专利名称：3,5-二甲基补骨脂素在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及3，5_ 二甲基补骨脂素在制备抗肿瘤药物中 的应用。
背景技术：
3，5- 二甲基补骨脂素(简称DMFC)，分子式为C13HltlO3是补骨脂素衍生物，其合成 方法见参考文献1，具有式(I)的结构， 迄今为止，没有文献报道3，5- 二甲基补骨脂素在制备抗肿瘤药物中应用。恶性肿 瘤是当今威胁人类身心健康最严重的疾病，死亡率高，目前尚无高效低毒的抗肿瘤药物报 道，因此急需开发这类药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种3，5_ 二甲基补骨脂素在制备抗肿瘤药物中的应用。3，5_二甲基补骨脂素(简称DMFC)，具有式(I)的结构式本发明所制备的3，5_二 甲基补骨脂素药物，可在制备治疗肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、皮肤癌、鼻咽癌、结肠癌等药物 中的应用。本发明的3，5_ 二甲基补骨脂素可以和药学上允许的任意一种辅料或药物赋形剂 制成药物，其制剂可以是药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于液体制剂、颗粒剂、片 剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、滴丸剂或注射剂。本发明提供的药物，其给药形式主要包括口服给药或注射给药。实验证明本发明提供的3，5_ 二甲基补骨脂素，具有体外抑制肿瘤细胞增殖的作 用，经四甲基偶氮唑盐(简称MTT法)检测，48小时处理肿瘤细胞后，对肝癌H印G2的半数 抑制增值率IC50约为8. 46 士0. 28 μ Μ，对乳腺癌MCF-7为33. 5 士4. 95 μ Μ、对子宫颈癌SIHA 为 68. 5 士9. 19 μ Μ，对上皮癌 Α431 为 32. 33 士4. 21 μ Μ、对鼻咽癌 CNE2 为 105. 5 士8. 91 μ Μ、 对结肠癌CaCo2为124. 5 士 7. 62，并且3，5- 二甲基补骨脂素杀死肝癌!fepG2细胞的机理是 诱导其产生凋亡，因此其与药用敷料组合，可在制备治疗恶性肿瘤药物中应用。本发明的优点本发明公开了 3，5-二甲基补骨脂素在制备抗肿瘤药物中的应用， 尤其是抗肝癌、抗乳腺癌、抗宫颈癌、抗上皮癌、抗鼻咽癌及抗结肠癌药物中的应用，为上述 癌症的治疗提供了更多选择，且3，5_ 二甲基补骨脂素对正常细胞的毒性小，有利于临床应 用。
图1为DMFC对肝癌!fepG2细胞的细胞毒性试验。图2为DMFC诱导肝癌!fepG2细胞产生凋亡的DNA梯状条带凝胶电泳图。图3为DMFC诱导肝癌H印G2细胞产生凋亡的ArmexinV-PI双染流式图。图4为Caspase-8和Caspase-9抑制剂逆转DMFC诱导的H印G2细胞凋亡作用。
具体实施例方式以下将结合具体实施例和附图对本发明做进一步阐述，这些实例仅用于说明目 的，而不用于限制本发明范围。
实施例一 3，5-二甲基补骨脂素(DMFC)的合成及鉴定 (1)合成香豆素衍生物1间苯二酚(3.96克，36毫摩尔)、乙酰乙酸乙酯(5. 59克，43毫摩尔)和12M硫酸 (60毫升)的混合物在室温下搅拌15小时，然后将该反应后的混合液倒入冰水(50毫升) 中，沉淀物经过滤和水洗后，用甲醇重结晶得纯的香豆素衍生物1(5. 70克，90%产率)。产 物为白色粉末状固体，熔点182-184°C。(2)合成香豆素衍生物2上述的香豆素衍生物1(5. 46克，31毫摩尔)溶解于干燥的丙酮(75毫升)和二氯 甲烷(75毫升)，加入碳酸钾(8. 55克，62毫摩尔)。搅拌下滴加氯代丙酮(5. 7克，62毫摩 尔)，滴完后混合物搅拌回流24小时。反应结束后，混合液冷却、过滤，用丙酮和二氯甲烷洗 涤滤渣各一次。滤液合并、旋干，用甲醇重结晶或柱层析(石油醚乙酸乙酯=1 1作为 洗脱液，硅胶为固定相)得纯的香豆素衍生物2 (5. 61克，78%产率)。产物为白色粉末状固 体，熔点=147-1490C ο(3)合成补骨脂素衍生物(DMFC) I将上述的香豆素衍生物2 (5. 33克，23毫摩尔)和1. OM氢氧化钠(140毫升)的混 和液在氮气保护下回流24小时。反应混合液冷却后用2. OM盐酸酸化，沉淀物经过滤和水 洗后，用甲醇重结晶或柱层析(石油醚乙酸乙酯=1 2作为洗脱液，硅胶为固定相)得 纯的补骨脂素衍生物I，根据氢核磁共振数据及熔点，对比参考文献[2]即知其为3，5_二甲 基补骨脂素(4. 04克，82%产率)。产物为白色粉末状固体，熔点220-222°C ；氢核磁共振 (300MHz, CDCl3) δ (ppm) :7· 67 (s，1H)，7· 46 (s，1H)，7· 39 (s，1H)，6· 25 (s，1H)，2· 52 (s，3H)，2. 29(s，3H)。实施例二 3，5- 二甲基补骨脂素对人肿瘤细胞增殖抑制活性试验实验方法肝癌细胞H印G2、乳腺癌细胞MCF-7、宫颈癌细胞SIHA、上皮癌A431、鼻咽癌CNE2、 结肠癌CaCo2均购自美国American Type Culture Collection。细胞培养在DMEM培养基 (Invitrogene)，添加 5%小牛血清(Invitrogene)，2mM 谷氨酰胺，37°C，10% CO2 培养箱。四甲基偶氮唑盐(简称MTT法)检测药物对肿瘤细胞增殖的影响选择对数生长 期细胞，以7000/孔的密度接种于96孔板中，置37°C，10%培养箱中培养24小时后加入不 同浓度的药物，每个浓度设复孔6个，分别培养24、48和72小时，吸出孔板中培养液，往每 孔中加入浓度为lmg/ml的MTT 50 μ 1，放入培养箱中继续培养3_4小时，取出加过MTT的96 孔板，每孔加入150 μ 1的DMS0，轻轻震荡孔板30min，待孔底部的结晶物完全溶解后，将孔 板放入酶标仪中测波长在570nm的各孔的光吸收值，记录结果，实验至少重复三次，用IC5tl 软件计算半数增殖抑制浓度ic5。。附图Ia结果显示24、48和72小时的DMFC处理后，肝癌!fepG2细胞的IC50分别 为 16. 33 士 0. 13 μ M for 24h，8· 46 士 0· 28 μ M for 48h and 5. 97 μ M士 0.55。可见 DMFC 对 肝癌细胞H印G2细胞的细胞毒性表现为剂量和时间的依赖性，而对正常肝细胞MIHA的细胞 毒性IC50为40. 75 士 1. 06 μΜ(附图lb)，较肝癌细胞小5倍，表明DMFC对正常细胞的毒性 小，可以在临床上应用。此外，DMFC处理48小时，对乳腺癌MCF-7的IC50为33. 5士4. 95 μ M、对宫颈癌 SIHA 的 IC50 为 68. 5 士9. 19 μ Μ，对上皮癌 Α431 的 IC50 为 32. 33 士4. 21 μ Μ、对鼻咽癌 CNE2 的IC50为105. 5士8. 9 μ Μ、对结肠癌的CaCo2的IC50为124. 5士7. 62表明DMFC可以在制 备治疗上述恶性肿瘤中应用。实施例三3，5- 二甲基补骨脂素诱导肝癌细胞!fepG2产生凋亡(I)DNA梯状条带实验肿瘤细胞H印G2经不同浓度的DMFC处理48h后收集细胞， 加裂解液在 37°C裂解过夜(5mM Tris-HCl，IOOmM EDTA, 1% (w/v) SDS，and 蛋白酶 K)，基因 组DNA用酚/氯仿/异戊醇(25 24 1)抽提，70%酒精_20°C下沉淀，用RNA酶除去RNA 后，加40μ g DNA在1. 2%琼脂糖凝胶上电泳并经凝胶成像仪拍照。细胞凋亡最典型的特征之一，是细胞在接受药物作用后，DNA会被核酸酶在核小体 连接处切断，产生180-200bp或其整数倍大小的DNA碎片，琼脂糖凝胶电泳时呈现有规则 的梯状体条带，这是区分凋亡与坏死的重要标志。附图2结果显示琼脂糖凝胶电泳时呈现 有规则的梯状体条带，DMFC以浓度0、8“11、16“11、32“11和64 μ M处理，可见DMFC可诱导 HepG2产生典型的凋亡条带，并呈剂量依赖性。(2) AnnexinV-PI双染实验约1. 5x10s个对数生长期的肝癌!fepG2细胞与DMFC共 同孵育48h，，胰酶消化收集细胞，PBS清洗一次，加入500 μ 1的ArmexinV-FITC结合缓冲 液，含2. 5 μ 1的AnnexinV-FITC和0. 5 μ 1的PI缓冲液，然后避光孵育15min,用FACSCanto 流式细胞仪(Becton Dickinson)分析结果。细胞凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)会从细胞膜内翻转到细胞膜外， AnnexinV可与其结合，而凋亡细胞的细胞膜仍然保持完整，染料PI不能进入细胞进行染 色，因此通过ArmexinV-PI双染实验，可区分凋亡与坏死细胞。附图3a中!fepG2细胞的5个不同DMFC浓度0、8 μ M、16 μ Μ、32 μ M和64 μ M处理。每张图的右下角百分数都表示该细 胞在对应药物浓度下的凋亡百分率，而右上角百分数则代表相同条件下的死亡百分数。从 图中可以看到，DMFC可以诱导!fepG2细胞产生凋亡，并且这种作用呈现了剂量依赖性。图 3b是图3a的量化分析图，图中清楚地表明随着DMFC浓度从0增至64 μ M,HepG2凋亡百分 率上升至24%。实施例四3，5- 二甲基补骨脂素诱导肝癌细胞!fepG2产生凋亡涉及的信号通路(1) Caspase-8和Caspase-9抑制剂逆转DMFC诱导的!fepG2细胞凋亡作用在细胞凋亡的信号传导过程中，caspase (半胱氨酸水解酶)起着关键性的调节 作用，因此它们的激活是凋亡的重要特征，两个主要的caspase家族成员caspase-8和 caspase-9分别代表了两条凋亡信号通路即死亡受体通路和线粒体通的启动者。约1. 5x10s个对数生长期的IfepG2细胞分别与DMFC/caspase-8抑制剂 (Z-IETD-FMK)或DMFC/caspase-9抑制剂(Z-LEHD-FMK)共同孵育48小时，胰酶消化 收集细胞，PBS清洗一次，加入500 μ 1的Annexin V-FITC结合缓冲液，含2. 5 μ 1的 AnnexinV-FITC和0. 5 μ 1的PI缓冲液，然后避光孵育15min,用FACSCanto流式细胞仪 (Becton Dickinson)分析结果。附图4a中，H印G2细胞的对照、DMFC 32 μ M单独处理、DMFC加caspase-8抑制剂 (81)组合处理以及DMFC加caspase-9抑制剂(91)组合处理。每张图的右下角百分数都表 示该细胞在对应处理下的凋亡百分率。可以看出，DMFC 32 μ M作用于H印G2诱导细胞产生 凋亡16. 19%，而添加caspase-8和-9抑制剂，可以逆转这种凋亡的诱导，凋亡细胞百分比 相应下调至8. 67%，9. 8%，附图4b是图4a的量化分析图。可见，DMFC诱导!fepG2细胞产生凋亡确实涉及了两条不同的通路，即细胞内(死 亡受体)和细胞外(线粒体)通路。综上实施例所述，本发明提供的3，5_ 二甲基补骨脂素(DMFC)对肝癌H印G2、乳腺 癌MCF-7、宫颈癌SIHA，上皮癌A431、鼻咽癌CNE2、结肠癌CaCo2均具有强烈的增殖抑制效 果，DMFC杀死肝癌H印G2细胞的机理是通过细胞内(死亡受体)和细胞外(线粒体)两条 通路诱导肿瘤细胞凋亡，且3，5- 二甲基补骨脂素对正常细胞的毒性小，有利于临床应用。 目前临床上缺乏高效低毒的药物，因此3，5-二甲基补骨脂素具有很好的制备抗肿瘤药物 的应用前景。本发明涉及的部分参考文献1. 0. Gia, S. M. Magno, H. Gonazalez-Diaz, E. Quezada, L. Santana, E. Uniarte, L. D. Via, Bioorg. Med. Chem. 2005，13，809.2. Q. Shen, Q. Peng, J. Shao, X. Liu, Z. Huang, X. Pu, L. Ma, Y. M. Li, A. S. C. Chan, L. Gu, Synthesis and biological evaluation of functionalized coumarins asacetyIcholinesterase inhibitors, European Journal of Medicinal Chemistry, 2005,40(12)，1307-1315.
权利要求
一种3，5-二甲基补骨脂素在制备抗肿瘤药物中应用，所述化合物具有式(I)的结构，FSA00000083870900011.tif
2.根据权利要求1所述的一种3，5-二甲基补骨脂素的应用，其特征在于，在制备抗肝 癌药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的一种3，5-二甲基补骨脂素的应用，其特征在于，在制备抗子 宫颈癌药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的一种3，5-二甲基补骨脂素的应用，其特征在于，在制备抗乳 腺癌药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的一种3，5-二甲基补骨脂素的应用，其特征在于，在制备抗皮 肤癌药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的一种3，5-二甲基补骨脂素的应用，其特征在于，在制备抗鼻 咽癌药物中的应用。
7.根据权利要求1所述的一种3，5-二甲基补骨脂素的应用，其特征在于，在制备抗结 肠癌药物中的应用。
全文摘要
本发明属制药领域，涉及3，5-二甲基补骨脂素在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供的3，5-二甲基补骨脂素的分子式为C13H10O3，分子量为214.22，具有广谱抗肿瘤活性，体外对多种人肿瘤细胞均有强烈的抑制效应，其抑制肝癌细胞HepG2增殖的机理是诱导癌细胞凋亡。因此其与药用敷料组合，可在制备抗肿瘤活性药物中应用，尤其是抗肝癌、抗乳腺癌、抗宫颈癌、抗皮肤癌、抗鼻咽癌及抗结肠癌药物中的应用。本发明为上述癌症的治疗提供了更多选择，且3，5-二甲基补骨脂素对正常细胞的毒性小，有利于临床应用。
文档编号A61P35/00GK101879159SQ20101014672
公开日2010年11月10日 申请日期2010年4月15日 优先权日2010年4月15日
发明者冯国培, 刘非燕, 吴平, 孙建国, 郭添德, 黄志真 申请人:浙江大学