其它人没能显示血清型2和5之间 的交叉保护。还有人提出将小猪控制暴露于低剂量活的有毒副猪嗜血菌。然而，部分由于其它 病原体同时感染的破环，如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，该方式未被推荐为有效控制 方法。由于目前可得的控制多种致病感染的方法之有效性有限，部分由于致病体如副猪 嗜血菌的多样性，需要有效的治疗和预防方法和组合物，尤其需要鉴定能够允许开发有效 疫苗的交叉反应蛋白质，尤其是用于治疗和预防副猪嗜血菌感染。发明_既述一方面，本发明提供确定包含交叉反应抗原决定簇分子的方法。该方法包括使至 少一种抗体与第一抗原决定簇和第二抗原决定簇接触。至少一种抗体从动物获得，该动物 连续暴露于第一免疫组合物诱导的第一免疫激发，该第一免疫组合物包含第一抗原决定 簇，随之是第二免疫组合物诱导的第二免疫激发，该第二免疫组合物包含第二抗原决定簇。 至少一种抗体与第一和第二抗原决定簇的结合指示交叉反应性，由此确定该分子。另一方面，本发明提供确定包含交叉反应抗原决定簇分子的方法，该方法包括a)在动物中激活记忆B细胞以产生至少一种抗体，其中激活包括通过该分子免疫 激发动物从而诱导激活记忆B细胞的免疫应答；和b)使至少一种抗体与第二分子接触，其中至少一种抗体与该分子和第二分子的结 合确定该分子。在其它方面，本发明提供分离的多肽。该多肽包含选自下述的氨基酸序列
ELANAI(SEQ ID NO1)；
TVLAEKQEII(SEQ ID NO2)；
APAKGSTIEAGIAYPIST(SEQ ID NO3)；
MKNLISI(SEQ ID NO4)；
禾口
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT(SEQ ID NO5)。
该分离的多肽还包含副猪嗜血菌至少两种血清型表达的蛋白质中存在的交叉反 应抗原决定簇。
在一些方面，本发明提供分离的多肽，其包含选自下述的氨基酸序列
(SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4)
ELANAI TVLAEKQEII APAKGSTIEAGIAYPIST MKNLISI 禾口
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT (SEQ ID NO 5),
其中该分离的多肽还包含交叉反应抗原决定簇并由副猪嗜血菌血清型5表达。 一方面，本发明提供疫苗，其包含预防或治疗有效量的分离的多肽，和可药用的媒
介物、载体或赋形剂。该多肽包含选自下述的氨基酸序列
(SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4)
ELANAI TVLAEKQEII APAKGSTIEAGIAYPIST MKNLISI 禾口
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT (SEQ ID NO :5)。
该分离的多肽还包含副猪嗜血菌至少两种血清型表达的蛋白质中存在的交叉反 应抗原决定簇。 另一方面，本发明提供治疗或预防动物与副猪嗜血菌感染相关的疾病、状况、或其 症状的方法。该方法包括施用有效量的疫苗，该疫苗包含预防或治疗有效量的分离的多肽， 和可药用的媒介物、载体或赋形剂。该多肽包含选自下述的氨基酸序列
(SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4)
ELANAI TVLAEKQEII APAKGSTIEAGIAYPIST MKNLISI 禾口
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT (SEQ ID NO :5)。
该分离的多肽还包含副猪嗜血菌至少两种血清型表达的蛋白质中存在的交叉反 应抗原决定簇。在其它方面，本发明提供用于诊断的组合物、方法和试剂盒。阅读此说明书后，本发明的优势和益处对本领域技术人员将是明显的。附图简述

图1显示支气管淋巴(BL)液起始筛选的Western印迹。样品双份上样，除了样品 12之外。样品1-4和样品8-11针对副猪嗜血菌血清型5进行测试，样品5-6和12-15针 对副猪嗜血菌血清型13进行测试。1 阴性CDCD血清，2 :BL46，3 :BL47，4 :BL50，5 :BL46， 6 :BL47,7 :BL50,8 :BL96，9 :BL98，10 :BL99，11 :BL142，12 :BL96，13 :BL98，14 :BL99，15 BL142。
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图2显示副猪嗜血菌血清型5、13和4与BL47的Western印迹。泳道1，7_MW标记 (从顶部:200，150，100，75，50，37，25和20kDa)；泳道3-副猪嗜血菌血清型5 ；泳道5-副 猪嗜血菌血清型13;泳道9-副猪嗜血菌血清型4。泳道2，4，6，8，10-空白。箭头表示感兴 趣的显著条带。图3显示全细胞副猪嗜血菌血清型5和吐温-20提取的副猪嗜血菌血清型5的 Western 印迹和 SDS-PAGE。印迹泳道 1，5_MW 标记(从顶部:200，150，100，75，50，37，25 和20kDa)；泳道3-全细胞血清型5 ；泳道7-吐温-20提取的血清型5，泳道2，4，6-空白。 SDS-PAGE 泳道1，5-MW标记；泳道3-全细胞血清型5 ；泳道7-11-吐温-20提取的血清型 5 ；泳道2，4，6，12-空白。图4显示对应于(A) 76kDa ； (B) 63kDa ； (C) 56kDa和(D) 28kDa凝胶切 下条带的质谱分析(MALDI MS/MS)。发明详述本发明提供多个方面和实施方案，包括鉴定能够提供交叉反应抗体的分子，该抗 体识别抗原相关分子，从而其能够应用于疫苗、诊断应用和治疗或预防广泛范围的状况或 疾病的方法中，该状况或疾病包括与传染原相关(如但不限于细菌、病毒等)的那些。本文 描述的新方法使用交错免疫激发模型利用宿主来鉴定交叉反应的分子，其中宿主被连续激 发，例如通过副猪嗜血菌的一种血清型，使之恢复，然后通过不同血清型激发。I 定义术语“分子”，除非另有明确说明，包括多肽和蛋白质(包括例如糖蛋白和脂蛋 白)，多糖包括例如脂多糖，核酸及其片段。术语“免疫原”或“致免疫”是指诱发特异性免疫应答的分子。本文所用术语“抗原决定簇”是指B细胞(即B淋巴细胞)及B细胞分泌抗体识 别的分子(例如多肽)的一级、二级、三级或四级结构。本文所用术语“交叉反应抗原决定簇”是指存在于两个或更多分子(例如细菌蛋 白变体)上的抗原决定簇被相同抗体结合的能力。此外，应当理解包含抗原决定簇(其能 够被相同抗体结合)的两个或更多分子可以是相同分子或其片段、彼此的变体、或不同分 子。举例而言，述及包含抗原决定簇(其能够被相同抗体结合)的蛋白质(例如细菌蛋白 变体)，该蛋白质可以具有相同或不同的一级氨基酸序列，然而，每种蛋白质包含能够被相 同抗体结合的抗原决定簇(即“交叉反应”)。本文所用术语“交叉反应抗体”是指能够结合到交叉反应抗原决定簇的抗体。本文所用术语“治疗”是指缓解、改善或补救疾病、病症、状况或疾病、病症或状况 的症状。术语“预防”意思是终止或阻止疾病、病症、状况或疾病、病症或状况的症状。II确定交叉反应性—方面，本发明提供确定包含交叉反应抗原决定簇的分子的方法。该方法包括使 至少一种抗体与第一抗原决定簇和第二抗原决定簇接触，其中该至少一种抗体从动物获 得，该动物连续暴露于第一免疫组合物诱导的第一免疫激发，该第一免疫组合物包含第一 抗原决定簇，随之是第二免疫组合物诱导的第二免疫激发，该第二免疫组合物包含第二抗 原决定簇，其中至少一种抗体与第一和第二抗原决定簇的结合指示交叉反应性，由此确定该分子。在一个实施方案中，第一免疫组合物还包含第一多肽，该第一多肽包含第一抗原 决定簇，其中第二免疫组合物还包含第二多肽，该第二多肽包含第二抗原决定簇，其中第一 多肽由第一微生物表达，第二多肽由第二微生物表达，其中第一和第二微生物的特征在于 是相同物种的不同血清型。在另一个实施方案中，第一和第二微生物是细菌。在一些实施 方案中，细菌是副猪嗜血菌。一般而言，该方法涉及两次或更多次对动物连续免疫激发，包括在激发之间的恢 复时间。然后，在最后一次激发后的时间，从动物中获得至少一种抗体，例如通过收获包含 至少一种抗体的动物淋巴结和/或其它富含记忆细胞的组织。不局限于任何特定理论，据 信通过收获淋巴结和/或其它富含记忆细胞的组织，第一激发产生的记忆B细胞可在它们 应答随后激发的激活后收集。激活的记忆B细胞负责清除诱导第一激发的第一抗原决定 簇，可通过测试记忆B细胞应答第二抗原决定簇诱导的随后激发产生的抗体从而确定它们 与第一和第二抗原决定簇的交叉反应性，由此确定它们各自的交叉反应分子。用于该方法的适当动物包括但不限于猪(例如猪)、牛、羊、豚鼠、兔、小鼠、大鼠、 山羊和马。在一个实施方案中，动物是剖宫产、初乳无摄取动物。在另一个实施方案中，动 物是猪。在一些实施方案中，剖宫产、初乳无摄取动物是剖宫产、初乳无摄取的猪。在其它 实施方案中，动物至少是大约1周龄，示例性地，至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9和10周龄。动物可以任何方式暴露于第一和第二免疫激发，只要第一激发产生记忆B细胞， 并且在动物通过第二抗原决定簇的随后激发中被激活。优选地，激发组合物中包含抗原。例 如，包含第一抗原决定簇的第一激发组合物和包含第二抗原决定簇的第二激发组合物可以 本领域已知的任何适当施用途径施用于动物，该途径包括但不限于静脉内、动脉内、肌内、 皮下、皮内、透皮、口服和鼻内。也在本发明范围内的其它暴露于激发的方式包括接种疫苗和天然暴露于免疫原 (例如传染原)。因而，免疫激发也可包括天然暴露动物至抗原决定簇而诱导的激发，如通 过暴露动物至传染原(例如细菌、病毒、寄生虫)。因而，例如，第一免疫激发可以是下述激 发动物被属于第一血清型的细菌菌株天然感染诱导，然后进行第二激发，第二激发包括鼻 内施用具有该菌株第二血清型(即第二抗原决定簇)的第二激发组合物。激发组合物包含抗原，任选地，可以还包含缓冲液和/或再包含其它协助获得所 需激发效力和/或使接受激发动物的不利影响最小化的成分。在一个实施方案中，第一和第二激发组合物包含胨缓冲液或生理盐水。在另一个 实施方案中，第一和第二激发组合物包含胨缓冲液，其中第一激发组合物还包含第一细菌。 其中第二激发组合物包含第二细菌，其中第一和第二细菌细菌属于相同物种的不同血清 型。在一个实施方案中，第二激发在第一激发施用于动物后至少大约1周后施用于动 物，示例性地，第一激发后大约1周至大约1年，大约2周至大约10个月，大约3周至大约 8个月，大约1个月至大约6个月，大约2个月至大约4个月。因而，免疫记忆为本发明提供了基础。因此，该方法还包括提供从进行第二免疫 激发后的动物获得的生物样品，其中生物样品包含产生抗体的记忆细胞。生物样品可以是 任何适当类型。生物样品可以来自于动物的组织、器官、血液、淋巴或淋巴结。生物样品也
9可以从受感染的位点或所形成的损伤区域获取，或临近受感染或损伤的区域如淋巴结中获 取。优选地，生物样品通过收获动物提供记忆B细胞的淋巴结和/或其它富含记忆细胞的 组织获得。一般而言，生物样品在第二激发后的时间从动物获取。获取样品的时间可根据许 多因素而改变，该因素包括动物、激发组合物、获取样品后任何考虑的步骤(例如随后的培 养条件)等，并可通过常规实验预先确定。优选地，生物样品在第二激发后从动物获取的时 间是出现足够的记忆细胞激活时。在一个实施方案中，生物样品在第二激发后大约24小时 后从动物获取，示例性地，在最后一次激发后大约1天至大约14天，大约2天至大约12天， 大约4天至大约10天，大约6天至大约8天。在从动物移出生物样品后，存在于生物样品中产生抗体的记忆细胞可进一步加工 以获得至少一种抗体。在一个实施方案中，在从动物移出生物样品后，存在于生物样品中产 生抗体的记忆细胞在体外培养。体外培养产生抗体的记忆细胞可进行或不进行分离细胞亚 群的前期步骤。培养技术是本领域已知的。在体外培养过程中，培养物上清可包含记忆细胞分泌的抗体，因此，可以通过从培 养基收获上清从而收获至少一种抗体。培养细胞产生的抗体也可以从培养细胞释放，例如 通过裂解记忆B细胞释放至少一种抗体。激活的记忆细胞体外产生和/或分泌至少一种抗体至培养基中可如下进行增强 可以添加试剂到细胞培养物以促进细胞增殖、和/或增强抗体产生和/或分泌。此类试剂， 单独或联合，包括细胞因子如但不限于白细胞介素例如IL-1、2、3、4、5、6、7和8、克隆刺激 因子、干扰素和任何其它显示具有增强B细胞激活、增殖和/或抗体产生和/或分泌效应的 因子。例如，细胞激活包括添加激活剂至培养基，包括但不限于促分裂素和白细胞产生的因 子或它们的合成等同物或其组合。任选地，培养基中包含抗微生物剂。包含至少一种抗体的细胞培养上清能够直接用于确定至少一种抗体与第一和第 二抗原决定簇的结合。换言之，至少一种抗体可以以从培养基中收获上清的形式简单地使 用。在其它实施方案中，生物样品可从动物收获且其中含有的B淋巴细胞得到固定和 /或克隆。本领域已知能固定B淋巴细胞的融合配偶体。融合的方法包括将B淋巴细胞在 促融剂(例如非离子型去污剂)存在下与融合配偶体联合足够的时间以使融合发生，然后 通过存在于融合配偶体中的标记选择所产生的杂交瘤。然后细胞可进行有限稀释以提供无 污染细胞的克隆，由此提供均质抗体组合物。然后杂交瘤可以在培养物中增殖或引入宿主 动物中，例如大鼠或小鼠以产生富含抗体的腹水。如果需要，至少一种抗体可进行纯化和/或分级分离。例如，可以利用的技术如那 些用于从血清或血浆中纯化免疫球蛋白的技术，例如吸收、硫酸铵沉淀、辛酸分级分离、离 子交换色谱，或通过结合固定的蛋白质G或蛋白质A和从其洗脱。同样，取决于特定设计或 应用，至少一种抗体也可以偶联至适当的支持物(例如亲和色谱支持物)。因而，例如，包含至少一种抗体的溶液也可以含有至少一种不需要的非特异性抗 体，其在至少一种抗体与第一抗原决定簇和第二抗原决定簇接触的步骤中可能是不需要 的。因而，如果需要，该不需要的抗体可通过多种试剂包括例如蛋黄、组织粉、微生物悬浮物 等吸收包含至少一种抗体的溶液从溶液中去除。从动物收集的免疫前血清也可以用于吸
10收。示例性地，另举一例，包含通过应答一种细菌物种激发而产生的至少一种抗体的溶液可 与，例如去污剂提取的另一物种细菌悬浮物一起孵育，然后离心并收集包含至少一种抗体 的上清。可进行多于一次的吸收从而使无关抗体的非特异性结合最少。根据本发明，确定包含交叉反应抗原决定簇分子的方法包括使至少一种抗体与第 一抗原决定簇和第二抗原决定簇接触。至少一种抗体与第一和第二抗原决定簇的结合确 定该分子。可利用本领域已知的技术或技术组合进行接触。在一个实施方案中，该方法还 包括确定至少一种抗体是否与第一抗原决定簇和第二抗原决定簇结合。可利用的示例性 技术，单独或组合，包括但不限于Western印迹、免疫共沉淀、放射免疫测定、酶联免疫测定 (ELISA)和免疫荧光测定。当包含抗原决定簇的分子是蛋白质时，此类技术是尤其优选的。 在一个实施方案中，接触包括利用Western印迹技术确定至少一种抗体与第一抗原决定簇 和第二抗原决定簇的结合，其中第一和第二蛋白质分别包含第一和第二抗原决定簇。例如，其中待确定的分子是蛋白质，第一组合物(包含具有第一抗原决定簇的第 一蛋白质)和第二组合物(包含具有第二抗原决定簇的第二蛋白质)可以各自分别与标准 缓冲液混合并进行十二烷基硫酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS/PAGE)，然后在至少一种抗 体与第一抗原决定簇和第二抗原决定簇接触之前转移到硝酸纤维素、尼龙或其它膜。然后 可通过例如添加第二抗体显示至少一种抗体与第一抗原决定簇和第二抗原决定簇的结合， 该第二抗体可根据至少一种抗体的来源(即动物)而被标记和选择。然后，可以进行比较 分析对应于第一和第二蛋白质的可检测条带从而检测至少一种抗体与第一抗原决定簇和 第二抗原决定簇的结合，其中至少一种抗体与第一抗原决定簇和第二抗原决定簇的结合表 示至少一种抗体与第一和第二抗原决定簇交叉反应。因此，第一和第二抗原决定簇是交叉 反应的，由此确定该分子(即该蛋白质)，该分子可利用本领域已知的技术进一步表征。举例而言，当交叉反应抗原决定簇通过蛋白质产生时，本领域已知许多技术用于 进一步表征所确定的包含交叉反应抗原决定簇的蛋白质。例如，在SDS/PAGE或凝胶转移至 膜之后，对应于蛋白质的凝胶或膜区域可被切下或从凝胶或膜洗脱，并使用已知技术至少 部分纯化用于进一步分析，该技术包括质谱和氨基末端氨基酸测序(例如埃德曼降解)。此 外，氨基酸序列信息可与任何已知氨基酸序列比较(例如通过同源性比较)从而确定和/ 或进一步表征蛋白质的本性。此外，氨基酸序列信息可以用于推测相应核酸序列信息，其可 以提供用于特异性核酸扩增和/或克隆目的的引物和探针以及其它用途。因而，在其它实 施方案中，该方法还包含确定分子的至少一部分氨基酸序列，其中该分子是蛋白质。因此，在一些实施方案中，本发明提供用于确定包含交叉反应抗原决定簇的蛋白 质的方法。该方法包括使至少一种抗体与第一抗原决定簇和第二抗原决定簇接触，其中至 少一种抗体从动物获得，该动物连续暴露于第一免疫组合物诱导的第一免疫激发，该第一 免疫组合物包含第一抗原决定簇，随之是第二免疫组合物诱导的第二免疫激发，该第二免 疫组合物包含第二抗原决定簇，其中至少一种抗体与第一和第二抗原决定簇的结合指示交 叉反应性，由此确定该蛋白质。接触如上所述。在一个实施方案中，蛋白质由副猪嗜血菌表达。在另一个实施方案中，第一免疫组 合物还包含来自于第一血清型的副猪嗜血菌细菌，其中第二免疫组合物还包含来自于第二 血清型的副猪嗜血菌。在一些实施方案中，第-血清型是副猪嗜血菌血清型5，第二血清型 是副猪嗜血菌血清型13。
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因此，在其它实施方案中，本发明提供用于确定包含交叉反应抗原决定簇的分子 的方法，该方法包括a)在动物中激活记忆B细胞以产生至少一种抗体，其中激活包括通过第二分子免 疫激发动物以诱导激活记忆B细胞的免疫应答；和b)使至少一种抗体与该分子和第二分子接触，其中至少一种抗体与该分子和第二 分子的结合确定该分子。III分离的分子在其它方面，本发明提供包含交叉反应抗原决定簇的分离的分子或其片段。在一 个实施方案中，分离的分子是蛋白质。在另一个实施方案中，交叉反应抗原决定簇存在于副 猪嗜血菌至少两种血清型表达的蛋白质中。在一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包含选自下述的氨基酸序列ELANAI(SEQ ID NO 1)；TVLAEKQEII(SEQ ID NO 2)；APAKGSTIEAGIAYPIST (SEQ ID NO 3)；MKNLISI(SEQ ID NO 4)；禾口SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT (SEQ ID NO 5),其中分离的多肽还包含副猪嗜血菌至少两种血清型表达的蛋白质中存在的交叉 反应抗原决定簇。在另一实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包含选自下述的氨基酸序列；ELANAI(SEQ ID NO 1)；TVLAEKQEII(SEQ ID NO 2)；APAKGSTIEAGIAYPIST (SEQ ID NO 3)；MKNLISI(SEQ ID NO 4)；禾口SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT (SEQ ID NO :5)，其中分离的多肽还包含交叉反应抗原决定簇并由副猪嗜血菌血清型5表达。氨基酸序列SEQ ID NO: 1-5与提交至GENBANK的副猪嗜血菌氨基酸序列多个片 段的比较揭示至少下述同源性SEQ ID NO :1和登录号ZP_02478744 ;SEQ ID NO :2和 登录号ZP_02477919 ;SEQ ID NO :3 和登录号ZP_02478157 ;SEQ ID NO :4 和登录号: ZP_02478801 ；和 SEQ IDNO :5 和登录号ZP_02477404。登录号 ZP_02478744、ZP_02477919、 ZP_02478157、ZP_02478801和ZP_02477404通过引用完整合并于此作为参考。IV组合物、疫苗、诊断和试剂盒在本发明的其它多个方面提供基于所确定的包含交叉反应抗原决定簇的分子的 方法、组合物和试剂盒。优选地，所确定的分子是由致病病原体表达的蛋白质。致病病原体 优选是细菌，优选地，是副猪嗜血菌，然而本发明不限于此，下列描述仅仅通过述及本发明 的副猪嗜血菌和副猪嗜血菌蛋白质和多肽进行示例性说明。用于自动免疫接种的疫苗一方面，本发明提供用于自动免疫接种的疫苗，其设计用于治疗或预防副猪嗜血
12菌感染，并且这些疫苗可通过本领域熟知的常规疫苗制备方法从副猪嗜血菌蛋白质或其片 段制备，该蛋白质或其片段包含如上所述的交叉反应抗原决定簇。一般而言，致免疫量的包 含交叉反应抗原决定簇的蛋白质或其片段与适当可药用的媒介物、载体或赋形剂组合，可 适当施用有效免疫人类或动物量的此疫苗。本领域技术人员应当理解致免疫量是指一定量 的包含交叉反应抗原决定簇的蛋白质或其片段，其足以在人类或动物中引起免疫应答。所需包含交叉反应抗原决定簇的多肽(其作为本发明疫苗的活性成分)可根据其 大小通过本领域任何已知方式制备。例如，如果所需多肽序列相对较短，例如对应于基本由交叉反应抗原决定簇组成 的氨基酸序列，使用本领域标准的化学合成方法是可行的。在一般程序中，羧基末端氨基酸 可结合至固体支持物并与序列中下一个氨基酸(其已经在氨基上被保护以防止自身缩合) 反应。起始偶联后，可去除NH2保护基，按顺序与下一个氨基酸重复偶联过程。或者，例如，本发明多肽可从天然蛋白质纯化制备，该天然蛋白质来自于例如发酵 培养物，之后通过多种技术产生所需片段并纯化所需片段。重组DNA方法提供合成所需肽 的另一种方式。所需肽或蛋白质的DNA克隆序列(例如cDNA，基因组消化产物)可连接至 表达载体，该表达载体适合转化受体菌株从而表达基因并产生多肽。无论来源于基因组或cDNA文库，或是使用化学方法通过寡核苷酸合成，编码序列 可放置于质粒中细菌宿主相容启动子序列控制下，该质粒含有用于插入所需编码序列的合 适限制性位点。产生的表达载体可使用本领域已知方法转化至适当细菌宿主中。成功转化 体可以比在重组或天然菌株中发现的那些高的水平产生所需多肽片段。备选地，这些肽可 以使用适当控制序列、载体和转化技术在非细菌重组宿主中产生。当确定的包含交叉反应抗原决定簇的肽序列太小而不能致免疫时，为了赋予它们 致免疫性质，它们可以连接至载体物质。可以使用本领域已知的任何产生此类连接的方 法。例如，存在在一个官能团末端产生二硫键并在另一末端产生肽键的大量异双功能试 剂，这些已经被广泛使用。它们中最常用的是N-琥珀酰亚胺-3- (2-吡啶二硫代)-丙酸酯 (SPDP)。此试剂在它本身和一个蛋白质中的半胱氨酸残基之间产生二硫键，并通过另一蛋 白质中的赖氨酸的氨基或其它自由氨基产生酰胺键。已知多种此类二硫化物/酰胺形成试 剂。其它双功能偶联试剂形成硫醚键而不是二硫键。这些形成硫醚试剂中许多是可商业获 得的，包括6-马来酰亚胺基己酸、2-溴乙酸、2-碘乙酸、4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己 烷-1-羧酸的反应性酯等等。可通过将它们与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸、钠 盐联合激活羧基。如果肽不含合适的半胱氨酸，当制备肽时可在任意一端添加额外的半胱 氨酸残基。一般而言仅仅是较短的肽需要缀合至载体，这些残基在化学合成过程中可方便 地加入。制备含有作为活性成分的肽序列的疫苗是本领域非常了解的。一般而言，此类疫 苗制备成可注射的，液体溶液或者悬液；也可制备适合于注射前用于溶液或悬液的固体形 式。制剂也可以是乳化的。活性致免疫成分常常与赋形剂混合，该赋形剂是可药用的并与 活性成分相容。适当的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等及其组合。另外，如 果需要，疫苗可以含有少量辅助成分如润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂或增强疫苗效应的佐齐U。 疫苗常规地通过胃肠外施用，通过注射，例如皮下或肌内注射。适合其它施用方式的其它制 剂包括栓剂和在一些情况下口服制剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如聚烷撑
13)或甘油三酯；此类栓剂可从含有范围在0. 5%至10%，优 选1-2%活性成分的混合物形成。口服制剂包括通常使用的赋形剂，例如制药级的甘露醇、 乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些组合物采用溶液、悬液、片剂、丸 剂、胶囊、缓释制剂或粉剂，并含有10% -95%的活性成分，优选25-70%。本发明的氨基酸序列包括其可药用的盐，包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成)， 其与无机酸如例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等形成。与游离羧 基形成的盐也可来源于无机碱如例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及有机碱如异丙胺、 三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等。疫苗可通过与剂型相容的方式以能有效预防或治疗并致免疫的量施用。施用量可 取决于待治疗的受试者、受试者免疫系统合成抗体的能力和所需保护的程度。需要施用的 活性成分的精确量可取决于提供护理/执业者的判断。皮下或肌肉注射的适当剂量范围可 以是例如每受试者大约ι μ g至大约IOmg活性成分。对于口服、直肠栓剂、尿道或阴道制剂， 剂量范围可以是，示例性地，大约IOyg至大约lOOmg。起始施用和加强注射的合适方案也 是可变的，但一般是起始施用后大约一至大约两周间隔进行随后注射或其它施用。抗体另一方面，本发明提供分离的抗体，其可从包含交叉反应抗原决定簇的蛋白质或 其片段产生从而能够识别该交叉反应抗原决定簇，其中蛋白质由副猪嗜血菌表达。这些抗 体可以是单克隆或多克隆的。如果需要多克隆抗体，这些可以许多本领域已知的常规方式 中的任何一种产生。一般而言，包含交叉反应抗原决定簇的蛋白质或其片段可注射到适当 宿主动物，例如小鼠或兔，适当时间期间之后，抗体可从宿主动物分离并回收。对于单克 隆抗体，根据本发明，这些可以任何方式产生，包括例如Kohler和Milstein，Nature 256 495497(1975)已知的方式，或如那些 U. S. Pat. Nos. 6，331，415,5, 981，216,5, 807，715 和 4，816，567中所描述的，因为其对单克隆抗体的教导，将其通过引用合并于此作为参考。此 类方法是本领域已知的，包括制备嵌合、人源化和人类单克隆抗体。单克隆抗体也可从单链 制备，如轻或重链，另外也可从保留完整抗体结合属性(例如交叉反应、特异性和/或亲和 性)的抗体之活性片段制备。活性片段的意思是与完全抗体具有相同结合特异性的抗体片 段，该完全抗体结合来自于副猪嗜血菌不同血清型的特定交叉反应抗原决定簇，并且本文 使用的术语“抗体”意为包含所述片段。另外，也涵盖了根据本发明的单克隆或多克隆抗体 制备的抗血清，可通过本领域技术人员认可的许多适当方式制备。尽管使用重组形式的包含交叉反应抗原决定簇的蛋白质或其片段产生抗体是优 选的，抗体可从包含交叉反应抗原决定簇的蛋白质或其片段天然分离的或纯化的版本产 生，并且单克隆或多克隆抗体可使用包含交叉反应抗原决定簇的蛋白质或其片段以上述同 样的方式产生以获得此类抗体。被动免疫除了自动免疫，其中抗体在患者中通过施用致免疫量的包含交叉反应抗原决定簇 的蛋白质或其片段产生，本发明分离的抗体或其活性片段也可用于开发抵抗副猪嗜血菌感 染被动免疫的药物组合物和/或疫苗。本领域技术人员应认识到本发明的抗体(即能够识别交叉反应抗原决定簇的抗 体)也可形成适用于施用至人类或动物的药物组合物以治疗或预防由副猪嗜血菌细菌导
14致的感染。含有本发明抗体或其有效片段的药物组合物可联合本领域通常使用的任何适当 药学媒介物、赋形剂或载体制成，包括盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、其它治疗化合物及其组 合物。本领域技术人员应认识到所用特定媒介物、赋形剂或载体将根据目标受体和受体状 况而变化，本领域技术人员应认识到适合于本发明组合物的多种施用方式。施用药物组合 物的适当方法包括但不限于局部、口腔、肛门、阴道、静脉内、腹腔内、肌内、皮下、鼻内和皮 内施用。对于局部施用，组合物可以软膏、乳膏、凝胶、洗剂、滴剂(如眼滴剂和耳滴剂)或 溶液(如漱口剂)的形式制成。伤口或外科敷料、缝合线和气溶胶可使用该组合物浸透。组 合物可含有常规添加剂如防腐剂、促进渗透的溶剂和润滑药。局部制剂也可含有常规载体 如乳膏或软膏基、乙醇或油醇。本发明的抗体组合物也可与适当佐剂以有效增强免疫应答的量施用。例如，适当 佐剂可包括铝(磷酸铝或氢氧化铝)，其在人类中广泛使用，以及其它佐剂如皂苷及其纯化 成分Quil A、弗氏完全佐剂、RIBBI佐剂和其它用于研究和兽医应用的佐剂。其它化学确定 制剂的例子包括胞壁酰二肽，单磷酰脂质A、磷脂缀合物、将缀合物封装于脂蛋白体内和将 蛋白质封装于脂囊泡内。本发明识别上述交叉反应抗原决定簇的抗体组合物在预防或治疗副猪嗜血菌感 染的方法中是有用的。在一个实施方案中，本发明提供预防或治疗副猪嗜血菌感染的方法， 该方法包括施用有效量本发明所述交叉反应抗原决定簇抗体以治疗或预防副猪嗜血菌感
^fe ο一般而言，本发明抗体组合物的优选施用剂量是有效预防或治疗副猪嗜血菌感染 的量，应容易理解此量可根据感染性质和受试者状况而变化。根据本发明待使用的抗体或 药剂的“有效量”意指试剂无毒但足够的量，从而产生所需预防或治疗效果。所需抗体或特 定试剂的精确量将随受试者不同而变化，取决于物种、年龄和受试者一般状况、所治疗状况 的严重性、所用特定载体或佐剂及其施用方式等等。因此，任何特定抗体组合物的“有效量” 将基于特定情况而变化，适当有效量由本领域普通技术人员使用常规实验在每种应用情况 下确定。可调整剂量以适于施用组合物的个体受试者，根据个体的年龄、体重和代谢而变 化。组合物也可含有稳定剂和可药用防腐剂。因此，当有效量抗体组合物施用至人类或动物时，本发明的抗体提供在人类或动 物中治疗或预防副猪嗜血菌感染的方法，其中有效量足以预防或治疗细菌感染。本领域普 通技术人员应当认识到有效治疗或预防感染所需抗体滴度水平根据受试者的特性和状况 和/或任何在先感染的严重性而变化。此外，可修饰本发明抗体从而施用时是较低致免疫的。举例而言，述及抗体的人类 受试者时，该抗体可被“人源化”，通过移植杂交瘤来源的抗体互补决定区至人类单克隆抗 体中，或通过改变免疫球蛋白可变区中表面暴露的鼠骨架残基而被“镶嵌”，以模拟同源人 类骨架相应部分。再进一步，如果需要，本发明的单克隆抗体可联合适当抗生素施用，从而 进一步增强本发明组合物对抗细菌感染所必需的能力。因而，根据本发明，包含交叉反应抗原决定簇的蛋白质或其片段可用作自身疫苗， 并且本发明的抗体可用作被动疫苗，用于提供适当抗体以治疗或预防副猪嗜血菌感染。本 领域技术人员应当认识到可包装疫苗以用于多种适当施用方式，如胃肠外(例如肌内、皮内或皮下)施用或鼻咽(例如鼻内)施用。疫苗可被低压冻干以在施用时重悬浮或在溶液 中。诊断在其它方面，本发明的抗体也可用于特异性检测副猪嗜血菌蛋白质或用作研究工 具。上述抗体可直接通过可检测标签标记，用于鉴定和定量副猪嗜血菌细菌。用于免疫测 定的标签是本领域技术人员已知的，包括酶、放射性同位素(例如32P、3H、14C、35S、125I)和荧 光(荧光素及衍生物、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白、罗丹明和德克萨斯红)、发光物(例 如萤火虫荧光素)和显色物质包括有色颗粒如胶体金或乳胶微球。适当免疫测定包括酶联 免疫吸附测(ELISA)。如果需要，抗体可通过与对免疫球蛋白具有亲和性的标记物质反应而 间接标记。抗体可与第二物质缀合，并通过对缀合抗体的第二物质具有亲和性的标记的第 三物质检测。例如，抗体可缀合至生物素，抗体_生物素缀合物使用标记的抗生物素蛋白或 链霉抗生物素检测。抗体可缀合至半抗原，抗体_半抗原缀合物使用标记的抗半抗原抗体 检测。这些和其它标记抗体和测定缀合物的方法是本领域技术人员已知的。标签的检测可 通过多种方法进行，包括闪烁计数、Y射线光谱测定、放射自显影和荧光检测。因此，当与适当标签或其它合适可检测生物分子或化学试剂一起使用时，本文描 述的抗体在用于体内或体外诊断副猪嗜血菌感染或检测副猪嗜血菌细菌的目的中是有用 的。试剂盒另一方面，本发明提供分离和确定副猪嗜血菌细菌和感染的试剂盒。在一个实施 方案中，试剂盒包含适当形式的本发明分离的交叉反应抗体，如低压冻干于单个容器中，其 可通过添加怀疑含有副猪嗜血菌细菌的含水样品而激活。此类试剂盒一般包括适当装载适 当形式抗体以及适当免疫检测试剂的容器。一般而言，这些试剂盒可含有本发明的抗体和 说明书，用于确定当来自于受试者的样品引入抗体时抗体的结合。例如，适当免疫检测试剂 可以包括适当可检测信号或标签，如生物素或产生可检测颜色的酶等，其可连接至抗体或 以其它适当方式使用从而当抗体结合至抗原时提供可检测结果。在另一个实施方案中，试 剂盒包含副猪嗜血菌蛋白质或其片段，其包含交叉反应抗原决定簇。提供下述实施例仅是为了进行示例性说明。
实施例实施例1连续激发所有实验动物遵守下述操作规程和规定修订的美国公共卫生局关于实验动 物人道管理和使用方针(Public Health Service Policy on HumaneCare and Use of Laboratory Animals), sjj^tXM^^Wfl^ (theProvision of the Animal Welfare Act) 和其它适用的法律和规定。激发组合物的制备如下无菌棉头拭子浸入融化的大约5xl08菌落形成单位 (CFU)/ml的副猪嗜血菌储存液，轻柔拖动以覆盖巧克力琼脂板表面。培养物在5% CO2空 气中在37°C孵育48小时。然后用3毫升胨缓冲液使用细胞刮棒洗涤板，通过干酪包布去除 任何琼脂碎片。获得的液体然后通过胨缓冲液标准化至10D。此水平在大约1 11稀释时
16达到。在使用前材料存储在4°C大约1小时。十八只五周龄初乳无摄取、剖宫产(⑶⑶)的猪从Struve Labs，Inc获得。动物随 机放置至三组中9只猪放置至实验组，4只猪至对照组，5只猪至岗哨组(sentinel group) (表1)。所有动物给予鼻内插管以提供直通上呼吸系统的通道，根据分组圈养在控制通道 的房间。表1:动物分组和激发
实验组副猪嗜血菌血清型5激发副猪嗜血菌血清型5激发实验(9只动物)XX对照(4只动物)岗哨(5只动物)X在七周龄，实验组动物通过鼻内给予1毫升在胨缓冲液中稀释至530nm为0. 001 光密度(OD)的血清型5进行激发。岗哨和对照猪通过胨缓冲液激发。激发后，使猪恢复。 根据需要施用广谱抗生素。第一激发后九周，实验和岗哨组动物通过鼻内给予1毫升在胨缓冲液中稀释至 530nm为0. 0010D的血清型13进行激发。第二激发后24小时从每组随机选择三只动物进行尸体剖检。从这些动物中收获 呼吸和淋巴组织，无菌手术刀剪碎(macerated)，并放置于含有细胞培养基(带有抗菌剂) 的24孔板中以允许激活的细胞增殖。此培养基上清液用于进一步测试。剩余动物再观察 2周并进行尸体剖检。实施例2SDS/PAGE 和 Western 印迹一毫升冰冻5xl08CFU/ml副猪嗜血菌储存液涂布到巧克力琼脂板上。培养物在5 % 0)2空气中在37°C孵育48小时。然后使用四毫升磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤板，使用 吸量管诱发的流以悬浮细胞。重悬浮的细胞存储于4°C并在1周内使用。离心两毫升悬浮 物(9，000g, 1小时)，沉淀的细胞在200 μ 1的PBS中重悬浮，PBS洗涤细胞两次，通过穿过 18号针破坏细胞。洗涤的细胞悬浮物与含有2%吐温-20的PBS 1 1混合，在试管振荡 器中37°C孵育90分钟。孵育后，细胞通过离心去除(48，00(^，1小时)。培养物上清保持 并存储于4°C并在1周内使用。SDS-PAGE 使用 Criterion 系统用 12. 5%丙稀酰胺凝胶(Bio-RadLaboratories， Hercules，CA)进行。副猪嗜血菌细胞悬液以1 3稀释于PBS而在凝胶上泳动。吐 温-20提取物不稀释而在凝胶上泳动。凝胶通过GelCode Blue Stain Reagent (Pierce Biotechnology, Inc.，Rockford，IL)(一种基于考马斯的凝胶染料)染色。Western印迹使 用Protein Detector kit(KPL，Inc.，Gaithersburg，Maryland)进行。初级探测通过从激发 的猪中产生的免疫液体进行。山羊抗猪-HRP用作检测抗体。通过1 Component TMBMembrane Peroxidase Substrate (KPL, Inc. , Gaithersburg, Maryland)显像。
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从9只动物多种组织分离的激活细胞收获的上清针对血清型5副猪嗜血菌全细胞 进行筛选。高浓度的这些上清用于通过Western印迹显像。从猪47 (BL47)支气管淋巴结 获得高浓度和特异的抗体(图1)。此Western印迹中存在的原始条带模式指示存在于副猪 嗜血菌中的蛋白质被激发动物识别。选择BL47进行进一步比较分析。血清型之间识别的蛋白质通过第二套Western印迹进行进一步表征。首先筛选血 清型5和13。血清型5在大约28，33，45，56，63和76kDa显示显著条带。血清型13的条带 模式与血清型5相似并在28，45，55，62和75kDa含有显著条带。针对血清型4 (在猪激发 中未涉及的血清型)，测试的BL47也在28，34，41，47，57，62和77kDa产生显著条带。这三 种血清型的直接比较显示于图2。大约28，45，55，62和75kDa的蛋白质似乎在所有受测试 的血清型中都存在，对其进一步检查。使用连续激发产生的体液对多个血清型中存在的蛋白质进行鉴定。为增加样品中 膜结合蛋白质的相对浓度，通过吐温-20提取工艺对血清型5培养物进行加工。此方法以 前已经显示用于分离细菌外膜蛋白。进行该程序与未处理细胞在SDS-PAGE谱中产生极少 差异(图3;SDS-PAGE)。Western印迹中的条带也相似，证明存在我们最初的目标蛋白质。吐温-20加工的材料用于测序。此材料含有交叉反应蛋白质并且大部分细胞碎片 在加工过程中去除。因而，在PVDF膜上几个相邻带中运行此吐温-20制备物，用于条带切割 和测序。(图3;印迹)。选择用于测序的条带来自于血清型5，包括那些在 28， 45， 56， 63和 76kDa的条带。实施例3测序结果测序样品首先在SDS-PAGE上跑胶，然后转移至PVDF膜。对此膜进行染色，使用 保险刀片切下条带。在通过保险刀片切下的凝胶填料上进行质谱分析。转移缓冲液是含 20% MeOH 的标准 Tris/Glycine 缓冲液。膜通过 GelCode Blue Stain Reagent (Pierce Biotechnology, Inc.，Rockford, IL)染色，通过 25%异丙醇水溶液脱色。膜片段通过纯 化的去离子水充分淋洗。样品(即 28 45， 56， 63和 76kDa条带)使用质谱法进一步表征(图 4A-D)并进行氨基末端(埃德曼降解)测序。氨基末端测序结果提供了部分序列信息，其显 不于表2。表2 氨基末端测序结果
SPAKGSTIEAGIAYPISRA
Sepqatx1Dak
MKNLISIAKG
GEIEELALGI
MEKDVKFGNDARVGMLKGVNXKADA
1X代表未确定氨基酸。然后在Swiss-Prot数据库中对蛋白质片段的序列信息针对流感嗜血菌 (H. influenzae)和杜氏嗜血菌(H. ducreyi)进行BLASTp’d。对10个氨基酸以上蛋白质或 多氨基酸可能性在3个位置以下的蛋白质进行进一步分析。结果显示于表3。表3 蛋白质测序结果。
No.MW (kDa)Est. MW (kDa)E-值Swiss-Pro tID蛋白质名称/描述128220.76Q4QM69单功能生物合成肽聚糖糖基转移酶228342.5Q4QK43tRNA假尿苷合酶B328323.4Q4QJL4烯酰-丨酰基-载体蛋白质还原酶428688Q4QLZ8谷耽甘狀调节的钾外流系统556608.00E-08Q4QM48血红素结合蛋白A6a56580.041Q7VL18推测的ABC转运蛋白周质结合蛋白763610.33Q4QLH0周质寡肽结合蛋白863281.9Q4QNT7TonB (铁转运蛋白)976684.00E-09Q4QJW4伴侣蛋白dnaK (HSP70)1076240.59Q4QP42推测的N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-
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权利要求
确定包含交叉反应抗原决定簇分子的方法，该方法包括使至少一种抗体与第一抗原决定簇和第二抗原决定簇接触，其中该至少一种抗体从动物获得，该动物连续暴露于第一免疫组合物诱导的第一免疫激发，该第一免疫组合物包含第一抗原决定簇，随之是第二免疫组合物诱导的第二免疫激发，该第二免疫组合物包含第二抗原决定簇，其中该至少一种抗体与第一和第二抗原决定簇的结合指示交叉反应性，由此确定该分子。
2.权利要求1的方法，其中第一免疫组合物还包含第一多肽，该第一多肽包含第一抗 原决定簇，其中第二免疫组合物还包含第二多肽，该第二多肽包含第二抗原决定簇，其中第 一多肽由第一微生物表达，第二多肽由第二微生物表达，其中第一和第二微生物的特征在 于是相同物种的不同血清型。
3.权利要求2的方法，其中第一和第二微生物是细菌。
4.权利要求3的方法，其中细菌是副猪嗜血菌。
5.权利要求4的方法，其中第一微生物是血清型5，其中第二微生物是血清型13。
6.权利要求4的方法，其中第一和第二多肽各自为血红素结合蛋白或ABC-型转运蛋白。
7.确定包含交叉反应抗原决定簇的分子的方法，该方法包括a)在动物中激活记忆B细胞以产生至少一种抗体，其中激活包括通过该分子免疫激发 动物从而诱导激活记忆B细胞的免疫应答；和b)使该至少一种抗体与第二分子接触，其中该至少一种抗体与该分子和第二分子的结 合确定该分子。
8.权利要求7的方法，其中第二分子包含交叉反应抗原决定簇。
9.权利要求7的方法，还包括在记忆B细胞激活后体外培养该记忆B细胞。
10.分离的多肽，该多肽包含选自下述的氨基酸序列 ELANAI(SEQ ID NO 1)； TVLAEKQEII (SEQ ID NO 2)； APAKGSTIEAGIAYPIST (SEQ ID NO 3)； MKNLISI (SEQ ID NO 4)；禾口SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT (SEQ ID NO 5),其中该分离的多肽还包含副猪嗜血菌至少两种血清型表达的蛋白质中存在的交叉反 应抗原决定簇。
11.分离的多肽，其包含选自下述的氨基酸序列 ELANAI(SEQ ID NO 1)； TVLAEKQEII (SEQ ID NO 2)； APAKGSTIEAGIAYPIST (SEQ ID NO 3)； MKNLISI (SEQ ID NO 4)；禾口SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT (SEQ ID NO :5)，其中该分离的多肽还包含交叉反应抗原决定簇并由副猪嗜血菌血清型5表达。
12.疫苗，其包含预防或治疗有效量的权利要求10的分离的多肽，和可药用的媒介物、载体或赋形剂。
13.治疗或预防动物与副猪嗜血菌感染相关疾病、状况、或其症状的方法，该方法包括 向该动物施用有效量的权利要求11的疫苗，其中该有效量足以治疗或预防该疾病或状况。
全文摘要
本发明提供用于确定包含交叉反应抗原决定簇的免疫交叉反应分子的组合物和方法，尤其用于确定包含交叉反应抗原决定簇的蛋白质的组合物和方法，尤其用于确定基于血清筛选使用连续免疫激发动物的交叉反应蛋白质的组合物和方法，包括确定交叉反应副猪嗜血菌(H.parasuis)蛋白质。也提供使用该分子诊断的组合物、疫苗及试剂盒，以及用于预防或治疗与传染原相关的疾病、病症、状况、或其症状的方法，该传染原尤其是有传染性的微生物，尤其用于预防或治疗与副猪嗜血菌感染相关的疾病、病症、状况、或其症状的方法。
文档编号A61K39/102GK101981052SQ200980111336
公开日2011年2月23日 申请日期2009年3月20日 优先权日2008年3月28日
发明者D·基尔, M·坎珀斯, R·哈兰德, T·哈比森, T·普洛赫尔, T·约翰逊 申请人:诺瓦提斯公司