专利名称：由兰科植物得到的提取物、生产所述提取物的方法和包含所述提取物的皮肤外用剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及由兰科植物得到的提取物、生产该提取物的方法和包含该提取物的皮 肤外用剂。
背景技术：
由兰科植物得到的提取物迄今已用在化妆品等中，因为这类提取物对皮肤 具有增湿效果、皮肤调理效果、皮肤增白效果、抗老化效果等。例如，以下专利文献 艮口 JP-A-2007-008911、JP-A-2007-077079、JP-A-2006-282536、JP-A-2005-179219、 JP-A-2004-067549、JP-A-2002-205933、JP-A-2002-003336、日本专利 No. 3526590、日本专 利 No. 3090156, JP-A-H2-279618 (1990)和 JP-A-S57-102809 (1982)公开了包含由兰科植物 得到的提取物的化妆品、皮肤增湿剂和皮肤外用剂。作为用于得到提取物的兰科植物，上述专利文献公开了例如手参属(Gymnadenia) (JP-A-2007-077079)、卡特兰属(Cattleya)(JP-A-2006-282536， JP-A-2004-067549)、 虾脊兰属(Calanthe)、鹤顶兰属(Phaius) (JP-A-2005-179219),白芨(Bletilla striata)> ^ (Cephalanthera falcata)、 fH 3 (Cremastra appendiculata)、 兰(Cymbidium goeringii)、Dactylorhiza aristata、Dendrobium moni1iforme、 Epipactis thunbergii、Galeola septentrionalis、天麻(Gastrodia elata)、鸟巢兰 (Neottia nidusavis)、红门兰属(Orchis)、Vanilla fragrans (JP-A-2002-205933)、兰 属(Cymbidium) (JP-A-2002-003336)、Dactylorhiza、头蓝兰属(C印halanthera)、鸟巢兰 属(Neottia)、火烧兰属(Epipactis)(日本专利 No. 3526590)、蝴蝶兰属(Phalaenopsis) (日本专利 No. 3090156)、石斛属(Dendrobium)、卡特兰属(Cattleya)、兰属(Cymbidium)、 春兰(Cymbidium goeringii)(JP-A-H2-279618 (1990))和白芨(Bletilla striata) (JP-A-S57-102809(1982))。据说存在20000种或更多的兰科植物物种，并且兰科是被子植物的最大的科，占 其大约10%。分布区域从热带区域到寒冷区域，而且兰科植物在每种环境中都能生长，除 了极干燥区域外。因此，这类植物在生态和形态性质方面非常多样化，并存在许多关于兰科 植物谱系和分类的理论(“Sekai no Chinran Kiran daizukan，，，Seibundo Shinkosha,日 本，2006)。因此，属于不同属的兰科植物在形态如花、叶、茎和根方面彼此不同。而且，可容 易地推定来自其的提取物的组分彼此不同。已知用作增湿剂的天然多糖的例子包括源自动物的多糖如透明质酸和源于植物 的多糖如温梓属、Tremella fuciformis 和芦菩属(FRAGRANCE JOURNAL，日本，2005 年 3 月)。而且，上面提到的专利文献指出，在由兰科(Orchidaceae)植物即兰属(Cymbidium) (JP-A-2002-003336)、石斛属(Dendrobium)、卡特兰属(Cattleya)、兰属(Cymbidium)、春 兰(Cymbidium goeringii)根莲(JP-A-H2-279618 (1990))和白芨(Bletilla striata) 块茎(JP-A-S57-102809(1982))得到的提取物中包含多糖，它们还指出，这种多糖具有润
3湿效果。通常已知多糖由经糖苷键连接的多种单糖组成，存在多种多糖，并且天然多糖在 糖组成、结构、分子量等方面彼此不同，取决于它们的来源。例如，透明质酸为由交替连接 的N-乙酰基葡糖胺和葡糖醛酸组成的线性多糖聚合物，银耳(Tremella fuciformis)多 糖为主要由甘露糖、木糖和葡糖醛酸组成的酸性杂多糖，由温梓属表皮提取的多糖为其中 阿拉伯糖、木糖或糖醛酸被连接的酸性杂多糖(FRAGRANCE JOURNAL,日本，2005年3月)， 芦荟属多糖为包括11 0.2 1的甘露糖、半乳糖和葡萄糖的杂多糖(“Modified Aloe barbadensis Polysaccharide with Immunoregulatory Activity”， Plant Medica，66， 152-156，2000)，由白芨块茎提取的多糖(即白芨属(Bletilla)葡甘露聚糖)为包括3 1 的甘露糖和葡萄糖的杂多糖(“Plant Mucilages. VIII. Isolation and Characterization of a Mucous Polysaccharide,"Bletilla-glucomannan,，，from Bletilla striata Tubers. ”，Chem. Pharm. Bull. 21 (12) 2667-2671，1973)。关于源自兰科植物的多糖，除了白 芨块茎中包含的白芨属葡甘露聚糖外没有描述，其细节仍未阐明。除了兰科植物外，象牙棕榈树、瓜尔豆、长角豆(Ceratonia siliqua)、tara等被列 为包含大量甘露聚糖化合物的植物。已知对由来自上面植物的甘露聚糖化合物提取物中包 含的甘露聚糖化合物进行酸性水解产生甘露糖(JP-A-2000-70000)。发明公开内容发明要解决的问题本发明的目的是由属于兰科的植物得到具有较高保湿效果水平等的提取物，和提 供包括这类提取物的皮肤外用剂。解决问题的手段为了达到上述目的，本发明人进行了广泛研究。结果，本发明人现在发现，由属于 兰科特定属的植物得到的提取物具有较高的保湿效果水平等，这种发现导致了本发明的完 成。本发明概述如下。[1]由兰科(Orchidaceae)齿瓣兰属(Odontoglossum)的植物或源于齿瓣兰属和 蜗瘤兰属(Cochlioda)的杂交植物的植物得到的提取物，具有下面的特征(1)至(4)(1)提取物包含多糖占大约60重量％至70重量％的糖组分；(2)多糖的90%或更多的构成糖为甘露糖；(3)甘露糖通过3 -1，4糖苷键连接；和(4)提取物具有增湿效果。[2]根据[1]的提取物，其还具有下面的特征(1) 一部分甘露糖分子在位置2、3或6处有分枝。[3]根据[1]或[2]的提取物，其还具有下面的特征(1)提取物具有增加透明质酸产生的作用、增加神经酰胺产生的作用和增加IV型 胶原产生的作用。[4]根据[1]至[3]中任何一项的提取物，其还具有下面的特征(1)提取物抑制脂质过氧化物的产生。[5]根据[1]至[4]中任何一项的提取物，其中源于齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植 物的植物为齿唇兰属(Odontioda)植物。
[6]根据[1]至[5]中任何一项的提取物，其中兰科植物为选自Lavender Lace “Sylvan，，、Marie Noel "Velano，，和 Augres "Royal Sash，，组成的组中的品种。[7]根据[1]至[6]中任何一项的提取物，其中用于提取的植物材料包含花。[8] 一种制备根据[1]至[7]中任何一项的提取物的方法，包括以下步骤使包含兰科齿瓣兰属的植物或源于齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物的植物的花 的植物部分与包含水、亲水有机溶剂或其混合物的溶剂混合；加热并提取植物部分和溶剂的混合物；和得到提取物。[9]根据[8]的方法，其中加热和提取步骤包括在60°C -120°C的温度下加热然后 冷却到0°C -60°c的温度下用于提取。[10]根据[8]或[9]的方法，其中溶剂为水和1，3_ 丁二醇的混合物。[11]根据[1]至[7]中任何一项的提取物，其中提取物通过根据[8]至[10]中任 何一项的方法得到。[12] 一种皮肤外用剂，包括根据[1]至[7]和[11]中任何一项的提取物作为活性 成分。[13]根据[12]的皮肤外用剂，其中其被用于药物或化妆品。发明优点本发明的提取物具有较高的粘性水平和较高的增湿效果水平，如保湿效果、增加 皮肤表面水分含量效果、增加透明质酸产生效果、增加神经酰胺产生效果和在表皮角化细 胞中增加IV型胶原产生效果。提取物还抑制脂质过氧化物产生。本发明的提取物可用作 皮肤用皮肤外用剂的活性成分(例如增湿剂或化妆品)。本说明书包括如本申请优先权文件日本专利申请No. 2008-129943的说明书和/ 或附图中公开的全部或部分内容。附图简述
图1显示了实施例11中抑制脂质过氧化物产生的效果。图2显示了实施例12中利用试验(1)的保湿效果。图3显示了实施例13中利用试验(2)的保湿效果。图4显示了实施例14中增加皮肤表面水分含量的效果。图5显示了实施例28中增加IV型胶原产生的效果。A图显示了对照的染色结果。 B图显示了加入实施例1的提取物的情况的染色结果。实施发明的最佳方式(1)用于得到提取物的植物本发明的提取物可从兰科齿瓣兰属植物或齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物得到。 术语“齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物”是指祖先为齿瓣兰属植物和蜗瘤兰属植物的植物。 除了齿唇兰属植物，其为二种属即齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交物外，这种杂交植物包括通 过使二种属即齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物与一种或更多种能与齿瓣兰属杂交的属杂 交产生的植物，可使用。在本说明书中，兰科植物按照Phylogeny and Classification of the Orchid Family (Robert L. Dressier IH^ )齿瓣兰属植物属于柱瓣兰(Epidendrum)亚科中Maxillarieae族Oncidiinae亚
5族，它们在从中美洲到南美洲的热带和亚热带区域中的山区中生长。这类植物为中等至大 尺寸寄生兰并产生多禾中花(Yamakei Color Meikan, Ran (orchid), Yama-kei Publishers, 日本，1996)。本发明中使用的兰科植物包括但不特别限于例如品种Augres “Royal Sash”(品种登记号 10588，按照 Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)、 Harvengtence “Tutu，， ( n口n禾中gi己^ 10942, Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)和 Puccini “Rimo”(品种登记号 16093，按照 Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)，品种 Augres "Royal Sash，，是尤其优选的。齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物包括但不特别限于齿唇兰属植物和Wilsonara 属植物，齿唇兰属植物是优选的。齿唇兰属为使两个属(即齿瓣兰属和蜗瘤兰属)杂交得到的人工属，它的许 多品种产生大尺寸和各种颜色的花(Yamakei Color Meikan, Ran (orchid), Yama-kei Publishers.，日本，1996)。齿唇兰属植物包括齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物、齿唇兰属 和齿瓣兰属的杂交植物、齿唇兰属和蜗瘤兰属的杂交植物以及齿唇兰属和齿唇兰属的杂交 植物。Wilsonara属为使三个属齿瓣兰属、蜗瘤兰属和金蝶兰属(Oncidium)杂交 得到的人工属。它的许多品种具有长的花茎、多花并且耐寒(Yamakei Color Meikan, Ran (orchid)，Yama-kei Publishers,日本，1996)。Wilsonara 属植物的例子包括齿瓣兰属 和金蝶兰属的杂交植物、齿唇兰属和Odontocidium的杂交植物、齿唇兰属和Wilsonara的 杂交植物以及齿瓣兰属和Wilsonara的杂交植物。齿唇兰属植物的例子包括品种Lavender Lace "Sylvan"(品种登记号11539，按 照 Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)、Marie Noel "Velano，，(品禾中登 记号 3740,按照 Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)、Baiser "Aubigne，， 和 Nichirei Strawberryfield "Orion Star”(品种登记号 10344，按照 Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)。品禾中Lavender Lace"Sylvan”禾口Marie Noel"Velano" 是尤其优选的。Wilsonara属植物的例子包括品种Nichirei Gold "Star Gazer”(品种登记号 15106,按照 Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)禾口 Leucadia "Autumn Leaf” (品种登记号 14753，按照 Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)。齿瓣兰属植物、蜗瘤兰属植物、齿唇兰属植物和Wi 1 sonara属植物在它们的 属和族以及另外植物分布、形态等方面不同于上述专利文献(即JP-A-2007-008911、 JP-A-2007-077079、 JP-A-2006-282536、 JP-A-2005-179219、 JP-A-2004-067549、 JP-A-2002-205933、JP-A-2002-003336,日本专利 No. 3526590、日本专利 No. 3090156、 JP-A-H2-279618(1990)和 JP-A-S57-102809 (1982))中描述的兰科植物。(2)提取方法本发明的制备提取物的方法包括使含花的植物部分与由水、亲水有机溶剂或其混 合物组成的溶剂混合并加热和提取植物部分与溶剂的混合物的步骤和得到提取物的步骤。 用于提取的植物可为新鲜的、半干的、干的或冻干的，优选冻干的。此外，植物可被充分磨碎 或切断或不发生变化，磨碎的植物是优选的。用作提取材料的植物部分可为种、根、茎、叶、 花、球茎或整个植物，优选包含花的植物部分，更优选单独花。上述品种的植物可单独使用
6或联合二种或更多种使用。作为溶剂，可使用水、亲水有机溶剂或它们的混合物。亲水有机溶剂的使用是优选 的，因为可得到具有较高粘度的提取物。溶剂的具体例子包括但不特别限于纯水、净化水、 醇如甲醇、乙醇、丁醇、丙二醇、甘油和1，3_ 丁二醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈、1，4_ 二P恶烷、吡 啶、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和乙酸。优选的溶剂为甲醇、丁醇、丙二醇、甘油和1，3_ 丁 二醇。亲水有机溶剂可单独用于提取，但使用亲水有机溶剂和水的混合物是优选的。在这种 情况下，亲水有机溶剂的浓度优选为lOvol %至90vol %，更优选20vol %至60vol %，还更 优选25vol%至35vol%。或者，二种或更多种亲水有机溶剂可被混合并用于提取。例如， 乙醇、1，3_ 丁二醇和水可被混合。加入到植物的溶剂的数量优选为100ml至1000ml、更优 选200ml至600ml每100g植物，但没有特殊限制。将溶剂加入到植物中，然后加热30秒到1小时并优选10-15分钟。加热温度为 60°C至120°C并优选80°C至90°C。然后，冷却混合物，优选急冷，到0°C至60°C并优选20°C 至30°C，用于提取。冷却后的提取时间为1小时到7天并优选8小时到16小时(或过夜)， 但没有特殊限制。通过在提取的开始阶段加热和冷却植物，可得到具有较高粘度的提取物。 这样得到的提取物在储存期间表现出随时间变化的良好粘度稳定性。认为降解粘性组分的 酶等包含在植物中并通过加热被灭活。此外，可防止提取物褐变，并能保持浅黄色到红色的 色调。(如果使用花，则花的颜色反映所述色调)。提取后，可在需要时通过过滤、离心或其它手段除去残渣。另外，可进行浓缩或纯 化步骤。这类步骤可通过各种已知的技术来进行，如真空浓缩、冻干、用乙醇溶剂沉淀，各种 色谱技术如在DEAE柱上的离子交换色谱、凝胶过滤色谱和HPLC，以及超滤。(3)提取物通过上面方法(2)得到的提取物包括糖、蛋白质、多元酚等，并且它具有高的粘 度。提取物中固体的主要组分为糖，并且糖组分的大约60wt% _70衬％或更多由多糖组 成。当转化成单糖时，提取物的糖成分包括40wt% -60wt%的甘露糖和15wt% -25wt % 的葡萄糖。可通过进一步纯化从提取物中完全除去果糖，并且提取物可包含大约2衬％至 5衬％葡萄糖。在提取物中包含的多糖的全部构成糖为100衬％时，则其90wt%或更多、优 选95衬％或更多和更优选97衬％或更多由甘露糖组成。多糖的纯化产物(下面描述的实 施例10(iv)、实施例21(iv)和实施例22(iv)中)包括甘露糖和葡萄糖，并且它们的组成 (重量比计)优选为90 10至99 1，更优选95 5至98 2。并且纯化产物包含含有 大量经3 _1，4糖苷键连接的甘露糖分子的多糖聚合物。部分甘露糖分子在位2、3或6处 分枝。提取物的纯化产物具有较高的粘度，但当酶降解(通过0 -1,4-甘露聚糖酶)时 粘度降低(见实施例10)。因此，纯化产物中包含的多糖被认为有助于粘度。提取物的粘度 为例如0. 01-0. 6Pa s(10-600cP)，当使用正弦波振荡粘度仪在25°C下测量时。提取物具 有增湿作用。具体地，提取物具有保湿作用、增加皮肤表面水分含量作用、增加透明质酸产 生作用、促进神经酰胺产生作用和促进表皮角化细胞中IV型胶原产生作用。此外，提取物 抑制脂质过氧化物产生。这种生物效果(或作用)在下面的实施例中被证实。而且，包括 这类提取物的化妆品没有粘着性或紧缩性并能充分渗透皮肤。(4)皮肤外用剂
本发明的皮肤外用剂在其应用方面不受特殊限制，只要它为能被施加到皮肤用在 药物或化妆品如增湿剂和化妆品剂中的剂型即可。剂型的例子包括膏剂、凝胶、液体、混悬 液、粉剂、泡沫和固体。具体例子包括护手霜、洗液、乳液、精华素(beauty essense)、面霜、 清洁霜、面皂、面膜、剃须泡沫、晒黑霜、晒黑露、防晒霜、防晒露、妆底(makeup base)、粉底 (foundation)、扑面粉、粉剂、口红、唇膏、眼线膏、眼霜、眼影膏、睫毛膏、洗发液、冲洗液、护 发素(conditioner)、染发剂、沐浴露和润肤乳。皮肤外用剂中本发明的提取物的含量优选为0. 000 lwt %至25wt %，更优选 0. 1衬％至15wt%。除了提取物外，可任选地添加皮肤外用剂中可用的各种组分如增湿剂、 皮肤增白齐IJ、抗氧化齐IJ、增稠剂、油组分、抗菌齐IJ、乳化剂和紫外线吸收剂到皮肤外用剂中。 增湿剂的例子包括粘多糖如透明质酸或硫酸软骨素或它们的衍生物；蛋白质如胶原、弹 性蛋白或角蛋白或它们的衍生物；氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸或 它们的衍生物；糖如山梨糖醇、海藻糖、葡萄糖或蔗糖；脲；磷脂；神经酰胺；植物提取物如 芦荟属提取物或温梓属提取物；和多元醇如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇。皮肤增白剂的例子 包括维生素C和其衍生物、维生素E和其衍生物、维生素A和其衍生物、glycyrphosphate和 其衍生物、甘草甜素和其衍生物、烟酰胺、熊果苷、曲酸、鞣花酸、亚油酸、凝血酸、胎盘提取 物和植物提取物如甘菊提取物、黄苓提取物、葡萄提取物、印度樱桃(acelora)提取物、卡 姆果(Camu Camu)提取物和卡姆果种提取物。抗氧化剂的例子包括超氧化物歧化酶、甘露 醇、栎精、儿茶素、虾青素、维生素A、维生素B、维生素E、二丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、 辅酶Q10、a _硫辛酸和植物提取物如印度樱桃种提取物。增稠剂的例子包括天然存在的聚 合物如卡拉胶、果胶、琼脂、阿拉伯胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、黄原胶、温梓属籽、明胶和淀粉，纤 维素聚合物如甲基纤维素和羟基纤维素，丙烯酸聚合物如羧基乙烯基聚合物，褐藻酸聚合 物如褐藻酸钠，和醇如十六十八醇和山嵛醇。油组分的例子包括角鲨烷、荷荷芭油(jojoba oil)、蓖麻油、红花油和橄榄油。抗菌剂的例子包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、 对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、山梨酸、脱氢丁酸和苯氧基乙醇。乳化剂的例子包 括单硬脂酸甘油酯、氢氧化钾和硬脂酸。紫外线吸收剂的例子包括对-氨基苯甲酸紫外线 吸收剂、水杨酸紫外线吸收剂、肉桂酸紫外线吸收剂、邻氨基苯甲酸紫外线吸收剂和二苯甲 酮紫外线吸收剂。此外，可添加表面活性剂、螯合剂、染料、pH调节剂、香料、清凉剂、血流加速剂、角 质层分离剂、收敛剂、伤口愈合剂、发泡剂、抗过敏药或细胞活化剂。下文中，参考实施例描述本发明，但本发明不限于此。
实施例实施例1 制备提取物的方法(1)在冷冻机(MedicalFreezer, SANYO)中在 _40°C下冷冻齿唇兰属 Lavender Lace “Sylvan” 的花(100g) 1 周或更长，在冻干机(Freeze-Dryer，TRIO SCIENCE CO.，LTD.)冻 干 4 天，并使用 Labo Milser(Iwatani Corporation)研磨。在加入 30vol% 1，3-丁二醇水 溶液(500ml)后，在80°C -90°C下对混合物进行搅拌和提取10分钟，然后立即冷却，然后在 25°C下搅拌和提取过夜。过滤后，得到数量为400ml的提取物(固体浓度1. 4wt% )。实施例2 制备提取物的方法(2)
按与实施例1相同的方式得到提取物(400ml)(固体浓度0. 55wt% )，除了使用 齿唇兰属Lavender Lace “Sylvan”整个植物(花、茎、叶、根和球茎)(lllg)并加入555ml 30vol% 1，3-丁二醇的水溶液以外。实施例3 制备提取物的方法(3)按与实施例1相同的方式得到提取物(400ml)(固体浓度1. lwt% ),除了使用 100g齿瓣兰属Augres "Royal Sash”的花以外。实施例4 制备提取物的方法(4)按与实施例1相同的方式得到提取物(400ml)(固体浓度0. 60wt% )，除了使用 齿瓣兰属Augres "Royal Sash”整个植物(花、茎、叶、根和球茎)(93. 5g)并加入467ml 30vol% 1，3-丁二醇的水溶液以外。实施例5 制备提取物的方法(5)按与实施例1相同的方式得到提取物(400ml)(固体浓度1. lwt% ),除了使用 100g齿唇兰属Marie Noel “Velano”的花以外。实施例6 制备提取物的方法(6)按与实施例1相同的方式得到提取物(400ml)(固体浓度0. 73wt% )，除了使 用齿唇兰属Marie Noel “Velano”整个植物(花、茎、叶、根和球茎)(101g)并加入505ml 30vol% 1，3-丁二醇的水溶液以外。实施例7 粘度测量使用正弦波振动粘度计SV-10 (A&D)测量按实施例1、实施例3和实施例5中描述 的方式制备的提取物在25°C下的粘度。使用提取物的溶剂(30vol% 1，3-丁二醇的水溶 液)作为对照。为了比较，通过专利文献ll(JP-A-57-102809(1982))的实施例中描述的方 法制备已知包含粘液(葡甘露聚糖)的白芨块茎的热水提取物。将这种提取物在30vol% 1，3_ 丁二醇中稀释至lwt%，以便得到与实施例在固体浓度、溶剂类型和溶剂浓度方面相 同的条件。结果显示在表1中。发现实施例1、3和5的提取物的粘度为白芨块茎提取物粘 度的5倍或更高。此外，发现实施例1、3和5提取物充分渗透皮肤并发现没有粘着性或紧 缩性。表 1
粘度 Pa.s (cP)Lavender Lace "Sylvan"花提取物(实施例 1)0.0986 (98.6)Augres "Royal Sash"花提取物(实施例3)0.0446 (44.6)Marie Noel "Velano"花提取物(实施例5)0.0499 (49.9)白芨块茎提取物0.00909 (9.09)对照(30% 1，3-丁二醇)0.00391 (3.91)实施例8 实施例1中得到的Lavender Lace "Sylvan"花提取物的组分分析为了弄清通过实施例1的方法得到的提取物的组分，测量糖含量、多酚含量和蛋 白质含量。试验方法和结果显示在下面。(i)糖含量测量(通过苯酚_硫酸方法)[试验方法和结果]
9
向500 ill用蒸馏水稀释500倍的提取物的溶液中加入500 u 14vol%苯酚的水溶 液。然后快速滴加2. 5ml浓硫酸，并搅拌混合物。在水浴中冷却产物5分钟，然后在30°C下 加热10分钟。在485nm下测量吸光度。使用葡萄糖标准溶液制备校准曲线确定提取物中 糖的总数量。提取物中的糖含量为12323ii g/ml，并且固体组分(1.4wt%)的大约88wt% 为糖。(ii)多酚含量的测量(通过Folin-denis方法)[试验方法和结果]使用C18 柱(S印-Pak Vac 35cc C18 Cartridge :Waters)纯化用蒸溜水(80ml)稀 释6倍的提取物1的溶液得到28. 9mg吸附组分的干物质。将干物质溶解在50vol %甲醇的 水溶液中调整固体含量至，并用蒸馏水将得到的溶液稀释100倍制备测量用样品。向 200 u 1样品中加入3. 2ml蒸馏水和200 u 1 Folin-Ciocalteu，s酚试剂(Merck)，搅拌混合 物，向其中加入400 u 1饱和碳酸钠水溶液，搅拌混合物，使所得物静置60分钟，并在700nm 下测量吸光度。通过加入蒸馏水而不是Folin-Ciocalteu’ s酚试剂进行空白试验。使用儿 茶素标准溶液制备校准曲线确定样品中的多酚含量，然后确定提取物中的多酚含量。发现 提取物包含0. lmg/ml的多酚，并发现固体组分(1.4wt% )的大约1衬％为多酚。(iii)蛋白质含量测量(通过Lowry方法)使用DC蛋白质分析试剂盒(Bio Rad Laboratories)测量蛋白质含量。向200 yl 用30vol% 1，3-丁二醇水溶液稀释7倍的提取物的溶液中加入100 yl试剂A，并搅拌混 合物，向其中加入800 yl试剂B，搅拌混合物，并使所得物静置15分钟，在750nm下测定 吸光度。使用BSA标准溶液制备校准曲线测定提取物中的蛋白质含量。发现提取物包含 1529.0ug/ml的蛋白质，并发现固体含量(1.4wt% )的大约10wt%为蛋白质。上述分析结果表明，提取物的主要组分为糖，并且提取物包含蛋白质和多酚作为 其它组分。实施例9 实施例1中得到的Lavender Lace "Sylvan"花提取物的糖组成分析为了弄清作为提取物主要组分的糖的种类，分析通过实施例1的方法制备的提取 物中糖的组成。通过二种方法进行分析即利用降解测量糖组分的方法和没有降解情况下 测量仅仅自由糖的方法。试验方法和结果显示在下面。(i)经过降解处理的分析[样品制备]在减压下干燥提取物(40 u 1)，向其中加入200 u 1 2mol/l三氟乙酸的水溶液，并 在真空密封管中在100°c下水解提取物6小时，然后在减压下再次干燥。将干物质溶解在 200 u 1蒸馏水中并通过0. 22- u m过滤器过滤。[测量中性糖的方法]使用HPLC系统(LC-9A系统Shimadzu Corporation,日本)测量制备的样品。测 量条件显示在下面。柱TSK-凝胶Sugar AXG 15cmX4. 6mm(I. D.) (Tosoh Corporation,日本)柱温度70°C流动相0. 5M硼酸钾缓冲液，pH 8. 7流动相流速0.4ml/min
10
反应试剂精氨酸硼酸反应试剂流速0. 5ml/min反应温度150°C检测器荧光分光光度计RF_10AXL(Shimadzu Corporation,日本)检测波长:Ex. = 320nm, Em. = 430nm使用鼠李糖、核糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖和蔗糖的标准溶 液制备校准曲线。结果显示在表2中。[测量酸性糖的方法]使用HPLC系统(LC-9A系统Shimadzu Corporation,日本)测量制备的样品。测 量条件显示在下面。ft :Shimpack ISA-07 25cmX4. 6mm(I. D.) (Shimadzu Corporation,日* )柱温度70°C流动相1M硼酸钾缓冲液，pH 8. 7流动相流速0.8ml/min反应试剂精氨酸硼酸反应试剂流速0. 8ml/min反应温度150°C检测器荧光分光光度计RF-10AXL (Shimadzu Corporation,日本)检测波长:Ex. = 320nm, Em. = 430nm使用半乳糖醛酸、艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸的标准溶液制备校准曲线。结果显示 在表2中。表权利要求
由兰科齿瓣兰属的植物或源于齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物的植物得到的提取物，具有下面的特征(1)至(4)(1)提取物包含多糖占大约60重量％至70重量％的糖组分；(2)多糖的90％或更多的构成糖为甘露糖；(3)甘露糖通过β 1，4糖苷键连接；和(4)提取物具有增湿效果。
2.根据权利要求1的提取物，其还具有下面的特征 (1) 一部分甘露糖分子在位置2、3或6处有分枝。
3.根据权利要求1或2的提取物，其还具有下面的特征(1)提取物具有增加透明质酸产生的作用、增加神经酰胺产生的作用和增加IV型胶原 产生的作用。
4.根据权利要求1至3中任何一项的提取物，其还具有下面的特征 (1)提取物抑制脂质过氧化物的产生。
5.根据权利要求1至4中任何一项的提取物，其中源于齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植 物的植物为齿唇兰属植物。
6.根据权利要求1至5中任何一项的提取物，其中兰科植物为选自Lavender Lace “Sylvan，，、Marie Noel "Velano，，和 Augres "Royal Sash，，组成的组中的品种。
7.根据权利要求1至6中任何一项的提取物，其中用于提取的植物材料包含花。
8.一种制备根据权利要求1至7中任何一项的提取物的方法，包括以下步骤 使包含兰科齿瓣兰属的植物或源于齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物的植物的花的植物部分与包含水、亲水有机溶剂或其混合物的溶剂混合； 加热并提取植物部分和溶剂的混合物；和 得到提取物。
9.根据权利要求8的方法，其中加热和提取步骤包括在60°C-120°C的温度下加热然后 冷却到0°C -60°c的温度下用于提取。
10.根据权利要求8或权利要求9的方法，其中溶剂为水和1，3_丁二醇的混合物。
11.根据权利要求1至7中任何一项的提取物，其中提取物通过根据权利要求8至10 中任何一项的方法得到。
12.—种皮肤外用剂，包括根据权利要求1至7和11中任何一项的提取物作为活性成分。
13.根据权利要求12的皮肤外用剂，其中其被用于药物或化妆品。
全文摘要
本发明涉及由兰科齿瓣兰属的植物或由源于齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物的植物得到的提取物，制备提取物的方法，和包括提取物的皮肤外用剂。
文档编号A61K8/97GK101980695SQ200980111540
公开日2011年2月23日 申请日期2009年3月27日 优先权日2008年5月16日
发明者佐佐木晶子, 川口将和, 桧物绫香 申请人:株式会社日冷生物科学