免疫原、组合物及其用途和制备方法

专利名称：免疫原、组合物及其用途和制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫原的制备、其制备方法以及其在表达系统中用于产生重组蛋白的用途。本发明描述了通过缀合(通过化学或物理方法)添加至无关抗原或通过整合入重组抗原或整合在包含抗原的无关序列的质粒DNA链中而添加至无关抗原的序列，其目的在于产生针对所述无关抗原的免疫应答。本发明描述了新的佐剂，其应用可导致免疫原(包括含有肽序列的重组蛋白)的产生，所述免疫原诱导免疫应答，其特征在于产生特异性抗体。在本申请中，无关片段产生(对于低免疫原性的抗原)免疫特性，其引起(仅通过向宿主施用)宿主产生免疫应答,特征特别地在于产生特异性免疫球蛋白。
发明概述本发明的目的是描述因将肽(具有来源于肝片形吸虫的钙结合蛋白的被称作H片段的MPSVQEVEKLL序列)添加至无关抗原而产生免疫原的方法。所得的构建体具有以下免疫特性当给个体施用时触发特征在于针对无关抗原的特定抗体的产生的免疫应答。本发明对于目的在于通过施用由片段H和无关抗原组成的免疫原而由个体产生针对抗原的免疫应答的任何应用是有用的。本发明描述了新型佐剂的应用，所述佐剂可在研究和开发或工业水平上用于下列领域例如多克隆和单克隆抗体的产生、免疫疗法和免疫预防。本发明代表目前佐剂的另一选择并且，当用于表达重组抗原的系统中时允许这样的蛋白质的产生，所述蛋白质具有在无任何其它添加剂的情况下导致能够产生免疫应答的个体产生免疫应答的免疫原性特征。目前，抗体的制备中的最大挑战之一是获得充足的免疫原性抗原来产生免疫应答。当抗原不具有免疫原性或免疫性较低时，抗原和佐剂的施用用于增强免疫应答。此类佐剂具有潜在毒性，可引起被注射的宿主的疼痛，从而其使用是被高度劝阻的，或者，许多佐剂甚至被禁用。本申请的有利方面在于现有技术中这一点上，因为其描述了允许获得具有在不使用佐剂的情况下产生免疫应答的免疫原性特征的经修饰的抗原的方法。本发明的实施方式之一是由如下组成的免疫原的描述-来自由肝片形吸虫的成虫排泄/分泌的钙结合蛋白的氨基酸序列的部分，其与被称作片段H的SEQ ID NO 2具有相同的序列或具有至少90%的结构相似性；-无关目标蛋白质或蛋白质片段。本发明的另一个优选实施方式是目标蛋白质或目标蛋白质片段是病原性蛋白质例如病毒蛋白质、细菌蛋白质或来自原生动物的蛋白质。甚至更优选地，目标蛋白质或蛋白质片段可以是CWG、CD4、IL5、Pfsp、Ent、PAL、CP12、LEC、BG或Toxo蛋白或蛋白片段。在其它优选实施方式中，上文中描述的免疫原可用作药剂。甚至更优选可用作疫苗或佐剂。我们注意到，在一些情况下甚至更优选，可用作疫苗，所述疫苗仅包含-来自由肝片形吸虫的成虫排泄/分泌的钙结合蛋白的氨基酸序列的部分，其与被称作片段H的SEQ ID NO 2具有相同的序列或具有至少90%结构相似性；-目标无关蛋白质或蛋白质片段。另一个优选实施方式是包含上述免疫原的组合物的描述，优选地组合物可以包含治疗有效量的免疫原和药理学上适当的媒介物例如赋形剂、佐剂等等。在另一个优选实施方式中，组合物可仅包含100%的上述免疫原之一。在甚至更优选地进行中，组合物可由下列成分构成具有在100至1000 μ I的缓冲磷酸盐溶液(O. OlM磷酸盐，O. IM NaCl, pH 7. 2)中稀释的I至100 μ g的浓度的上述免疫原。本发明的另一个实施方式是包含上述免疫原之一或上述药物组合物之一的佐剂的描述。
我们使用佐剂给小鼠施用，所述佐剂包含添加至于100至1000 μ I体积的磷酸盐缓冲液-O. OlM磷酸盐，O. IM NaCl, pH 7. 2中稀释的I至100 μ g的片段CWG和CP12的片段H，该施用诱导其产生针对特定片段CWG和CP12的免疫应答的强度和速度上的增加。本发明的另一个实施方案是包括上述免疫原之一或上述药物组合物之一的疫苗的描述。我们使用佐剂给小鼠施用，所述佐剂包含添加至于100至1000 μ I体积的磷酸盐缓液-O. OlM磷酸盐，O. IM NaCl, ρΗ7. 2中稀释的I至100 μ g的片段CWG、BG和CP12的片段H，该疫苗的施用减小了隐孢子虫属(Cryptosporidium)和贾第虫属(Giardia)的实验感染中发现的感染的强度。在另一个优选实施方式中，我们开发了用于制备上述免疫原的方法，所述方法包括将无关片段H多肽在任何位置上添加在相应目标多肽的序列中，将片段H添加在目标多肽的起始位置、终止位置或其它位置。甚至更优先，可用于几种蛋白片段和/或蛋白质例如CWG, CD4、IL5、Pfsp, Ent, PAL、CP12、LEC、BG 或 Toxo0在另一个优选实施方案中，描述了用于产生多克隆抗体(分离的和纯化的)或功能性片段的方法，所述抗体或功能性片段能够识别上述或通过上述方法获得的免疫原，其中用于获得抗体的所述方法包括下列步骤用上述任何免疫原或用上述组合物之一免疫非人哺乳动物受试者；使用针对该目的描述的方法选择能够识别上述或通过免疫原的制备方法获得的免疫原的抗体。例如，使用偶联有免疫原的CNBr-Sepharose的柱子，其中通过亲和层析，分离识别免疫原的抗体。因此，本发明对于产生免疫应答(血清中针对蛋白质或其它抗原的特定抗体水平升高)是有用的并且可特别地用于多克隆特定抗体的产生、免疫疗法和免疫预防、用于疫苗的产生、佐剂、诊断方法和通过特定免疫应答的产生直接获得的其它应用。多肽靶至H片段SEQ ID NO. 2的添加(通过包含所述多肽的重组蛋白的产生或通过该多肽与靶抗原的添加或融合)，诱导了此类分子的免疫原性的显著增强，从而允许增强通过在易于产生抗体的受试者中注射该分子而引发的免疫应答。
背景技术：
通常通过在动物中注射目标免疫原(通常与佐剂组合以增强免疫应答)来产生抗血清。应答可通过抗原的随后施用(利用或不利用佐剂)来增强。待施用以产生期望的应答的免疫原的量视使用的动物的物种和/或亚种、使用的佐剂、施用途径、注射频率和抗原自身的免疫原性而产生极大的变化。获得的抗体的质量和数量取决于免疫原的大小和条件。小的多肽和非蛋白质分子可能需要更大的蛋白质的组合以起始免疫应答。佐剂类型物质的应用的一个领域将是疫苗学(vaccinology)。一般而言,数百种天然和合成化合物被鉴定为具有佐剂活性。此类化合物的毒性似乎是其使用的主要障碍，包括在人水平上。在多克隆抗体的产生中发生的大多数副作用，在严重度和持续时间上，源于佐剂的存在。可将佐剂用于不同目的，包括增强纯化或重组的免疫原性、减少诱导保护性免疫力所需的抗原的量或免疫次数以及提高疫苗在新生儿、老年人或具有免疫受损的系统的个体中的功效；用作抗原的递送系统或抗原通过粘膜的摄入的递送系统。将佐剂掺入任何制剂的益处必须与不利反应的风险平衡。佐剂的寻找中的最大挑战之一是增加能力并且使毒性降至最低。由于大小、电荷和疏水性的作用(所述作用调节蛋白质在佐剂的制剂中的掺入)，因此难以预测什么是特定蛋白质或肽的最有效的佐剂。除此以外，配制或组合中还可能发 生表位的变化。在转运蛋白的情况下，针对该蛋白的免疫力的存在是主要限制。此外，每一种佐剂产生特征性免疫应答。由重组亚基组成的疫苗的日益增加的使用已使得必需使改善处理成为优先事项。


图I-钙结合蛋白FH8和肽片段H的表征。Fh8_FH8多肽的推导的氨基酸序列(SEQID NO I)，Frag H-被称作片段H的多肽的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。图2-用于评估片段H在诱导免疫应答中的作用的亚克隆的示意图。图3-利用包含片段CWG的构建体进行的范例的结果。A-利用考马斯蓝染色的SDS-PAGE Tris-Tricine0 PM-标志物预染的 SDS-PAGE 标准(BioRad)。孔 FI、F2-从柱子Ni-NTA收集的CWG的级分1、2 ;孔F4，F5-从柱子Ni-NTA收集的HCWG的级分1、2。孔F7、F8-从柱子Ni-NTA收集的FCWG的级分1、2。B-利用以CWG (组CWG)、HCWG (组HCWG)、FCWG(组FCWG)和无处理的⑶I (组Neg)接种的⑶I小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表每一个组中使用的3只CDl小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种⑶I小鼠，并且定期收集血清，a)利用包含重组抗原CWG的平板获得的结果，b)利用包含重组抗原HCWG的平板获得的结果；C-利用从最后一次接种CWG (组CWG)、HCffG (组HCWG)、FCffG (组FCWG)和无处理的⑶I (组Neg)后83天的⑶I小鼠收集的血清进行的ELISA的光密度的结果。值代表每一个组中使用的3只CDl小鼠的光密度的平均值。D-利用含有重组抗原FCWG的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。FG-利用Schwartz溶液染色的硝酸纤维素膜抗原FCWG。PM-分子量。将以1/200稀释的来自阴性组(a和d)的血清汇合物、利用CWG接种的组(b和e)和利用接种的组HCWG (c和f)的血清汇合物(来自第5次IP (a、b和c)和第6次IP (d、e和f)后9天进行的收获)与含有抗原FCWG ON的NC的条带于4° C 一起温育。g)和h):利用阴性兔的血清(g)和利用抗原F免疫的兔(h)的血清(以1/100稀释的)进行的免疫印迹。作为缀合物，使用了蛋白G-HRP (以1/1000稀释的)，使用4-氯-萘酚来显示。E-利用小鼠组HCWG的血清进行的兰伯贾第虫的免疫荧光。a)光学显微镜术，20x的放大倍数。b) UV显微镜，20x的放大倍数。箭头指示兰伯贾第虫的孢囊。
图4-利用包含片段CP12的构建体进行的范例的结果。A-利用考马斯蓝染色的SDS-PAGE Tris-Tricine 凝胶。PM-标志物预染的 SDS-PAGE 标准(BioRad)。(a)从 Ni-NTA柱收集的CP12的级分1、2和3。(b)从Ni-NTA柱收集的HCP12的级分1、2。(c)从Ni-NTA柱收集的FCP12的级分I、2。B-利用以CP12 (CP12组)、HCP12 (HCP12组)和无处理的CD I (组NEG)刺激的⑶I小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表每一个组中使用的3只⑶I小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CDl小鼠，并且定期收集血清，a)利用包含重组抗原CP12的平板获得的结果，b)利用包含重组抗原HCP12的平板获得的结果；C-利用含有重组抗原FCP12的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。FC-利用Schwartz溶液染色的包含抗原FCP12的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将以1/1000稀释的来自阴性组(g、h和i)的血清汇合物、利用CP12接种(d、e和f)和利用HCP12 (a、b和c)接种的组的血清(来自第8次IP后的收获)与含有抗原FCP120N的NC的条带于4° C 一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，我们利用4-氯-萘酚进行显示。白色箭头指示利用以抗原F免疫的兔的血清进行的免疫印迹测定的抗原FCP12的定位。D-利用蛋白HCP12免疫的小鼠的血清中的小隐孢子虫的免疫荧光，20X的放大倍数。图5-利用包含片段BG的构建体进行的范例的结果。A-利用考马斯蓝染色的SDS-PAGE Tris-Tricine 凝胶。PM-标志物预染的 SDS-PAGE 标准(BioRad)。孔 F1、F2_ 从·柱子Ni-NTA收集的BG的级分1、2 ;孔F4，F5-从Ni-NTA柱收集的HBG的级分1、2。B-利用HBG (HBG组)和无任何处理的⑶I (组NEG)接种的⑶I小鼠血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CDl小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CDl小鼠，并且定期收集血清。C-利用含有重组抗原BG的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。BG-利用Schwartz溶液染色的包含抗原BG的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/1000的来自阴性组(d、e和f)、利用HBG接种的组(a、b和c)的血清(第7次IP后收获的)与含有抗原BG ON的NC的条带在4° C 一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP,我们利用4-氯-萘酚进行显示。D-利用组HBG的小鼠的血清产生的兰伯贾第虫的免疫荧光。a)常规显微镜，40x的放大倍数。b)UV显微镜术，40x的放大倍数。箭头指示兰伯贾第虫的两个营养体(trophozoite)。图6-利用包含片段Ent的构建体进行的范例的结果。A-利用以⑶IHEnt (组HEnt)和无任何处理的CDl (组NEG)接种的小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CDl小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CDl小鼠，并且我们定期收集血清。B-利用含有重组抗原Fent的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。Fent-利用Schwartz溶液染色的含有抗原FEnt的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/1000的阴性组(a、b和c)和用HEnt接种的组(d、e和f)的血清(从第7次IP后收获的)与含有抗原FEnt ON的NC的条带于4° C 一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，并且我们用4-氯-萘酚进行显示。白色箭头指示通过利用以抗原F免疫的兔的血清进行的FEnt免疫印迹测定的抗原的定位。C-使用以HENT免疫的小鼠的血清，利用溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)的营养体进行的免疫突光,放大倍数为20x。图7-利用包含片段Pfsp的构建体进行的范例的结果。A-利用以HPfsp接种的(组HPfsp)和无任何处理的⑶I接种的(组NEG)⑶I小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CDl小鼠的光密度的平均值。定期接种CDl小鼠，我们按照表2中描述的方案定期进行血清收集。B-利用包含重组抗原FPfsp的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。将以1/200稀释的阴性组(C)、以HPfsp接种的组(d和f)[在第6次IP后收获的(d)和在第7次IP后14天收获的(f)]的血清汇合物与包含抗原FPfsp ON的NC的条带于4° C 一起温育。b)利用稀释至1/100的阴性兔(a)和用抗原F免疫的兔(b)的血清进行的免疫印迹。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，并且我们利用4-氯-萘酚进行显
/Jn ο图8-利用包含片段IL5的构建体进行的范例的结果。A-利用以HIL5接种的(组HIL5)和无任何处理的⑶I接种的(组NEG)⑶I小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表 使用的3只CDl小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CDl小鼠，我们定期进行血清收集。B-利用包含重组抗原FIL5的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。FIL5-利用Schwartz溶液染色的含有抗原FIL5的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/1000的来自阴性组(a、b和c)和用HIL5 (d、e)接种的组的血清(第6次IP后收获的)与包含抗原FIL50N的NC的条带于4° C 一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP,并且我们利用4-氯-萘酚进行显示。白色箭头指示通过利用以抗原F免疫的兔的血清进行的免疫印迹测定的FIL5抗原的定位。图9-利用包含片段Toxo的构建体进行的范例的结果。A-利用以HToxo接种的(组ΗΤοχο)和无任何处理的⑶I接种的(组NEG)⑶I小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CDl小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CDl小鼠，我们定期进行血清收集。B-利用包含重组抗原Toxo的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。Toxo-利用Schwartz溶液染色的含有抗原BG的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/1000的来自阴性组(a、b和c)和用HToxo (d、e和f)接种的组的血清(第4次IP后收获的)与包含Toxo抗原ON的NC的条带于4° C 一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，并且我们利用4-氯-萘酚进行显示。图10-利用包含片段⑶4的构建体进行的范例的结果。A-利用以HCD4接种的(组HCD4)和无任何处理的⑶I接种的(组NEG)⑶I小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表3只CDl小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CDl小鼠，我们定期进行血清收集。B-利用包含重组抗原⑶4的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。⑶4-利用Schwartz溶液染色的含有抗原⑶4的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/500的来自阴性组(a)和用HCD4接种的组(b)的血清汇合物(第7次IP后14天收获的)与包含⑶4抗原ON的NC条带于4° C 一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，并且我们利用4-氯-萘酚进行显示。图11-利用包含片段PAL的构建体进行的范例的结果。A-利用以⑶IHPAL接种的(组HPAL)和无任何处理的⑶I接种的(组NEG)小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CDl小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CDl小鼠，我们定期进行血清收集。B-利用包含重组抗原HPAL的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。HPAL-利用Schwartz溶液染色的含有抗原HPAL的硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/1000的来自阴性组(a、b和c)和用HPAL接种的组(d、e和f)的血清(在第4次IP后收获的)与包含抗原HPAL ON的NC条带于4° C 一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP,并且我们利用4-氯-萘酚进行显示。
图12-利用包含片段LEC的构建体进行的范例的结果。A-利用以HLEC接种的(组HLEC)和无任何处理的⑶I接种的(组NEG)小鼠的血清进行的ELISA的光密度。值代表使用的3只CDl小鼠的光密度的平均值。按照表2中描述的方案，定期接种CDl小鼠，我们定期进行血清收集。B-利用包含重组抗原HLEC的硝酸纤维素膜进行的免疫印迹。HLEC-利用Schwartz溶液染色的含有抗原HLEC硝酸纤维素膜。PM-分子量。将稀释至1/1000的阴性组(a、b和c)和用HLEC接种的组(d、e)的血清(在第6次IP后收获的)与包含抗原HLECON的NC条带于4° C 一起温育。作为缀合物，我们使用以1/1000稀释的蛋白G-HRP，并且我们利用4-氯-萘酚进行显示。本发明的一般描述本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含结构(1)来自由肝片形吸虫的成虫排泄/分泌的钙结合蛋白的氨基酸序列的部分，和无关目标蛋白质或蛋白质片段。
本发明的主题也是用于制备此类融合蛋白的方法，所述融合蛋白允许动物的针对无关蛋白质片段的免疫应答显著增强。将来自蠕虫肝片形吸虫的钙结合蛋白的小片段-以下被称作片段H_(SEQ ID NO2)或相似序列(优选具有至少90至95%的同源性，优选具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的相似性)添加至无关蛋白质片段或蛋白质导致多肽的免疫原性水平的显著升高。本发明的第一方面涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含具有片段H的结构的氨基酸序列、紧随其后的与无关蛋白质片段或蛋白质在结构上相似的氨基酸序列。本发明的另一个方面涉及表达载体，其特征在于包含编码这样的融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的另一个方面涉及用于注射入动物、能够产生免疫应答的抗原的制备。本发明还涉及给动物施用可产生免疫应答的重组抗原的方法。本发明还涉及该融合蛋白用于产生特异于添加的蛋白质或蛋白质片段的多克隆抗体的用途。此类融合蛋白的产生可显著增加添加的片段或蛋白质的免疫原性，从而增强其用于研究和工业目的开发的用途。针对抗原的特异性免疫应答的诱导是个复杂过程，包括许多种类的细胞和机制(通常具有冲突的活性(conflicting activity))。可导致能够诱导更强的免疫应答的抗原的产生的方法的开发，因所述抗原在R&D中以及在工业水平上、与疫苗、诊断剂、免疫疗法等的开发一样重要的领域内的潜在应用，一直都是发展的恒定主题。虽然已知几种物质例如佐剂显著增强产生的针对靶抗原的免疫应答，但它们中有许多具有限制其使用的副作用。在另一方面，允许靶抗原的免疫原性的内源性增加的应用还未开发出来。我们描述了作为主要特征在于添加肽序列(片段H)后使得靶分子的免疫原性增强的发明。我们例如描述了本发明在产生重组蛋白中的应用，其中产生具有该标签的靶抗原。该构建体允许靶抗原的免疫原性显著增强。本发明涉及与存在于由肝片形吸虫的成虫排泄-分泌的钙结合蛋白，具体地被称作FH8或成束蛋白(fasciolinXGenbank号AF213970)中的氨基酸序列融合的抗原。该策略可升高融合至片段H的抗原的免疫原性水平，并且该增强的免疫原性导致对其施用了所述免疫原的个体的免疫应答的诱导的获得。该系统可显著升高目标抗原的免疫原性水平，从而允许对其施用了所述抗原的个体产生更强的免疫应答，包括针对目标抗原的特异性抗体的产生。该方法使得能够在多克隆抗体的产生、接种、免疫疗法或可因特异性免疫应答的产生而导致的其它应用中使用低免疫原性抗原，包括肽。因添加H片段至目标抗原而产生的抗原的免疫学特征使得能够在针对片段H的显著应答不存在的情况下产生针对目标抗原的特异性应答。在注射了无其它添加剂(包括其它佐剂)的免疫原之后发生免疫应答，可将抗原变性或不变性地施用。支持本发明的结果是指使用蛋白FH8的11个氨基酸的氨基末端片段来增强无关蛋白质或蛋白质片段(用作实例)的免疫原性的范例。然而，此类方法可以被潜在地扩展至任何多肽。所述范例基于包含相应于片段H的N末端序列的重组蛋白的产生。该应用模型使本发明的使用成为可能，因为其不再要求肽的组合(通过化学或物理方法)。本申请还增强重组抗原产生系统产生重组免疫原(特别地用于产生多克隆抗体和制备疫苗)的效用。发明详述用于验证本申请的说明书是基于通常用于研究目的的载体pQE(QIAGEN)的使用。将各种构建体亚克隆入大肠杆菌(Escherichia coli) pQE (Qiagen)的表达载体,这导致在 6个组氨酸的N末端序列后表达的重组蛋白的产生,在大肠杆菌M15 (pREP4) (Qiagen)中进行的该产生，允许基于由制造商提供的方案(Castro, 2001, Silva和al.，2004)，利用NINTA琼脂糖柱(Qiagen)通过亲和层析分离。使用该系统制备所有产物，我们在变性条件下进行重组抗原的分离以使得能够更有效地进行分离。为了产生和分离目标蛋白质，可以使用任何表达系统和重组蛋白的分离，只要其不减少片段H对免疫系统的暴露。用于获得构建体的系统应当被视为在研究中用于获得实验范例所需的大量蛋白质的媒介物。可将相同的方法用于蛋白质产生的其它系统，特别地真菌或真核生物系统。结果是指使用来自FH8 (SEQ ID NO I和2)的片段H的实例。本发明的原理之一是利用分子生物学的方法将相应于FH8的N末端片段的序列的片段H(具体而言是SEQ ID NO 2的多肽)添加至期望用作免疫原的多肽序列之前。该构建体可通过利用分子生物学技术添加该序列来实现，包括使用适当的限制性酶将这些片段添加在适当的限制性位点，用于描述的范例中的方法，或通过其它方法例如将具有目标序列的DNA片段(接头)添加至PCR产物或其它方法。片段H的减小的幅度使得能够使用多种策略进行与目标多肽的融合。用于构建的另一种可能是使用相应于待制备的多肽FH8的序列的多肽制备融合蛋白。可使用分子生物学的技术，包括使用限制性酶、范例的方法中使用的方法来实现插入下列FH8的过程。本发明已被用于各种具有不同免疫原性特征的片段和蛋白质，包括被描述为非免疫原性或具有低免疫原性的蛋白质或片段，如CWG、CD4，或由于其特征，包括其分子量的原因而具有较低的免疫原性的片段，例如IL5、Pfsp和Ent，被描述为免疫原性极高的蛋白质如PAL，以及具有中等免疫原性的蛋白质和蛋白片段，例如CP12和LEC，以及具有未知特征的其它靶例如BG和Toxo。我们还在整个实验中应用几种不同的方案(方案的差异在于给小鼠施用的蛋白质浓度以及施用之间的时间间隔不同)。这些不同的方案被用于证明本发明的通用性。我们还评估了在变性条件下施用抗原的可能性，如在LEC的情况下；或在非变性条件下的可能性，如在其余片段和蛋白质的情况下。对于所有进行的范例，我们使用小鼠作为实验模型并且通过腹膜内途径来进行抗原的施用。还使用皮下施用在兔中估计针对靶标0^、几54社、!'( 0、86和0 12的抗体的产量，结果相似(未显示)。产生抗原，使用与NINTA琼脂糖树脂(QIAGEN)相同的条件在变性条件下分离抗原。在针对PBS透析并通过0.22 y滤器过滤灭菌后制备用于免疫的抗原。为了证明由所述片段在免疫原性水平上产生的特异性效应，我们使用两种靶，即-CWG:兰伯贾第虫孢囊的CWP(孢囊壁蛋白)蛋白。在工作完成时，我们使用427bp的CWP2的一部分序列，原始序列具有1089bp并且待扩增的区域位于527bp至931bp (GenBank登录号XM_001710190)。利用PCR扩增片段，将其亚克隆入载体pQE (CffP)，还可使用包含片段H、紧随其后的CWP构建体(HCWP)和包含与CWP的序列融合的FH8的序列的构建体(Fh8CWP)来制备所述构建体。以表2中描 述的间隔施用具有相同量的蛋白质(50 u g)的接种物。结果显示在5次IP后仅在组HCWP中可见显著水平的抗-CWP产生，其在实验的后续阶段保持存在，包括最后一次施用蛋白质后83天。使用抗原Fh8CWG广生的印迹确认了 ELISA的结果并且证明产生的抗体的特异性。利用寄生虫进行的免疫荧光测定显示产生的抗体识别存在于该结构的壁中的天然蛋白质。-CP12 :CP12是小隐孢子虫的表面蛋白质。用于本工作的片段CP12 (GenBankNo. XM_625821)具有213bp并且相应于不具有其跨膜结构域的蛋白质CP12的核苷酸序列。通过PCR扩增片段，将其亚克隆入载体pQE (CP12)，我们还制备包含片段H、紧随其后的CP12的构建体(HCP12)。产生抗原，使用与NINTA琼脂糖树脂(QIAGEN)相同的条件在变性条件下分离抗原。以表2中显示的周期施用具有相同量的蛋白质(20iig)的接种物。结果显示CP12与HCP12组之间的抗体的产生的显著增加(在强度和速度上)，这些水平在整个实验过程中保持明显增加。利用Fh8CP12产生的印迹确认了 ELISA的结果并且证明了产生的抗体的特异性。利用寄生虫进行的免疫荧光测定显示产生的抗体识别存在于该结构的壁中的天然蛋白质。对于其余靶，已制备了用含有H标签的构建体免疫的组以显示免疫应答存在。对于下面描述的实例，除了由其它机构提供的片段LEC夕卜，通过PCR扩增片段，并且将所述片段亚克隆入PQE载体含有片段H、紧随其后的靶片段。用于获得此类片段的条件描述于表I中。-BG :我们克隆了兰伯贾第虫的P -Giardina的基因的完整序列，其具有850bp的大小，具有缺失^91bp至787bp) (GenBank登录号X85985)，编码33kDa的蛋白质。我们以表2中显示的周期施用具有相同量的蛋白质(20iig)的接种物。结果显示在第3次IP后显著的增加，在第4次IP后保持所述水平。利用蛋白质BG产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。甚至在最后一次接种后47天亦可检测到抗体效价的维持。利用寄生虫进行的免疫荧光测试显示产生的抗体识别存在于该结构的壁中的天然蛋白质。-Ent :使用的扩增子具有163bp的大小，编码5kDa的蛋白质，并且为来自溶组织内阿米巴孢囊壁特异性糖蛋白Jacob的456bp的大小的基因(GenBank登录号XM_645825)的291bp至453bp之间的区域。以表2中显示的周期施用具有相同量的蛋白质(50iig)的接种物。结果显示在第4次IP后显著的增加。利用蛋白质FhSEnt产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。我们能够确认甚至在最后一次接种后90天抗体效价的维持。利用寄生虫进行的免疫荧光测试显示产生的抗体识别存在于该结构的壁中的天然蛋白质。-Pfsp :在本研究中，我们使用falcipaina-1的小部分序列(165bp),将其插入3D7恶性疟原虫营养体半胱氨酸蛋白酶前体的序列(1423bp-1587bp) (GenBank登录号XM_001348691. I)。以表2中显示的周期施用具有50 y g的蛋白质的接种物。结果显示在第4次IP后显著的增加，在第7次IP后达到最大效价。我们可在最后一次接种后82天确认针对片段Pfsp的特异性抗体的存在。利用蛋白质Fh8Pfsp产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。-IL5 :人白细胞介素5是造血生长因子，其具有编码134个氨基酸的816bp的核苷酸序列(GenBank No. BC069137. I).。用于评估IL5的片段是IL5的非常小的部分，由相应于IL5的5’末端的编码48个氨基酸的外显子的144bp组成。以表2中显示的周期施用具有相同量的蛋白质(20iig)的接种物。结果显示在第4次IP后显著的增加。利用蛋白质IL5产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。-Toxo :Toxo蛋白为鼠弓形虫的卵囊壁的蛋白质，具有编码499个氨基酸的1846bp (GenBank No. EU851867. I)。Toxo 片段相应于位于 2875 与 3238bp 之间的外显子 2。以表2中显示的周期施用具有相同量的蛋白质(20 yg)的接种物。结果显示在第4次IP后显著的增加。利用蛋白质Toxo产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。-⑶4:⑶4蛋白是鲈鱼的淋巴细胞的壁的受体(GenBank No. AMB849812. I)。⑶4片段相应于该受体的193与714bp之间的两个结构域。以表2中显示的周期施用含有30ii g的蛋白质的接种物。结果显示在第4次IP后显著的增加。利用CD4蛋白产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。-PAL :嗜肺军团病杆菌(Legionella pneumophila)的PAL蛋白(肽聚糖结合的脂蛋白前体)是来自该细菌的壁的蛋白质(GenBank No. YP001250824)。PAL相应于完整蛋白质。我们以表2中显示的周期施用具有30 yg蛋白质的接种物。结果显示在第2次IP后显著的增加。利用蛋白PAL产生的印迹确认了产生的抗体的特异性。-LEC :来自面包果(Artocarpus incisa)的凝集素的DNA片段(具有846bp)包含酶Sac I和KpnI的切割位点。由于该抗原当以非变性形式存在时具有潜在的使红细胞凝聚的活性，因此我们在变性条件下制备蛋白质接种物。为了除去最大量的尿素(终浓度低于IOmM)，我们针对PBS缓冲液透析50mM尿素，在制备样品时，我们将抗原于PBS中稀释，通过0.22ii过滤。我们以表2中显示的周期施用具有12. 5iig蛋白质的接种物。结果显示在第4次IP后显著的增加。利用蛋白质HLEC产生的印迹确认了产生抗体的特异性。在上述实例中，使用相应的抗原，通过ELISA进行反应的评估。在印迹法中，我们评估对抗原的反应(其产生更高效)。为了利用含有标签FH8的重组蛋白进行印迹，由于存在形成聚合物的可能性，因此我们利用特异于FH8的多克隆抗体定位重组蛋白。在大多数情况下，我们在印迹法中包括硝酸纤维素条，其含有具有片段H (通常地重组FH8)的抗原，以用于评估针对该片段的反应，并且除了在用FhSCWP接种的组中获得的应答外，我们未检测到显著水平的抗H抗体的存在。在上述实例中，除了其接种物包含PBS中的IOmM尿素的HLEC外，接种总是仅利用在PBS中稀释的抗原进行的。抗原及其片段FH8H的表征
抗原FH8先前已被分离，并且通过发明人的列表中的性质元件来表征(Castro, 2001, Silva 等人,2004, Eguino 等人,1999)(图 I)。通过筛选肝片形吸虫cDNA库(图I)进行FhS的分离。所述克隆编码具有8kDa的理论分子量的69个氨基酸的多肽，其被命名为FH8或fasciolina(Genbank编号AF213970)。在具有载体pQE的大肠杆菌表达系统中以高蛋白质水平(>5mg/升的培养物)产生重组蛋白FH8。利用FH8突变体的研究产生以下假说该抗原的N末端序列在蛋白质的稳定性中具有重要作用。该假说的证明产生了专利No. 20091000005031中描述的发明。另一个特征是其高免疫原性，该特征扩展至另一个钙结合蛋白家族(存在于由肝片形吸虫的成虫排泄/分泌的提取物中)，FH22家族(EMBL编号AJ003821，EMBL编号AJ003822)。两种抗原经证明能够以高特异性抗体效价诱导免疫应答(Castro, 2001, Silva等人，2004)。这些结果也提出了其用作目的在于产生抗体的重组蛋白的产生的标签的用途。片段H是抗原的稳定性所必需的以及该片段至其它无关蛋白质或片段的添加使得能够增加蛋白质的产 量(假定归因于融合蛋白的增加的稳定性)的证明，提出了以下假说片段H的添加，因为相同的原因，可增加该抗原的免疫原性。该推断似乎来自这样的事实，即蛋白质的稳定性通常与其免疫原性相关。该假说通过上述范例来确认。使用的株系在本研究中，我们使用菌株大肠杆菌XLlBlue (Stratagene)和大肠杆菌M15[pREP4] (QIAGEN)分别克隆质粒 pGEM_T E asy (Promega)和质粒 pQE30 (QIAGEN)。为了进行蛋白质表达，我们使用大肠杆菌菌株M15[pREP4]。按照由制造商提供的说明书，利用来自Promega的试剂盒Wizard Plus SVMinipreps DNA纯化系统从在37°C生长过夜的细菌培养物分离和纯化质粒DNA。构建体用于评估11个氨基酸的结构元件(片段H)作为诱导重组蛋白的免疫原性的因子的构件的概述示于图2中。通过聚合酶链式反应(PCR)获得图2中显示的构建体，将其克隆入pGEM，随后克隆入PQE，如表I中显示的，如下文中指明的。通过聚合酶链式反应(PCR)获得表示用于评估免疫应答的其它抗原的构建体，将其克隆入pGEM，随后克隆入pQE，如表I中显示的。通过下文中描述的亚克隆技术获得其余构件。PCR用于PCR的引物描述于表I中。为了获得包含限制酶切位点BamHI和SacI的片段H和Fh8RSac，我们使用包含编码多肽FH8的基因的pQE30载体(Castro, 2001, Silva等人，2004)作为PCR反应的模板。PCR反应始于在95°C下进行I分钟变性的步骤，然后进行30个扩增循环在94°C变性45秒，在50°C退火30秒以及在72°C聚合45秒。我们进行在72°C进一步聚合11分钟的步骤。通过 PCR 扩增片段(CWG、CP12、BG、Ent、PFSP、IL5、Toxo、CD4、PAL 和 LEC)，所述片段被选择用以评估通过将无关多肽与H片段融合而制备的重组蛋白产生免疫应答的能力，如通过测量针对所述蛋白质或片段的特异性抗体的出现所显示的。该PCR反应还将限制性酶SacI和KpnI添加至它们的片段中。表I.用于获得用于评估片段H的活性的构建体、DNA样品、引物和PCR程 序的PCR反应的列表I
O)
I_I
目的用作權板的DNA样品使用的引物
HBamSac : S'-C ATCCATGCC
片段H的荻质含编码_的_灰GTGTTCAAGAGGTTGAA得的序列的载体_30ACTCCTTGAGCTCCATG^
FhSRev: 5，-GTTC AC ATA AT A CAATGGT A CCCT A-3，
HFwd: S1-G GATCCATGCCT
^MiSKSac 的质粗 DNA-包含編码 Fh8 的 DNA TGTTCA A_y
一，，“，，&&Fh8RSac: St-G TTCACATAAT
获得的序列的载体pQE30
ACAATCTGGAGCTCTGA ___ACAAAAT C-3,_
(\V(,i wd 5'-.\ I r I ( I I ( \
片段 CWG 的 ^,CCCTTACATGAT G-3,
兰伯贾第虫的基因组DNA 获得CWGRev: 5，-A CAGAGCTGGT
(.(' I..I ( i \~y
CP12Fwd: S、C ATACTGGTAT'
片段 CP12 的，GCTCTGA AGGAGTAC-y小隐德子虫_基國组DNA获得CP12Rev: Sf-CATTAAAAGGT
__(.. T T T C A T T A T C A A C-3'
权利要求
1.一种免疫原，其由如下部分组成 a.由肝片形吸虫的成虫排泄/分泌的钙结合蛋白的氨基酸序列的部分，其与被称作片段H的SEQ ID NO 2具有相同的序列或具有至少90%的结构相似； b.无关的目标蛋白质或蛋白质片段。
2.权利要求I的免疫原，其特征在于目标蛋白质或蛋白质片段是病原性蛋白质，例如病毒蛋白质、细菌蛋白质或来自原生动物的蛋白质。
3.权利要求I的免疫原，其特征在于目标蛋白质或蛋白质片段是016、^4、11^5、？& 、Ent, PAL、CP12、LEC、BG 或 Toxo0
4.前述权利要求的任一项的免疫原，其特征在于用作药剂。
5.—种组合物,其特征在于包含权利要求1-4中描述的任何免疫原。
6.权利要求5的组合物，其特征在于以治疗有效量包含免疫原以及还包含药理学上适当的媒介物。
7.权利要求5的组合物，其特征在于由100%的所述免疫原之一组成。
8.权利要求5的组合物，其特征在于由如下组成稀释于磷酸盐缓冲液-O.OlM磷酸盐，O. IM NaCl, pH 7. 2中的浓度为100至1000 μ I的体积中I至100 μ g的权利要求1-4中描述的免疫原。
9.一种佐剂，其特征在于包含权利要求1-4的任一项中描述的免疫原或权利要求5-8中描述的药物组合物的任一种。
10.一种疫苗，其特征在于包含权利要求1-3的任一项中描述的免疫原或权利要求5-8中描述的任何药物组合物。
11.一种用于制备免疫原的方法，其特征在于使用权利要求1-4中描述的免疫原，包括将片段H在相应于待用作免疫原的多肽的序列的任何适当的位置处添加至无关的多肽。
12.权利要求11的方法，特征在于使用多个片段和蛋白质例如CWG、⑶4、IL5、Pfsp,Ent, PAL、CP12、LEC、BG 或 Toxo0
13.一种用于产生分离的和纯化的多克隆抗体或功能性片段的方法，所述抗体或功能片段的特征在于能够识别权利要求1-4所述的免疫原或通过权利要求11-12中所述的方法获得的免疫原，其中该方法包括下列步骤 用权利要求1-4中描述的任何免疫原或利用权利要求5-8中描述的任何组合物免疫非人哺乳动物受试者； 使用为此目的描述的方法选择能够识别根据权利要求1-4描述的免疫原或根据权利要求11-12获得的免疫原的抗体。
14.权利要求1-4中描述的免疫原和权利要求5-8中描述的组合物的用途，其特征在于，用于产生多克隆抗体特异性免疫疗法、免疫预防、产生疫苗、佐剂、诊断剂和通过特异性免疫应答的产生而直接获得的其它应用。
全文摘要
本发明涉及融合蛋白、包含免疫原的药物组合物、疫苗和佐剂，所述融合蛋白包含相应于肝片形吸虫的成虫排泄-分泌的钙结合蛋白的片段的片段H的氨基酸序列、紧接其后的相应于无关蛋白质或蛋白质片段的氨基酸序列；涉及用于其制备的方法、用于产生抗体的另一种方法及其使用。本发明涉及通过添加肽序列而制备免疫原。因此，本发明对于产生免疫应答是有用的，其中血清中针对蛋白或其它抗原的特异性抗体效价升高，并且可特别地用于特异性多克隆抗体的产生、免疫疗法和免疫预防。通过产生包含多肽的重组蛋白或者通过添加或融合该多肽至靶抗原，将多肽添加至靶抗原，诱导了这些分子的免疫原性的显著增加，增强了通过在能产生抗体的物种中注射该分子所引发的免疫应答。
文档编号A61K39/39GK102811732SQ200980163333
公开日2012年12月5日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者M·A·佩雷拉达康瑟考, S·J·马奎斯达考斯塔, A·M·奥利维拉卡斯特罗, A·A·达西尔瓦阿尔梅达 申请人:科英布拉农业大学, Hitag-生物技术有限公司