携带融合蛋白基因的重组腺病毒及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：携带融合蛋白基因的重组腺病毒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属生物
技术领域：
，涉及一种人癌胚抗原576-669(CEA576_669)和热休克蛋白70样分子1(hsp70Ll)融合基因的重组腺病毒及其制备方法和应用。
背景技术：
：热休克蛋白(Heatshockprotein,HSP)是一类在生物进化中高度保守、广泛存在于原核及真核生物中的一类蛋白质，在细胞受到应激后表达增加。HSP在细胞内作为伴侣分子，参与抗原的加工和形成MHC-抗原肽复合物。近年来，HSP家族明显的佐剂样作用引起了国内外学术界的关注。研究表明，HSP在细胞受到应激后，可以释放到细胞外，诱导抗原提呈细胞和T细胞成熟活化等重要的生理过程，因此与机体的抗肿瘤免疫、抗感染免疫、自身免疫性疾病等生理及病理机制密切相关，是一类重要的免疫分子(SrivastavaPK，AnnuRevImmunol.2002；20395425)。热休克蛋白家族按照分子量可以分为四类Hsp90家族、Hsp70家族、HSP60家族和小分子Hsp家族，其中Hsp70家族是HSP中最保守和最主要的一类。许多研究表明，肿瘤细胞或者病毒感染细胞来源的Hsp70-肽复合物、Hsp70分子联合多肽抗原、或者与多肽抗原交联的复合物，能够明显诱导产生抗原特异性的CD8+的CTL，单独使用Hsp70或者单独应用多肽抗原则无此效应，因此HSP在抗原递呈过程中的佐剂样作用及小分子肽的免疫原性是HSP介导的免疫治疗所不可缺少的两个重要部分(TodrykSM等，Immunology.2003；1101-9；ManjiliMH等，ExpertOpinBiolTher.2004；4363-373；BlachereNE等，JImmunotherEmphasisTumorImmunol.1993；14352-356；LiZBehringInstMitt.1994；94:37_47；MoroiY等，ProcNatlAcadSciUSA.2000；97348590)。HSP诱导的特异性CTL反应是由于专职抗原递呈细胞(APC)上存在HSP的受体，可以使APC特异性地通过HSP受体介导抗原肽的内吞(Arnold-SchildD等，JImmunol.1999；1623757-3760)；HSP结合的抗原在胞内是通过TAP依赖及TAP非依赖途径，被递呈到MHC-I类分子上，并诱导随后的CTL反应，这种受体被证明存在于DC、巨噬细胞及B细胞等APC上，而不存在于T细胞上(CastellinoF,JExpMed.2000；1911957-1964)；因此可以认为，HSP通过HSP受体与APC相互作用是HSP作为佐剂的一个重要机理。研究表明，这种受体介导的抗原递呈方式的效率比吞噬高10000倍。HSP70分子在胞外可以行使类似细胞因子样作用。HSP70可与单核细胞产生高亲和力的结合，诱导其产生IL-6、IL-I等活性细胞因子，并可以诱导DC成熟，上调其MHC-II和⑶86分子表达，分泌IL-12和TNF-α，从而增强DC的抗原递呈能力(SvenssonPA等；Atherosclerosis.2006；185:32_38)。因此，采用HSP作为免疫佐剂协同肿瘤抗原诱导DC，可以靶向性介导抗原的递呈，增强抗原的递呈效率，从而诱导更强的CTL反应。在明确了HSP的独特佐剂效应的基础上，利用HSP的佐剂作用诱导抗肿瘤和抗感染免疫因此成为热点，基于HSP的新一代疫苗纷纷进入临床试验研究。基于HSP的疫苗构成概括起来主要有以下几种方式1、从肿瘤细胞或病毒感染细胞纯化HSP-肽复合物，用纯化的HSP-肽复合物体内免疫激发抗肿瘤或抗感染免疫。HSP肽复合物用于肿瘤治疗具有明显的优势，因为提取的HSP肽复合物可以直接用于免疫治疗，不需要鉴定其中所包含的肿瘤特异性抗原表位。不足的是，此方案多采用个体化治疗方案，即免疫所用的HSP-肽复合物需要来源于自体肿瘤细胞。2、通过原核和真核表达得到HSP，通过体外交联使合成的表位肽结合于HSP肽结合袋，再用交联的HSP-肽复合物诱导抗肿瘤或抗感染免疫。3、HSP抗原的融合蛋白免疫。4、HSP抗原基因融合表达的DNA疫苗或腺病毒疫苗。自体肿瘤来源的gp96_肽复合物(HSPPC-96)已进入以肾细胞癌为代表的多种恶性肿瘤的临床试验，目前已证实病人对多个不同应用剂量均有良好的耐受性(CaudillMM和LiZ.ExpertOpinBiolTher.2001；1(3):539_47·)。Cohen等用HSPPC-96治疗36例IV期肾细胞癌的临床I期和III-IV期黑色素瘤的II期临床结果显示，治疗组生存质量显著提高(CohenL等；MelanomaRes.200212(5):505_11·)。Belli用HSPPC-96治疗转移性黑色素瘤，未见明显毒副作用，28例病人中，2例CR(compIeteresponse)，3例SD(stabledisease)，CR持续时间分别超过了559和703天；取经治病人的外周血单个核细胞作ELISP0T检测，23例中11例黑色素瘤特异性T细胞显著增加(BelliF等，JClinOncol.2002；20(20):4169_80.)。Stressgen公司用HSP65和HPVE7抗原的融合蛋白构成的疫苗HspE7(SGN-00101)对HPV感染和相关肿瘤的治疗已被证实安全有效，现正进行临床III期试验。可见，基于HSP的新一代疫苗具有非常好的临床应用前景(MaciagPC,PatersonY.CurrOpinMolTher.2005；7(3):256_263；HuntS.CurrOpinMolTher.2001；3(4)413-417.)。中国人民解放军第二军医大学免疫学教研室通过对重要的抗原递呈细胞——树突状细胞cDNA文库大规模测序，发现了一种人HSP70家族的新分子，将之命名HSP70L1，并克隆了其全长cDNA(GenBank登录号为AF143723)，其表达产物已申请国家发明专利(申请号99124271.8)。由于HSP70L1在氨基酸序列上与小鼠HSP70具有90%以上的序列一致性和相似性，序列中含有经典的HSP70家族的序列标签，已有的实验结果已经证实DC-HSP可以通过热诱导、PMA/TNFa刺激及细菌等诱导表达，与经典热休克蛋白的特性相似。生物学功能实验提示该蛋白具有一定的免疫佐剂样作用，可以诱导树突状细胞分泌细胞因子，通过FITC标记及已知HSP家族成员的作用，初步证实DC表面存在DC-HSP结合位点，具有与经典HSP70家族非常相似的特点。研究表明，HSP70L1对于模拟肿瘤抗原具有良好的佐剂样作用(WanT等，Blood，2004;103:1747_1754)；HSP70L1与特异性肿瘤抗原CEA576_669的融合原核蛋白也能诱导产生明显的抗肿瘤免疫反应(中国发明专利申请号200410053313.X;WuY等，CancerRes,2005；65:4947_4954)。本领域中仍然迫切需要开发出可高效介导基因转移及表达、并可用作有效抗肿瘤的基因转移载体及其产品。
发明内容本发明的目的之一正是提供一种通过同源重组获得的重组腺病毒，使用该重组腺病毒可实现对Hsp70Ll与人癌胚抗原融合蛋白基因的有效携带、转移和表达。本发明的另一目的是提供一种由该重组腺病毒转染的人树突状细胞，其可用于动物的肿瘤治疗。本发明的又一目的是提供本发明的重组腺病毒或其致敏的人树突状细胞在癌症治疗中的用途。在本发明的第一方面中，提供了一种通过同源重组获得的重组腺病毒，其携带热休克蛋白与癌胚抗原的融合蛋白的编码序列，该腺病毒的基因组缺失El区和E3区，并且在El和/或E3区位置插入了所述融合蛋白编码序列的表达盒，该表达盒依次包括启动子序列、所述融合蛋白的编码序列以及加尾信号序列，其中所述热休克蛋白选自Hsp70或Hsp70Ll。在一个优选例中，所述热休克蛋白为Hsp70Ll。在本发明的一个实施方式中，所述癌胚抗原选自人癌胚抗原的全长序列或含人癌胚抗原的第576-669位的片段。在一个优选例中，所述癌胚抗原为人癌胚抗原的第576-669位的片段。在本发明的另一个实施方式中，所述融合蛋白的编码序列从5'至3'依次具有癌胚抗原编码序列、任选的连接肽编码序列和热休克蛋白编码序列。在一个优选例中，所述融合蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，或由SEQIDNO1所示的核苷酸序列编码。在另一个优选例中，所述连接肽的长度为0-10个氨基酸，优选1-5个氨基酸，更优选2-4个氨基酸，优选所述连接肽的编码序列为SalI酶切位点。在本发明的另一个实施方式中，所述重组腺病毒是通过选自下组的同源重组法获得的细胞内同源重组、细菌内同源重组、C0S/TPC共转染同源重组或位置特异性重组，优选细胞内病毒DNA同源重组或细菌内质粒DNA同源重组。在本发明的另一个实施方式中，所述腺病毒为Ad5型腺病毒。在一个优选例中，所述腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP。在本发明的另一个实施方式中，所述重组腺病毒是基于选自下组的腺病毒表达载体构建的pAdEasy-l、pShuttle-CMV或pShuttle-IRES。在一个优选例中，所述融合蛋白编码序列的表达盒中所含的启动子序列是巨细胞病毒启动子。在另一个优选例中，所述加尾信号序列为SV40PolyA。在本发明的第二方面中，提供了一种用本发明的重组腺病毒致敏的树突状细胞。在本发明的第三方面中，提供了一种药物组合物，它包括(a)有效量的本发明所述的重组腺病毒、本发明所述的树突状细胞或用本发明的树突状细胞诱导的T细胞，以及(b)药学或免疫学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。在本发明的第四方面中，提供了一种制备重组腺病毒的方法，该重组腺病毒携带热休克蛋白与癌胚抗原的融合蛋白的编码序列，该方法包括如下步骤(a)提供基因组中缺失El区和E3区的复制缺陷型腺病毒；(b)提供携带热休克蛋白与癌胚抗原的融合蛋白编码序列表达盒的载体；(c)使步骤(a)的腺病毒与步骤(b)的载体进行同源重组，以获得重组腺病毒。在一个优选例中，所述方法还包括如下步骤(d)用步骤(C)中所得的重组腺病毒转染宿主细胞，和(e)从被转染的宿主细胞中获得重组腺病毒。在另一个优选例中，所述宿主细胞表达ElA基因，优选所述宿主细胞为HEK293人胚胎肾细胞株。在另一个优选例中，所述重组是通过细菌内同源重组的方法进行的。在另一个优选例中，所述复制缺陷型腺病毒选自pAdEaSy-l、pShuttle-CMV或pShuttle-IRES。在另一个优选例中，所述转染所采用的方法是磷酸钙DNA共沉淀转染法或脂质体转染法，优选脂质体转染法。在另一个优选例中，步骤(d)是通过裂解细胞、不连续CsCL梯度离心、连续CsCl梯度离心和透析的四步法纯化获得的。在本发明的第五方面中，提供了一种制备致敏的树突状细胞的方法，所述方法包括用本发明的重组腺病毒或用本发明上述方法制备的重组腺病毒转染树突状细胞。在一个优选例中，所述树突状细胞为人单核细胞来源树突状细胞。在本发明的第六方面中，提供了本发明1所述的重组腺病毒、本发明所述的树突状细胞或用本发明的树突状细胞诱导的T细胞在制备用于预防或治疗CEA阳性肿瘤的药物组合物中的用途。在一个优选例中，所述药物组合物是疫苗。在另一个优选例中，所述CEA阳性肿瘤选自直结肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、乳腺癌或卵巢癌。在本发明的另一方面中还提供了一种CEA阳性肿瘤特异性T细胞的诱导方法，包括以下步骤采用本发明所述的致敏的树突状细胞体外刺激人外周血淋巴细胞。在另一优选例中，该刺激步骤包括(i)收集致敏的树突状细胞，并放射性灭活；(ii)将致敏后且灭活的树突状细胞按树突状细胞T细胞为11-1000、优选120的比例共同孵育，在完全培养基中添加10-200U/ml的IL-2，培养7士2天；重复步骤(i)和(ii)3-10次，收集增殖的T细胞，即为CEA阳性肿瘤特异性T细胞。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1:本发明所制备AdCEA576_669hsp70Ll病毒液的PCR鉴定结果。图2本发明所制备AdCEA576_669hsp70Ll转染人MoDC的RT-PCR和实时PCR鉴定结果。图3本发明所制备重组腺病毒转染人单核细胞来源树突状细胞(MoDC)，轻度促进MoDC的成熟活化。A经AdCEA576_669hsp70Ll转染后DC表达共刺激分子——CD40、CD54、CD80、CD86、CD83或HLA-DR的水平；B经过AdCEA576_669hsp70Ll转染后，DC刺激同种T细胞增殖的水平轻度上调。图4本发明所制备重组腺病毒转染人单核细胞来源树突状细胞(MoDC)，诱导CEA抗原特异性CTL产生。A:AdCEA576_669hsp70Ll基因修饰的人MoDC能够明显诱导HLA-A2.1限制性CAP-I抗原特异性⑶8+T细胞的生成；B:AdCEA576_669hsp70Ll基因修饰的人MoDC组诱导的⑶8+T细胞在CEA576.抗原刺激后，出现IFN-γ斑点的数量和斑点大小明显增加；CAdCEA576_669hsp70Ll基因修饰的人MoDC组诱导的CD8+T细胞杀伤CEA+的LS174T和SW480肿瘤细胞的能力明显增加。图5重组AdCEA576_669hsp70Ll体内免疫实验动物诱导CEA抗原特异性CTL的产生。A:AdCEA576_669hsp70Ll免疫组和AdCEA576_669hsp70Ll_DC免疫组诱导的CD8+CAP-1-MHC四聚体+T细胞比例明显增加；B:AdCEA576_669hsp70Ll免疫组和AdCEA576_669hsp70Ll-DC免疫组诱导的⑶8+T细胞在CEA576.抗原刺激后，出现IFN-γ斑点的数量和斑点大小明显增加；CAdCEA576_669hsp70Ll免疫组和AdCEA576_669hsp70Ll_DC免疫组诱导的CD8+T细胞杀伤CEA+的LS174T和SW480肿瘤细胞的能力明显增加。图6重组AdCEA576_669hsp70Ll治疗CEA阳性肿瘤疾病。A:AdCEA576_669hsp70Ll免疫小鼠来源细胞治疗组和AdCEA576_669hsp70Ll-DC免疫小鼠来源细胞治疗组的动物肿瘤生长受到明显抑制；B:AdCEA576_669hsp70Ll免疫小鼠来源细胞治疗组和AdCEA576_669hsp70Ll_DC免疫小鼠来源细胞治疗组的动物生存期明显延长。图7用pAdeno-x体系构建重组腺病毒的XhoI的限制性酶切分析(图7A)和Xbal/Kpnl双限制性酶切(图7B)结果。具体实施方式本发明人经过长期而深入的研究，通过同源重组方法构建了携带HSP70L1与特异性肿瘤抗原CEA576_669融合基因的腺病毒载体(AdCEA576_669hsp70Ll)，并利用此重组腺病毒载体转染人树突状细胞(AdCEA576_669hsp70Ll-DC)。研究证明体内外应用AdCEA576_669hsp70Ll或AdCEA576_669hsp70Ll修饰的树突状细胞(AdCEA576_669hsp70Ll-DC)可以有效诱导针对CEA576.抗原特异性的杀伤性T细胞生成，杀伤CEA+的肿瘤细胞；并且过继回输AdCEA576_669hsp70Ll或AdCEA576_669hsp70Ll-DC免疫动物的淋巴细胞可以延长CEA+肿瘤荷瘤动物的生存期和抑制肿瘤细胞生长。因此，AdCEA576_669hsp70L1或AdCEA576_669hsp70L1-DC可以作为治疗性疫苗，应用于CEA+肿瘤的治疗。在此基础上，本发明人完成了本发明。在本发明中，术语“融合蛋白表达盒”指含有以下元件的表达盒热休克蛋白与癌胚抗原的融合蛋白的编码序列，以及表达所需的组件包括启动子和聚腺苷酸化信号序列。此外，该表达盒还可以任选含有其它序列，其中包括但并不限于增强子、分泌信号肽序列寸。可以适用于本发明表达盒中的启动子可以是任何一种常见的启动子，它可以是组成型启动子或诱导型启动子。较佳地，该启动子是组成型的强启动子，如巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子等其它适用于真核表达的启动子。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。热休克蛋白与癌胚抗原融合蛋白如本文所用，术语“热休克蛋白”包括热休克蛋白和热休克蛋白样蛋白，代表性的例子包括(但并不限于):Hsp70、Hsp70Ll(Hsp70-likeprotein1)及其它的热休克蛋白，优选为Hsp70、Hsp70Ll。这些热休克蛋白的序列可从Genbank数据库上获得。如本文所用，术语“癌胚抗原和热休克蛋白的融合蛋白”、“CEA-Hsp融合蛋白”等可互换使用，都指由癌胚抗原元件的氨基酸序列和热休克蛋白(如Hsp70或Hsp70Ll)的氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在两者之间可以有或者没有连接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或没有起始的甲硫氨酸或信号肽。如本文所用，术语融合蛋白中“癌胚抗原元件”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长癌胚抗原或其免疫原性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然癌胚抗原基本上相同的生物活性。优选的癌胚抗原元件是人癌胚抗原或其免疫原性片段，更佳地是全长的人癌胚抗原或其免疫原性片段(如含576-669位的CEA氨基酸序列的片段)。癌胚抗原和热休克蛋白的序列可以源自人，也可以源自非人的动物。然而，优选的是人的天然序列。应理解本发明的癌胚抗原和热休克蛋白的氨基酸序列或核苷酸序列还包括其同源序列(例如同源性高于90%、95%、98%或99%的序列)或由所述序列经保守取代、删除或添加获得的具有相同或相似功能的序列。如本文所用，术语“连接肽”或“氨基酸连接臂”可互换使用，指位于癌胚抗原氨基酸序列和热休克蛋白氨基酸序列之间的、起连接作用的短肽。连接肽可存在或不存在，其长度通常为0-20个氨基酸，较佳地为2-10个氨基酸，最佳地为2-4个氨基酸。技术人员可按照本领域常规方法(如参见PNAS1998；95=5929-5934；ProteinEng,2000；13(5)309-312等文献)设计连接肽。通常，连接肽不影响或严重影响癌胚抗原与热休克蛋白氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。优选的连接肽例子包括(但并不限于)为了有利于蛋白折叠成相互独立的结构域，用SGGGGSGGGG等序列作为连接臂是合适的；为了有利于蛋白酶把CEA-Hsp70Ll切割两个独立的蛋白分子，可用活性X因子的酶切位点(IEGR)作连接臂。相似的，糜蛋白酶1、木瓜蛋白酶、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白酶、胰蛋白酶等的酶切位点也可设计作为氨基酸连接臂；为了有利于纯化，可把Mlis作为连接臂，以用金属亲和层析纯化CEA-Hsp70Ll融合蛋白；上述三种方案的结合也可设计成新的氨基酸连接臂，如NVVVHQAHHHHHHEFTYK连接臂就是融合了蛋白酶切位点(NIa蛋白酶)和金属亲和层析位点6His。此外，另一种优选方式是将癌胚抗原元件和热休克蛋白元件直接连接，而不含任何连接肽。编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得癌胚抗原和或热休克蛋白的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。腺病毒载体的构建目前的腺病毒载体大多来源于腺病毒Ad2和Ad5这两种血清型。适用于基因治疗应用的腺病毒载体属于复制缺陷型病毒。由于El编码的蛋白功能是其它所有腺病毒基因有效表达所必须的，因此最常见的策略就是用外源DNA替代病毒El区序列，通过包装细胞反式提供El区序列而产生的复制缺陷腺病毒载体。在本发明中优选采用ΔΕ1ΔΕ3复制缺陷型腺病毒表达载体，例如PAdEasy-I(可购自Strategen公司)。可用于本发明的宿主包装细胞是可以表达腺病毒El区基因的任何宿主细胞，因为该细胞能够提供复制缺陷型腺病毒复制所需的El区基因表达产物。一种优选的常用包装细胞是293细胞，该细胞由人胚肾细胞经Ad5腺病毒DNA片段转化而成，载有整合入细胞基因组的腺病毒El区等病毒基因片段，并持续表达El区蛋白，能为El区置换型腺病毒载体提供反式补偿。利用E3区缺失不影响病毒感染性，切去E3区可增加载体外源性DNA容量。切去El和E3区，外源基因插入容量可达约8kb。而克隆更大的外源DNA片段则需切去其他的病毒序列，缺失的功能再通过互补细胞系或辅助病毒反式提供。本发明人发现采用本领域中推荐的细胞外病毒直接连接方法(例如采用Adeno-X表达系统)难以高效获得本发明的含融合蛋白的重组腺病毒，线性PAd骨架与含有该重组腺病毒的完整表达盒的线性片段在体外连接效率低，转化细菌后获得同源重组的重组腺病毒的几率极低。然而，本发明人经过长期和反复的实验出乎预料地发现，采用同源重组的方法反而可高效获得本发明的重组腺病毒，且所得的重组腺病毒对靶细胞具有高感染性和低病源性，极显著优于采用细胞外病毒直接连接法所获得的结果。因此，本发明的重组腺病毒宜采用同源重组的方法获得。可以采用选自下组的同源重组法，例如(1)细胞内同源重组，如细胞内病毒DNA同源性重组；(2)细菌内同源重组，如细菌内质粒DNA同源重组；(3)C0S/TPC共转染同源重组；或(4)位置特异性重组。本发明中优选采用细菌内同源重组法，例如采用pAdEasy-1、pShuttle_CMV或pShuttle-IRES，并将含有融合蛋白表达盒的线性片段转化含有腺病毒骨架的大肠杆菌(例如大肠杆菌BJ5183)，使它们在细菌内同源重组。_0]mnm$mmmmmafo,Jkmmm^immcea抗ιιιφ寺贤丨牛τmm,树突状细胞(DendriticCells,DC)是正常人体内存在的一种具有特殊功能的抗原提呈细胞，被喻为机体的“天然佐剂”，能够直接摄取、加工、呈递抗原，刺激体内的初始型T细胞活化，是机体免疫应答的“启动者”。此外，DC还可以通过直接或间接方式促进B细胞的增殖与活化，调控体液免疫应答；刺激记忆T细胞活化诱发再次免疫应答；与NK相互作用影响非特异性的、天然免疫应答。DC处于肿瘤免疫的关键环节，能摄取和加工处理肿瘤抗原并调动机体主动特异性抗肿瘤免疫反应杀伤肿瘤细胞。本发明中提供了一种由本发明重组腺病毒致敏的树突状细胞，其可有效用于诱导CEA抗原特异性T细胞。可采用本领域中已知的用于致敏树突状细胞的常用方法使得本发明的树突状细胞致敏，优选用本发明的重组腺病毒对树突状细胞进行病毒转染。可根据本领域中常用的方法，用本发明致敏的树突状细胞进一步诱导的CEA抗原特异性T细胞。在本发明的一个实施方式中，采用本发明所述的致敏的树突状细胞体外刺激人外周血淋巴细胞。所述方法优选包括如下步骤(i)收集致敏的树突状细胞细胞，并对其进行灭活(例如放射性灭活)；(ii)将致敏且灭活的树突状细胞按树突状细胞τ细胞为11-1000、优选120的比例共同孵育，优选在完全培养基中添加10-200U/ml的IL-2，培养7士2天；(iii)重复步骤⑴和(ii)3-10次，收集增殖的T细胞，即为CEA阳性肿瘤特异性T细胞。组合物本发明中还提供了一种药物组合物，其包括(a)有效量的本发明的重组腺病毒、树突状细胞或用本发明树突状细胞诱导的T细胞，以及(b)药学或免疫学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。所述组合物可用于预防或治疗CEA阳性肿瘤。如本文所用，术语“CEA阳性肿瘤”或“CEA+肿瘤”包括指在肿瘤细胞膜上高度表达CEA抗原的肿瘤，代表性的例子包括(但并不限于)直结肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤。如本文所用，“活性物质”是指本发明的重组腺病毒、该重组腺病毒致敏的树突状细胞、CEA抗原特异性T细胞或它们的组合。在制得本发明的重组腺病毒、该重组腺病毒致敏的树突状细胞或CEA抗原特异性T细胞之后，可将所需纯度的所述活性物质与任选的生理上、药学或免疫学上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂(Remington'sPharmaceuticalSciences,16版，Osol,Α.,Ed.,[1980])，以冻干形式或水溶液形式进行混合，从而制得本发明的组合物。可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者而言在所用的剂量和浓度下应是无毒的，并且可含有缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸缓冲液；抗氧化剂如维生素C；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。作为最常见的例子，水和生理盐水就可作为本发明制剂中的载体。在本发明的另一个实施方式中，本发明的活性物质占所述组合物总重量的0.001-99.9wt%，优选l_95wt%，更优选5_90wt%，再优选10_80wt%。含本发明活性物质的组合物(或制剂)可以用常规方式施用于需要治疗的个体，这些方式包括(但并不限于)肌内注射、皮下注射、静脉注射等。施予本发明活性物质的量可由专业人员(如医师)根据对象的具体情况，如病症、病程、年龄、性别、其它相关治疗等确定。通常，给予本发明活性物质的量为重组腺病毒=IO7-IO11PFU/千克体重，较佳地108-5XIO10PFU/千克体重，更佳地优选IO9-IOiqPFU/千克体重；本发明重组腺表达致敏的DC细胞IO3-IO7致敏DC细胞/千克体重，较佳地105-5XIO6致敏DC细胞/千克体重，更佳地IO5-IO6致敏DC细胞/千克体重；本发明CEA抗原特异性T淋巴细胞=IO5-IO9CEA抗原特异性T淋巴细胞/千克体重，较佳地IO6-IO8CEA抗原特异性T淋巴细胞/千克体重，更佳地IO6-IO7CEA抗原特异性T细胞/千克体重。本发明的组合物中还可包含治疗和/或预防CEA+肿瘤的其它活性物质或与这些其它物质联合施用(如同时或先后施用)。在一个优选例中，所述治疗和/或预防CEA+肿瘤的其它活性物质选自肿瘤化疗药，如奥沙利钼；或肿瘤抗原冲击的树突状细胞，肿瘤抗原可以是已知的抗原肽也可以是肿瘤细胞裂解物。本发明的主要优点1.本发明的重组腺病毒通过感染细胞，表达于胞内，克服了“CEA-Hsp融合蛋白”原核表达的以下不足之处1)表达技术具有一定的难度，难以获得大量产品用于将来临床治疗目的；2)该融合蛋白诱导树突状细胞成熟的能力过强，采用原核表达法很难控制体内用量，易于出现免疫反应过强的副作用；3)hsp70Ll的天然形式为胞内蛋白，或许在胞内发挥主要作用；4)以原核表达形式产生的融合蛋白缺少正确的折叠和糖基化修饰等真核蛋白(其天然形式)的特点；5)融合蛋白通过在细胞外与受体结合内吞形式进入胞内，根据免疫学原理，胞外蛋白主要通过MHC-II类途径递呈抗原，也就是诱导抗原特异性的CD4+T细胞；而胞内蛋白主要通过MHC-I类途径递呈抗原，也就是诱导抗原特异性的CD8+T细胞，本发明主要目的就是实现该MHC-I类途径的抗原递呈。2.本发明的重组腺病毒对靶细胞具有高感染性和低病源性，能安全、高效地介导基因表达转移及表达，具有致癌、至突变几率小等优点，为抗肿瘤基因治疗提供了理想的基因转移载体；3.本发明的重组腺病毒及其致敏的树突状细胞可有效诱导CEA抗原特异性的杀伤性T细胞生成，而后者具有杀伤CEA阳性肿瘤细胞株和抑制CEA阳性肿瘤生长，延长荷瘤动物生存期的作用。从而，为CEA阳性肿瘤预防和治疗提供了的新策略。实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(例如，基本分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1992；基本细胞学操作均参照《细胞培养实验指南》第一版，科学出版社，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.AdCEA576_669hsp70Ll的设计与制备本实验中限制性内切酶和Taq酶购自NEB公司；PQE30和宿主菌M15购自Qiagen公司；预转染AdEasy-I的大肠杆菌BJ5183、pShuttle_CMV购自Strategen公司；LS174T购自ATCC。人单核来源树突状细胞的诱导取健康志愿者抗凝血200ml，应用Ficolll.077密度梯度离心，获得人外周血单个核细胞；免疫磁珠法分离人单核细胞，简言之，将2XIO8人外周血单个核细胞与200μ1CD14免疫磁珠于4°C孵育15分钟；将结合了免疫磁珠的人外周血单个核细胞置于磁场中，洗去阴性细胞，从柱中冲出阳性细胞，即为人外周血CD14+单核细胞；将新鲜分离的人CD14+单核细胞(Mo)按照IO6个细胞/ml培养在含有10%FBS、人GM-CSF(500U/ml)、人IL-4(10ng/ml)的RPMI1640培养基中。6天后，收集悬浮细胞，即为人单核来源树突状细胞(MoDC)。从LPS(脂多糖)刺激的人单核来源树突状细胞(MoDC)中扩增获得Hsp70Ll的全长cDNA(按照参考文献16)。用RT-PCR的方法(上游引物5-CTCGTCGACGCGGCCATCGGAGTTCACCTG-3(SEQIDNO:3)，下游引物5-GGGGTACCAGATGCTATCTCAATAGAGATTGCT-3(SEQIDNO4)；反应参数95°C15秒，53°C30秒，72°C40秒，29循环后72°C延伸10分钟)克隆人Hsp70LlcDNA，上下游引物中引入SalI和kpnl酶切位点。从LS174T细胞中分离总RNA，用RT-PCR的方法(上游引物5-ATTGAGCTCGTGAGTGCAAACCGCAGTGACC-3(SEQIDNO5)，下游引物为5-TATGTCGACGACTATGGAATTATTGCGGCC-3(SEQIDNO6)；反应参数95°C、15秒，56.5°C、30秒，72°C、45秒，29循环后72°C延伸10分钟)克隆人CEA576-669cDNA，上下游引物中引入sacI和SalI酶切位点。将CEA576_669cDNA片断插入到质粒PQE30中，形成pQE30CEA576-669；将Hsp70LlcDNA插入到pQE30CEA576_669，形成重组pQE30CEA576_669hsp70Ll。由此获得的重组pQE30CEA576_669hsp70Ll中，CEA576_669的cDNA位于hsp70LlcDNA的5端，中间由限制性酶切位点SalI连接，其基因序列如SEQIDN0:1所示。通过核苷酸序列分析验证cDNA基因。以重组pQE30CEA576-669hsp70Ll为模板，扩增CEA576_669hsp70Ll片段(反应参数95°C、15秒，5730秒，72°C、90秒，29循环后72°C延伸10分钟)，所用引物序列如下为上游5-CCGGTACCATGGTGAGTGCAAACCGCAGTGACC-3(SEQIDNO7)；下游5-CCCTCGAGTTAAGATGCTATCTCAATAGAGATTGC-3(SEQIDNO8)。扩增的CEA576_669hsp70Ll片断经kpnl和xhol酶切后插入到穿梭质粒pShuttle-CMV，构建成重组pShuttleCEA576_669hsp70Ll；经测序鉴定正确后，经过PmeI酶切线性化，转化预转染了复制缺陷型pAdEasy-Ι的大肠杆菌BJ5183(常规CaCl2、热休克方法)；经卡那抗性筛选获得重组腺病毒质粒pAdCEA576_669hsp70Ll，经限制性酶切分析证实后，将获得的阳性克隆，进一步扩增，大量抽提PAdCEA576_669hsp70Ll，经PacI酶切线性化后，用于转染HEK293细胞，进行腺病毒的包装。(1)制备重组腺病毒耜提液本实验采用的DMEM培养液、胎牛血清FBS购自PAA公司；转染试剂购自Polyplus-Transfection公司。HEK293细胞购自中国科学院上海细胞所。将HEK293细胞(表达腺病毒E1A、ElB蛋白的人胚肾细胞株293细胞)在10%FBS的DMEM培养液、37°C、5%CO2环境中培养至50-70%融合。采用脂质体方法将线性化pAdCEA576-669hsp70Ll转染至HEK293细胞，操作参照说明书进行。2h后添加等体积的含10%FBS的DMEM培养液，24h后更换新鲜的含10%FBS的DMEM培养液，继续培养。培养至10-14天时，出现细胞病变效应，包括细胞黏附性降低、脱落、变圆、呈现串珠样改变。收集出现病变的细胞，反复冻融3次，制备成重组腺病毒粗提液，于-70°C保存备用。(2)单个噬斑纯化病毒本试验采用Sigma公司的琼脂糖。将HEK293细胞(3X105个细胞/孔)接种于6孔板，至70%融合时，加入重组腺病毒粗提液，37°C感染2h，弃去病毒液，加入1.25%琼脂糖半固体培养基，室温培养30分钟，待凝固后，放置37°C、5%CO2环境中培养至出现噬斑。挑取单个噬斑(选取3个克隆)，重新感染HEK293细胞，经反复扩增，制备病毒液，进行PCR鉴定(反应参数95°C、15秒，620C>30秒，72°C、90秒，35循环后72°C延伸10分钟)。结果显示pAdCEA576-669hsp70Ll含有1812bp特征性条带(图1)。所用引物序列如下上游5-GGAAATGCGGCCGCATGGTGAGTGCAAAC-3(SEQIDNO9)；下游5-AATCGGCTCGAGTTAAGATGCTATCTCAAT-3(SEQIDNO10)。⑶AdCEA576-669hsp70Ll的扩增及纯化pAdCEA576-669hsp70Ll的大量扩增将HEK293细胞以50-70%的汇合率铺于60mm培养皿中，以30-50%的体积比加入含病毒上清液。在CPE现象出现后，有1/3到1/2的细胞脱离漂浮时，离心收集细胞。将细胞重悬于2.OmlPBS中。于液氮中冻结细胞，37°C水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行3次。将获得的病毒上清进一步感染IOOmm培养皿的HEK293细胞，按前述方法收集病毒，并进而将其感染多个IOOmm培养皿的HEK293细胞，以获得足够量的病毒。重组腺病毒的纯化分别进行不连续CsCl梯度离心(密度分别为1.4g/ml和1.2g/ml)和连续CsCl梯度离心(1.3g/ml)。透析去除CsCl，将重组腺病毒保存于缓冲液(IOmM1^土8，4%蔗糖，21111MgCl2,pH8.0)。并且，多次实验证明了采用上述(1)(3)中的方法获得本发明的重组腺病毒具有很高的重现性。⑷测定AdCEA576_66ghsp70Ll滴度按常规噬斑分析法测定pAdCEA576_669hsp70Ll滴度为1.2X1012PFU/ml。实施例2.重组AdCEA576_669hsD70Ll体外感染人单核来源树突状细胞与表汰本实验中RPMI1640培养基和Ficolll.077购自PAA公司；人GM-CSF和人IL-4购自Peprotech公司；CD14免疫磁珠、MS柱和分离架购自MiltenylBiotec公司；AdLacZ购自Strategen公司。人单核来源树突状细胞(MoDC)的诱导方法如实施例1中所述。用含有10%FBS的RPMI1640培养基重悬收集的MoDC，调整浓度为IO7个细胞/ml。按照MOI=10001，用重组AdCEA576_669hsp70Ll(如实施例1中所制备)感染MoDC。24h后收集细胞，提取总RNA，进行RT-PCR(CEA576_669反应参数94°C、30秒，54°C、30秒，720C>30秒，35循环后72°C延伸10分钟；hsp70Ll反应参数94°C、30秒，60°C、30秒，72°C、30秒，35循环后72°C延伸10分钟；CEA576_669hsp70Ll反应参数94°C、30秒，60°C、30秒，72°C、30秒，35循环后72°C延伸10分钟)和实时PCR(各反应参数同RT-PCR)的鉴定。另设置未感染、AdLacZ(购自Strategen公司，自行扩增和纯化如实施例1所述方法；MOI=10001)感染组对照。结果见图2。该结果表明AdCEA576_669hsp70Ll感染的人MoDC后，表达CEA576_669，Hsp70Ll,以及CEAhsp70LlmRNA的水平显著高于未转染组和AdLacZ转染组。RT-PCR引物序列如下CEA576_669(279bp)上游5-ATTGAGCTCGTGAGTGCAAACCGCAGTGACC_3(SEQIDNO:11)；下游5-TATGTCGACGACTATGGAATTATTGCGGCC-3(SEQIDNO:12)Hsp70Ll(122bp)上游5-CAGCATGTGAGGCCGTCTA_3(SEQIDNO:13);下游5-TGCTGCCAATCCAACAAT-3(SEQIDNO14)CEA576_669Hsp70Ll(Illbp)上游5-AAATCACGCCAAATAATAACGG-3(SEQIDNO:15);下游5-TGCAGCCCAGGTGAACTCC-3(SEQIDNO16)。实施例3.重组AdCEA576_66ghsp70Ll基因修饰促进人MoDC的成熟活化本实施例中各抗体购自B.D.Pharmingen公司；CFSE购自Calbiochem公司；CD3免疫磁珠购自MiltenylBiotech公司；原核蛋白CEA576_669hsp70Ll由本室采用常规方法纯化并保存(挑取转化有pQE30-CEA576_669hsp70Ll质粒的M15菌，经过诱导表达后，其表达以包涵体形式存在于胞内；包涵体经过洗涤和溶解，上金属离子螯合柱和DEAE柱层析纯化CEA576_669hsp70Ll融合蛋白，透析后溶于PBS，保存于-80°C)。将新鲜分离的人外周血⑶14+单核细胞(Mo)以IO6个细胞/ml培养在含有10%FBS、人GM-CSF(500U/ml)、人IL-4(10ng/ml)的RPMI1640培养基中。6天后，收集悬浮细胞即为人单核来源树突状细胞(MoDC)。用含有10%FBS的RPMI1640培养基重悬收集的MoDC，调整浓度为IO7个细胞/ml；按照MOI=10001，分别用AdLacZ或AdCEA576_669hsp70Ll感染MoDC,2h后洗去游离病毒，继续培养在上述培养基中；CEA576_669hsp70Ll蛋白按照100μg/ml与MoDC孵育。48h后收集MoDC，进行以下试验(1)表型检测用抗共刺激分子⑶40、⑶54、⑶83、⑶86和MHCII分子的抗体标记MoDC细胞，并进行流式细胞(FACSCalibur，BD公司)分析。结果显示，与未感染组和AdLacZ组比较，重组腺病毒AdCEA576_669hsp70Ll基因修饰的人MoDC表达共刺激分子⑶54、⑶86和MHC-II分子的水平轻度上调；表达⑶83和⑶40的水平没有改变(图3A)。(2)刺激同种T淋巴细胞增殖的能力分离同种⑶3+T淋巴细胞(应用免疫磁珠方法，如实施例2)。将MoDC与同种⑶3+T淋巴细胞按照MoDC⑶3+T淋巴细胞=110的比例混合培养5天，检测T细胞的增殖情况。T细胞预先用CFSE标记，用流式细胞仪检测CFSE低表达的T淋巴细胞％(反映增殖的T细胞)。结果显示，与未感染组和AdLacZ组比较，重组腺病毒AdCEA576_669hsp70Ll基因修饰的人MoDC刺激同种CD3+T淋巴细胞增殖的水平轻度上调(图3B)。上述试验结果表明，重组AdCEA576_669hsp70Ll基因修饰促进了人MoDC的成熟活化。实施例4.重组AdCEA576_66ghsp70Ll基因修饰的人MoDC诱导CEA抗原特异件CTL产牛本实施例中，CAP-I-MHC四聚体购自ProImmune公司；⑶8免疫磁珠购自MiltenylBiotech公司；ELISP0T培养板购自Millipore公司；抗人IFN-γ单抗购自B.D.Pharmingen公司；7-AAD购自Sigma公司；重组CEA576_669抗原由本室纯化(原核表达载体pQE30-CEA576_669在M15菌中诱导表达后，重组的CEA576_669蛋白主要以包涵体的形式存在于细菌胞内，包涵体经过洗涤和溶解后，过金属离子螯合柱层析初步纯化重组CEA576_669蛋白，然后经过常规方法复性、透析、过滤除菌分装保存于-80°C)。FITC-偶联的抗人HLA-A2.1抗体购自B.D.Pharmingen公司。人外周血单个核细胞预先经FITC-偶联的抗人HLA-A2抗体标记，流式细胞仪分析选取HLA-A2阳性样本，进行免疫磁珠法分离CD14+单核细胞，和MoDC的诱导。按照实施例3感染人HLA-A2+MoDC，48h后收集MoDC，分装成4份；一份与自身⑶3+T淋巴细胞按照120的比例混合培养，其余3份用含有5%DMS0,95%FBS的冻存液冻存于_80°C。培养7天后，复苏一支冻存的重组AdCEA576_669hsp70Ll基因修饰的人MoDC，将其按照同样比例加入到混合培养体系中，培养3天后，添加人IL-2(100U/ml)，继续培养。同法进行第3个循环的刺激。在21天后，进行如下试验(DHLA-A2.1限制性CEA6。5_613抗原肽(CAP-I)特异性T淋巴细胞比例(CDSiCAP-I-MHC四聚体)收集培养终止的细胞，用抗⑶8和CAP-I-MHC四聚体进行双色标记，流式细胞仪分析CD8+CAP-1-MHC四聚体+%。结果如图4A所示，该结果表明与未感染、AdLacZ感染组、CEA576_669hsp70Ll致敏DC组(图中分别示为Ctrl、AdLacZ和CEAhsp70Ll)比较，AdCEA576_669hsp70Ll基因修饰的人MoDC(图中示为AdCEAhsp70Ll)能够明显诱导CAP-1抗原特异性⑶8+T细胞的生成。(2)HLA-A2.1限制件CEA576_66g抗原特异件CDS=T细胞分泌IFN-γ的水平分离共培养体系中的⑶8+Τ淋巴细胞，与复苏的自身MoDC按照51比例培养，体系中添加人CEA576_669蛋白(10μg/ml)，培养至包被有抗人IFN-γ的96孔培养板，培养3天后终止，按照ELISP0T说明书进行IFN-γ分泌斑点的检测。结果如图4Β所示，该结果表明与未感染、AdLacZ感染组和CEA576_669hsp70Ll致敏DC组(图中分别示为Ctrl、AdLacZ和CEAhsp70Ll)比较，AdCEA576_669hsp70Ll基因修饰的人MoDC组(图中示为AdCEAhsp70Ll)诱导的CD8+T细胞在CEA576_669抗原刺激后，出现IFN-γ斑点的数量和斑点大小明显增加，说明该培养体系中含有更多的CEA特异性CD8+T细胞。(3)对CEAi肿瘤细胞的杀伤作用分离共培养体系中的⑶8+Τ淋巴细胞，与CFSE标记的CEA+肿瘤细胞株(LS174T和SW480购自ATCC)按照101的比例共培养，4h后，加入7-AAD，立即用流式细胞仪检测肿瘤细胞的死亡(CFSE+7-AAD+%)。结果显示，与未感染、AdLacZ感染组和CEA576_669hsp70Ll致敏DC组比较，AdCEA576_669hsp70Ll基因修饰的人MoDC组诱导的CD8+T细胞杀伤CEA+的LS174T和SW480肿瘤细胞的能力明显增加(附图4C)。综上，重组AdCEA576_669hsp70Ll基因修饰的人MoDC能够更强的诱导CEA576_669抗原特异性CTL产生。尤其是，AdCEA576_669hsp70Ll修饰的人树突状细胞比原核蛋白CEA576_669hsp70Ll冲击的人树突状细胞能够更强烈的诱导CEA特异性CTL的产生，表现在AdCEA576_669hsp70Ll修饰的人树突状细胞诱导的对Cap-I(CEA蛋白中的一种HLA-A2限制性肽)特异性的CD8+T细胞、杀伤CEA+肿瘤细胞的能力更强。实施例5.重组AdCEA576_669hsp70Ll体内免疫实验动物诱导CEA576_669抗原特异性CTL的产生取4周龄HLA-A2.Ι/Kb转基因小鼠(购自JacksonLaboratory)骨髓细胞，按照IXIO7个细胞/ml培养在含有10%FBS,鼠GM-CSF(10ng/ml)，鼠IL_4(lng/ml)的RPMI1640培养基中，三天后吸弃悬浮细胞，贴壁细胞继续培养在上述培养基中，在6天后，收集悬浮细胞，即为骨髓来源树突状细胞。用含有10%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞，调整浓度为1XIO7个细胞/ml，按照MOI=10001加入重组腺病毒AdLacZ或AdCEA576_669hsp70Ll，2h后，洗去游离病毒，一部份用于免疫，其余冻存，用于后续免疫。将30只4周龄HLA-A2.Ι/Kb转基因小鼠(雌雄比例11，购自JacksonLaboratory)按照随机原则分成五组；①未处理组；②AdLacZ免疫组，腹腔注射，IO9PFU/只；③AdCEA576_669hsp70Ll免疫组，腹腔注射，IO9PFU/只；④AdLacZ基因修饰的小鼠骨髓来源树突状细胞免疫组(AdLacZ-DC)，腹腔注射，IO6AdLacZ-DC细胞/只；⑦AdCEA576_669hsp70Ll基因修饰的小鼠骨髓来源树突状细胞免疫组(AdCEA576_669hsp70Ll-DC)，腹腔注射，IO6AdCEA576_669hsp70Ll-DC细胞/只；免疫方案为每隔7天免疫一次，共免疫三次。21天后，进行如下试验(DHLA-A2.1限制性CAP-I抗原肽特异性T淋巴细胞比例(CT^CAP-I-MHC四聚体)测定分离各组小鼠脾细胞，用抗⑶8抗体和CAP-I-MHC四聚体对脾细胞进行双色标记，流式细胞仪分析⑶8+CAP-1-MHC四聚体+T淋巴细胞比例。结果显示，与未免疫组和AdLacZ或AdLacZ-DC免疫组比较，AdCEAhsp70Ll免疫组和AdCEA576-669hsp70Ll-DC免疫组诱导的CD8+CAP-1-TCR+T细胞比例明显增加(图5A)。(2)HLA-A2.1限制件CEA576-66g抗原特异件CDS=T细胞分泌IFN-γ的水平分离各组小鼠脾细胞中的⑶8+Τ淋巴细胞，与自身骨髓来源DC按照51比例培养至包被有抗鼠IFN-γ的96孔培养板，体系中添加鼠IL-2(100U/ml)，和CEA576_669抗原(10yg/ml)；培养3天后终止，然后按照ELISP0T说明书进行IFN-γ分泌斑点的检测。结果显示，与未免疫组和AdLacZ或AdLacZ-DC免疫组比较，AdCEA576-669hsp70Ll免疫组和AdCEA576-669hsp70Ll-DC免疫组诱导的⑶8+T细胞在CEA576_669抗原刺激后，出现IFN-γ斑点的数量和斑点大小明显增加，说明AdCEA576-669hsp70Ll和AdCEA576-669hsp70LI-DC免疫能够诱导体内产生更多的CEA576-669抗原特异性⑶8+T细胞(图5B)。(3)对CEAi肿瘤细胞的杀伤作用分离各组小鼠脾细胞中的⑶8+T淋巴细胞，与CFSE标记的CEA+肿瘤细胞株(LS174T和SW480)按照101的比例共培养，4h后，加入7-AAD，立即用流式细胞仪检测肿瘤细胞的死亡(CFSE+7-AAD+%)。结果显示，与未免疫组和AdLacZ或AdLacZ-DC免疫组比较，AdCEA576-669hsp70Ll免疫组和AdCEA576-669hsp70Ll-DC免疫组诱导的CD8+T细胞杀伤CEA+的LS174T和SW480肿瘤细胞的能力明显增力Π，表明AdCEA576-669hsp70Ll或AdCEA576-669hsp70Ll-DC免疫能够诱导体内产生更多的CEA抗原特异性⑶8+CTL(图5C)。综上，AdCEA576-669hsp70Ll免疫组和AdCEA576-669hsp70Ll-DC免疫组能够明显诱导CEA抗原特异性CTL的产生。实施例6.重组AdCEA576-66ghsp70Ll治疗CEA阳性肿瘤疾病将50只4周龄HLA-A2.Ι/Kb转基因小鼠(雌雄比例11，购自JacksonLaboratory)按照随机原则分成五组；①未处理组；②AdLacZ免疫组，腹腔途径，IO9PFU/只；③AdCEA576_669hsp70Ll免疫组，腹腔途径，IO9PFU/只；④AdLacZ基因修饰的小鼠骨髓来源树突状细胞免疫组(AdLacZ-DC)；腹腔途径，IO6AdLacZ-DC/只；⑤AdCEA576_669hsp70Ll基因修饰的小鼠骨髓来源树突状细胞免疫组腹腔途径，106AdCEA576_669hsp70L-DC/只；免疫方案为每隔7天免疫一次，共免疫三次。21天后，分离小鼠脾细胞、腋窝、腹骨沟肠系膜淋巴结细胞，去除红细胞后，用PBS重悬，按照5X107/只，静脉注射给CEA+肿瘤荷瘤动物模型。建立CEA+肿瘤荷瘤动物模型将1XIO6的LS174T细胞，于皮下接种于4周龄的裸鼠；共接种50只裸鼠，三天后按照随机原则分为4组，接受细胞治疗①未治疗组；②未免疫小鼠来源细胞治疗组；③AdLacZ免疫小鼠来源细胞治疗组；或AdLacZ-DC免疫小鼠来源细胞治疗组；④AdCEA576-669hsp70Ll免疫小鼠来源细胞治疗组；或AdCEA576-669hsp70-DC免疫小鼠来源细胞治疗组。治疗方案接种肿瘤后3天开始接受细胞治疗；隔7天后重复一次。待出现可测肿瘤后，每隔一天进行肿瘤大小的测量和生存期的观察，共观察3个月。结果显示，与未治疗组、未免疫小鼠来源细胞治疗组、和AdLacZ或AdLacZ-DC免疫小鼠来源细胞治疗组比较，AdCEA576_669hsp70Ll免疫小鼠来源细胞治疗组和AdCEA576_669hsp70Ll-DC免疫小鼠来源细胞治疗组的动物肿瘤生长受到明显抑制(图6A)；生存期明显延长(图6B)。实施例7.应用pAdeno-x体系构津重组腺病毒AdCEA576_66ghsp70Ll如实施例1，以重组pQE30CEA576_669hsp70Ll为模板，扩增CEA576_669hsp70Ll片段(反应参数95°C、15秒，5730秒，7290秒，29循环后72°C延伸10分钟)，所用引物序列如下为上游上游引物5-TTCCTCTAGAATGGTGAGTGCAMCCGCAGTGAC-3(SEQIDNO17)；下游引物:5-AAGTGGTACCAGATGCTATCTCAATAGAGAT-3(SEQIDNO18)扩增的CEA576_669hsp70Ll片断经kpnl和xbal酶切后插入到穿梭质粒pShuttle2，引入CMV启动子和PolyA尾，构建成重组pShuttleCEA576_669hsp70Ll；经测序鉴定正确后，经过PI-SceI和I-CeuI双酶切，得到含有CMV启动子、目的片段和PolyA尾的完整表达盒的线性片段，然后与pAdeno-X的线性骨架在体外用连接酶连接；转化大肠杆菌(常规CaCl2、热休克方法)；经氨苄抗性筛选可获得1-2个抗性株，抽提质粒，进行经XhoI的限制性酶切分析(图7A)和Xbal/Kpnl双限制性酶切(图7B)发现抗性株中的质粒没有出现应有的限制性酶切片段分布和目的片段。上述结果表明线性pAd骨架与含有该重组腺病毒的完整表达盒的线性片段在体外连接效率非常低，转化细菌后获得同源重组的重组腺病毒的几率非常低。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。参考文献1.SrivastavaPK.Interactionofheatshockproteinswithpeptidesandantigenpresentingcells:chaperoningoftheinnateandadaptiveimmuneresponses.AnnuRevImmunol2002；20395425.2.TodrykSM,GoughMJ,PockleyAG.Facetsofheatshockprotein70showimmunotherapeuticpotential.Immunology.2003；1101-9.3.ManjiliΜΗ,WangXY,MacDonaldIJ,ArnoukH,YangGY,PritchardMT,SubjeckJR.Cancerimmunotherapyandheat-shockproteins:promisesandchallenges.ExpertOpinBiolTher.2004；4(3)363-734.BlachereNE,UdonoH,JanetzkiS,LiΖ,HeikeΜ,SrivastavaPK.Heatshockproteinvaccinesagainstcancer.JImmunotherEmphasisTumorImmunol.1993；14352-356.5.LiΖ,SrivastavaPK.Acriticalcontemplationontheroleofheatshockproteinsintransferofantigenicpeptidesduringantigenpresentation.BehringInstMitt.1994；94:37_47.6.MoroiY,MayhewM,TrckaJ,etal.Inductionofcellularimmunitybyimmunizationwithnovelhybridpeptidescomplexedtoheatshockprotein70.ProcNatlAcadSciUSA2000；973485907.Arnold-SchildD，HanauD，SpehnerD，SchmidC，RammenseeHG,deIaSalleH，SchildH.Cuttingedge:receptor_mediatedendocytosisofheatshockproteinsbyprofessionalantigen-presentingcells.JImmunol.1999；162(7):3757_60·8.CastellinoF，BoucherΡΕ,EichelbergK，MayhewM，RothmanJE,HoughtonAN，GermainRN0Receptor-mediateduptakeofantigen/heatshockproteincomplexesresultsinmajorhistocompatibilitycomplexclassIantigenpresentationviatwodistinctprocessingpathways..JExpMed.2000；191(11)1957-64.9.SvenssonPA，AseaA，EnglundMC，BauseroMA,JernasM,Wiklund0，OhlssonBG，CarlssonLM，CarlssonB.MajorroleofHSP70asaparacrineinducerofcytokineproductioninhumanoxidizedLDLtreatedmacrophages.Atherosclerosis.2006Mar；185(1)32-8.Epub2005Jul1.10.CaudillMM，LiZ.HSPPC-96:apersonalisedcancervaccine.ExpertOpinBiolTher.2001May；1(3):539_47.11.CohenL，deMoorC，ParkerPA,AmatoRJ.QualityoflifeinpatientswithmetastaticrenalcellcarcinomaparticipatinginaphaseItrialofanautologoustumor-derivedvaccine.UrolOncol.2002；7(3)119-24.12.CohenL,ParkerPA,SternerJ,DeMoorC.QualityoflifeinpatientswithmalignantmelanomaparticipatinginaphaseItrialofanautologoustumour-derivedvaccine.MelanomaRes.200212(5):505_1L13.BelliF,TestoriA,RivoltiniL,MaioM,AndreolaG,SertoliMR,GallinoG，PirisA，CattelanA,LazzariI，CarrabbaM，ScitaG，SantantonioC，PillaL，TragniG，LombardoC，ArientiFiMarchianoA,QueiroloP，BertoliniF，CovaA，LamajE，AscaniL，CameriniR，CorsiM，CascinelliN，LewisJJ,SrivastavaP，ParmianiG.Vaccinationofmetastaticmelanomapatientswithautologoustumor-derivedheatshockproteingp96一peptidecomplexes:clinicalandimmunologicfindings.JClinOncol.2002；20(20):4169_80.14.MaciagPC，PatersonY.Technologyevaluation:HspE7(Stressgen).CurrOpinMolTher.2005；7(3):256_63·15.HuntS.Technologyevaluation:HspE7，StressGenBiotechnologiesCorp.CurrOpinMolTher.2001；3(4):413_7.16.WanT，ZhouX，ChenG，AnH，ChenT，ZhangW，LiuS，JiangY，YangF，WuY，CaoX.NovelheatshockproteinHsp70LlactivatesdendriticcellsandactsasaThlpolarizingadjuvant.Blood.2004；103(5):1747—54.17.WuY，WanT，ZhouX，WangB，YangF，LiN，ChenG，DaiS，LiuS，ZhangM，CaoX.Hsp70-likeprotein1fusionproteinenhancesinductionofcarcinoembryonicantigen-specificCD8+CTLresponsebydendriticcellvaccine.CancerRes.2005；65(11)4947-4954.权利要求1.一种通过同源重组获得的重组腺病毒，其携带热休克蛋白与癌胚抗原的融合蛋白的编码序列，其特征在于，该腺病毒的基因组缺失El区和E3区，并且在El和/或E3区位置插入了所述融合蛋白编码序列的表达盒，该表达盒依次包括启动子序列、所述融合蛋白的编码序列以及加尾信号序列，其中所述热休克蛋白选自Hsp70或Hsp70Ll。2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述癌胚抗原选自人癌胚抗原的全长序列或含人癌胚抗原的第576-669位的片段。3.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述融合蛋白的编码序列从5'至3'依次具有癌胚抗原编码序列、任选的连接肽编码序列和热休克蛋白编码序列。4.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒为Ad5型腺病毒。5.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述同源重组选自细胞内同源重组；细菌内同源重组；C0S/TPC共转染同源重组；或位置特异性重组。6.一种用权利要求1所述的重组腺病毒致敏的树突状细胞。7.—种药物组合物，其特征在于，它包括(a)有效量的权利要求1所述的重组腺病毒、权利要求6所述的树突状细胞或用权利要求6所述的树突状细胞诱导的T细胞，以及(b)药学或免疫学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。8.一种制备重组腺病毒的方法，所述重组腺病毒携带热休克蛋白与癌胚抗原的融合蛋白的编码序列，其特征在于，该方法包括如下步骤(a)提供基因组中缺失El区和E3区的复制缺陷型腺病毒；(b)提供携带热休克蛋白与癌胚抗原的融合蛋白编码序列表达盒的载体；(c)使步骤(a)的腺病毒与步骤(b)的载体进行同源重组，以获得重组腺病毒。9.一种制备致敏的树突状细胞的方法，所述方法包括用权利要求1所述的重组腺病毒或用权利要求8所述的方法制备的重组腺病毒转染树突状细胞。10.权利要求1所述的重组腺病毒、权利要求6所述的树突状细胞或用权利要求6所述的树突状细胞诱导的T细胞在制备用于预防或治疗CEA阳性肿瘤的药物组合物中的用途。全文摘要本发明涉及携带融合蛋白基因的重组腺病毒及其制备方法和应用。具体而言，本发明涉及一种携带热休克蛋白与癌胚抗原的融合蛋白的编码序列的重组腺病毒、其制备及应用，该腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，并且在E1和/或E3区位置插入了所述融合蛋白编码序列的表达盒，该表达盒依次包括启动子序列、所述融合蛋白的编码序列以及加尾信号序列，其中所述热休克蛋白选自Hsp70或Hsp70L1。本发明的重组腺病毒可高效介导基因(尤其是抗肿瘤)转移及表达，具有广泛的应用前景。文档编号A61K48/00GK102154223SQ20101010897公开日2011年8月17日申请日期2010年2月11日优先权日2010年2月11日发明者刘书逊,曹雪涛,韩超峰申请人:中国人民解放军第二军医大学