专利名称：一种家蚕生物反应器制备人白介素28a的方法及其制药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种利用家蚕生物反应器制备人白介素28A 的方法及其制药用途。
背景技术：
人白细胞介素(interleukin)28A(hIL-28A)是一种新型的干扰素λ (IFN-λ )，与 I类干扰素(IFN)的功能类似，具有抗病毒、抗增殖及免疫调节等活性。人自然白介素是通 过分别刺激淋巴母细胞和人体白细胞，然后提纯制备而得。目前市场供应的只有由类淋巴 母细胞产生的干扰素，是天然的多亚型的混合物。临床用的主要是重组制剂，剂型主要有粉 剂和水剂，无口服剂型，使用均为注射给药。家香杆状病毒表达载体系统(Bombyx mori baculovirus expressionvector system)是真核表达系统，已有许多基因在该系统中成功表达。用该系统在家蚕中表达外源 基因，表达水平高、产物生物活性好。目前，未见利用家蚕杆状病毒表达载体系统表达人白细胞介素(interleukin)28A 的报道，以及关于人白细胞介素(interleUkin)28A 口服制剂的报道。
发明内容
本发明目的是提供一种利用家蚕生物反应器制备人白介素28A的方法。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种利用家蚕生物反应器制备人白 介素28A的方法，通过基因工程方法获得重组的带有人白介素28A(hIL-28A)基因的家蚕 Bombyx mori杆状病毒，并用该病毒接种家蚕幼虫或蛹，使人白介素28A在家蚕幼虫或蛹中 获得高效表达。将高效表达人白介素28A的幼虫或蚕蛹制备成口服制剂，经动物试验表明 具有显著的抗肿瘤作用。上述技术方案中，所述重组的带有人白介素28A(hIL_28A)基因的家蚕Bombyx mori重组杆状病毒的制备方法为(1)根据 GenBank 已公开的 hIL_28A 的 cDNA 序列(GenBank 登录号BC113583)， 合成hIL-28A基因的编码序列，克隆进T-载体，获pUC-hIL-28A质粒；(2)用BamH I/EcoR I双酶切消化pUC_hIL_28A质粒回收hIL_28A基因片段， 用BamH I/EcoR I双酶切消化供体质粒pFastBac-Dual回收pFastBac-Dual片段，将 hIL-28A基因片段插入到pFastBac-Dual的BamH I和EcoR I之间，将hIL_28A克隆进 pFastBac-Dual载体中的杆状病毒多角体基因启动子下游获得pFastBac-Dual-hIL_28A重 组质粒；其中，质粒PFastBac-Dual是美国Invitrogen公司的产品，其产品名为 PFASTBAC-DUAL EXP VECTOR ；pFastBac-Dual 载体属于 Bac-to-Bac(Bacteria to Baculovirus)表达系统，
(3)将pFastBac-Dual-hIL-28A重组质粒转化大肠杆菌BmDHlOBac感受态细胞， 涂布于含四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG、X-gal的LB琼脂培养平板上，挑取白色菌落培 养，提取重组 Bacmid 基因组 Bacmid-hIL_28A DNA ；(4)将Bacmid-hIL-28A DNA由脂质体介导转染家蚕培养细胞BmN，培养细胞后取 上清，获得重组杆状病毒BmNPV-hIL-28A。上述技术方案中，采用所述家蚕Bombyx mori重组杆状病毒接种家蚕幼虫或蛹的 方法为将重组杆状病毒BmNPV-hIL-28A感染家蚕培养细胞BmN进行扩增，采用扩增后的重 组杆状病毒BmNPV-hIL-28A接种至五龄家蚕幼虫或蛹。进一步地，取5天后家蚕或蛹的血 淋巴，分析检测hIL-28A表达水平，结果显示每毫升血淋巴中重组hIL-28A的量达33 μ g。本发明的另一目的为提供一种含有人白介素28A药物的制备方法，为实现该目 的，采用的技术方案为，一种含有人白介素28A药物的制备方法，采用上述技术方案获得的 感染重组家蚕杆状病毒的家蚕幼虫或蛹经冷冻干燥后制成口服药物制剂；经动物试验表明 具有显著的抗肿瘤作用。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1.由于本发明中采用pFastBac-Dual载体进行hIL_28A基因的转染，相对于其 他载体而言，大大简化了筛选过程pFastBac_Dual载体属于Bac-to-Bac (Bacteria to Baculovirus)表达系统，与传统的 BEVS (Baculovirus expressionvector system)相比具 有三个优点(1)缩短了重组病毒构建所需的时间。传统重组病毒构建，方法技术娴熟的人 员也需要6-9周时间甚至更长的时间。而构建Bac-to-Bac系统7-9天就可以成功构建； (2)可根据菌斑蓝、白颜色进行筛选，不需要空斑分析来纯化重组病毒，转座和纯化率高，纯 化率达100% ； (3)缩短了重组病毒的鉴定和纯化的时间；感染宿主细胞或幼虫即可获得大 量的外源基因表达产物。2.由于本发明用家蚕生物反应器生产重组人白介素28A(hIL_28A)，家蚕可食可 药，表达hIL-28A的家蚕幼虫和蛹可直接冷冻干燥，表达产物无需纯化，可以直接作为口服 药物使用，因此具有制备工艺简单、成本低，口服药物方便使用等优点，同时可以减少注射 剂型的一些常有发热、疲劳不适、食欲不佳、白细胞减少及血压波动等的副作用。3.本发明所得人白介素28A(hIL_28A) 口服抗肿瘤药物经动物试验证明具有明确 疗效，而且人白介素28A(hIL-28A) 口服抗肿瘤是首创。
图1为实施例一中重组病毒Bacmid-EGFP-hIL_28A的PCR鉴定图，其中，M.标准 DNA分子质量；1.重组病毒的PCR产物(pUC/M13引物)；2.重组病毒的PCR产物(M13-1和 IL-28A2引物)；3.重组病毒的PCR产物(M13-2和IL-28A1引物)；4.野生病毒的PCR产 物(pUC/M13 引物)；图2为实施例一中蚕蛹血淋巴的ELISA分析图，其中1_6分别为感染重组杆状病 毒1-6天的家蚕蛹； 图3为实施例四中口服含有hIL-28A的蚕蛹粉对A549移植瘤PCNA和VEGF表达水 平的影响结果图，其中ABC分别为A549的阴性对照组、药物组和阳性对照组的PCNA表达； DEF分别为A549的阴性对照组、药物组和阳性对照组的VEGF表达；
图4为实施例五中口服含有hIL-28A的蚕蛹粉对HL60移植瘤PCNA和VEGF表达水 平的影响结果图，其中ABC分别为HL60的阴性对照组、药物组和阳性对照组的PCNA表达； DEF分别为HL60的阴性对照组、药物组和阳性对照组的VEGF表达。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述
实施例一表达hIL_28A家蚕幼虫的制备1.根据 GenBank 已公开的 hIL_28A 的 cDNA 序列(GenBank 登录号BC113583)，合 成hIL-28A基因的编码序列，克隆进T-载体，获pUC-hIL-28A质粒。2.设计并合成引物对 IL-28A-1 (TAGGATCCATGAAACTAGACATGAC,下划线为 BamH I 位点)和 IL-28A-2 (TTGAATTCAGACACACAGGTCCCCACTG,下划线为 EcoR I 位点)。以 pUC-hIL-28A质粒为模板，用BamH I/EcoR I双酶切，回收hIL_28A片段，与用相同酶切的供 体质粒 pFastBac-Dual (invitrogen 公司)连接获得 pFastBac-Dual_hIL28A 质粒，该质粒 转化大肠杆菌BmDHlOBac感受态细胞，涂布于含四环素(10 μ g/ml)、卡那霉素(50 μ g/ml)、 庆大霉素O μ g/ml)、IPTG (40 μ g/ml)、X_gal (100 μ g/ml)的LB琼脂培养平板上。挑取白色 菌落培养，提取重组Bacmid基因组DNA，分别用pUC/M13引物(M13-1 :GTTTTCCCAGTCACGAC ； M13-2 :CAGGAAACAGCTATGAC)和 IL-28A 引物(IL-28A-1 和 IL-28A-2)对重组 Bacmid 进行 组合PCR鉴定。鉴定结果参见图1 用M13引物可从重组Bacmid DNA中扩增出3. 92kb的目的条 带；IL-28A-1和pUC/M13-2引物扩增出的PCR产物的大小约为1150bp ；M13-1和IL-28A-2 引物扩增出的PCR产物的大小约为2776bp，各特异性产物的分子量与预计的大小相符，说 明IL-28A基因已按要求重组进Bacmid DNA，所获得的重组Bacmid命名为Bacmid-hIL_28A。3. Bacmid-hIL-28A DNA (2 μ g)加入到 98 μ 1TC-100 (无胎牛血清)中混勻，另取 10 μ 1脂质体加入到90 μ 1 TC-100 (无胎牛血清)中混勻，再将前者滴加到后者中混勻放置 30分钟后滴加到800 μ 1的TC-100 (无胎牛血清，GIBC0BRL公司)中混勻，转染BmN细胞。 27°C培养3 4天，收取病毒感染的培养细胞上清，获重组病毒BmNPV-hIL-28A。4.用昆虫针醮取BmNPV-hIL-28A感染BmN培养细胞4天的培养上清，接种5龄 起蚕，25°C左右正常饲养，5天后，取少量蚕血。用IL-28A ELISA试剂盒(USCN and LIFE TECHNOLOGY公司)测定hIL_28A表达水平，结果参见图2每毫升血淋巴中重组hIL_28A的 量达33 μ g。收集接种病毒5天后的家蚕，-20°C保存。实施例二 表达hIL_28A家蚕蛹的制备1.采用实施例一步骤3获得的重组病毒BmNPV-hIL-28A，感染BmN培养细胞，4天 后收集细胞培养上清。2.用昆虫针醮取步骤1的细胞培养上清，穿刺接种复眼着色前的家蚕蛹，25°C左 右保护5天后，取少量蚕血。用IL-28A ELISA试剂盒(USCN and LIFETECHN0L0GY公司) 测定hIL-28A表达水平，每毫升血淋巴中重组hIL-28A的量达33 μ g。收集接种病毒5天后 的家蚕蛹，_20°C保存。实施例三表达hIL_28A家蚕蛹冻干粉的制备1.取实施例二步骤2的蚕蛹5kg，冰浴勻浆，加0. 7%的生理盐水20kg，混勻，用纱布过滤去除粗杂质。2.滤液冷冻干燥成粉剂原料，ELISA测定表明每克冷冻干燥粉中含 8. 5mghIL-28A。实施例四裸鼠口服含有人白介素28A家蚕蛹粉对A549移植瘤的抑制能力1. RPMI1640培养液培养A549细胞至生长状态良好，取0. 2ml细胞悬液(细胞浓度 为5X106/ml)，皮 下接种于BALB/C-nu 6_8周龄裸鼠(体重20士2g，苏州贝尔达生物医药 科技有限公司)的右腋下，按照《肿瘤治疗增敏药》(上海科学技术文献出版社，2002)建立 裸鼠皮下移植瘤模型。共接种18只裸鼠。2.接种3天后，裸鼠随机分为3组，每组6只即正常对照组(模型组)，含 hIL-28A蛹粉组和环磷酰胺(购自中国江苏恒瑞医药股份有限公司；批准文号国家医药准 确H32020857)阳性对照组。3.正常对照组每天给裸鼠灌胃正常蛹粉量为1500mg/kg;含hIL_28A蛹粉用 1XPBS(PH7. 4)溶解，每天给裸鼠灌胃相当于IL-28A 12. 7mg/kg ；环磷酰胺每天给裸鼠灌 胃量为25mg/kg ；连续灌胃30天后检测抗肿瘤相关的指标，结果参见图3 含有人白介素 28A家蚕蛹粉口服对A549移植瘤的抑制率为40. 98%，肿瘤组织中的PCNA (增殖细胞核抗 原)和VEGF(血管内皮生长因子)的阳性细胞率分别为27. 6%和17.4%，而环磷酰胺组分 别为38. 4%和42. 6%，正常对照组分别为44. 6%和59. 3%。口服含有人白介素28A家蚕 蛹粉组、环磷酰胺组和正常对照组的细胞凋亡程度分别为35%、27%，17%，表明口服含有 人白介素28A家蚕蛹粉对A549移植瘤的增殖有明确的抑制作用。实施例五裸鼠口服含有人白介素28A家蚕蛹粉对HL60移植瘤的抑制能力1. RPMI1640培养液培养HL60细胞至生长状态良好，取0. 2ml细胞悬液(细胞浓度 为5X106/ml)，皮下接种于BALB/C-nu 6_8周龄裸鼠(体重20士2g，苏州贝尔达生物医药 科技有限公司)的右腋下，按照《肿瘤治疗增敏药》(上海科学技术文献出版社，2002)建立 裸鼠皮下移植瘤模型。共接种18只裸鼠。2.接种3天后，裸鼠随机分为3组，每组6只即正常对照组(模型组)，含 hIL-28A蛹粉组和环磷酰胺(购自中国江苏恒瑞医药股份有限公司；批准文号国家医药准 确H32020857)阳性对照组。3.正常对照组每天给裸鼠灌胃正常蛹粉量为1500mg/kg;含hIL_28A蛹粉用 1XPBS(PH7. 4)溶解，每天给裸鼠灌胃相当于IL-28A 12. 7mg/kg ；环磷酰胺每天给裸鼠灌 胃量为25mg/kg ；连续灌胃30天后检测抗肿瘤相关的指标，结果参见图4 含有人白介素 28A家蚕蛹粉口服对HL60移植瘤的抑制率为44. 6 %，肿瘤组织中的PCNA (增殖细胞核抗 原)和VEGF(血管内皮生长因子)的阳性细胞率分别为42. 8%和39.2%，而环磷酰胺组分 别为51. 4%和68. 4%，正常对照组分别为67%和70. 3%; 口服含有人白介素28A家蚕蛹粉 组、环磷酰胺组和正常对照组的细胞凋亡程度分别为58%、46%，23%，表明口服含有人白 介素28A家蚕蛹粉对HL60移植瘤的增殖有明确的抑制作用。
权利要求
一种家蚕生物反应器制备人白介素28A的方法，其特征在于，通过基因工程方法获得重组的带人白介素28A基因的家蚕Bombyx mori重组杆状病毒，并用该病毒接种家蚕幼虫或蛹，使人白介素28A在家蚕幼虫或蛹中获得到高效表达。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组的带人白介素28A基因的家 蚕Bombyx mori重组杆状病毒的制备方法为(1)根据GenBank已公开的hIL_28A的cDNA序列(GenBank登录号:BC113583)，合成 hIL-28A基因的编码序列，克隆进T-载体，获pUC-hIL-28A质粒；(2)用BamHI/EcoR I双酶切消化pUC_hIL_28A质粒回收hIL_28A基因片段，用BamH I/EcoR I双酶切消化供体质粒pFastBac-Dual回收pFastBac-Dual片段，将hIL_28A基因 片段插入到 pFastBac-Dual 的 BamH I 和 EcoR I 之间，将 hIL_28A 克隆进 pFastBac-Dual 载体中的杆状病毒多角体基因启动子下游获得pFastBac-Dual-hIL-28A重组质粒；(3)将pFastBac-Dual-hIL-28A重组质粒转化大肠杆菌BmDHlOBac感受态细胞，涂布于 含四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG、X-gal的LB琼脂培养平板上，挑取白色菌落培养，提 取重组 Bacmid 基因组 Bacmid-hIL_28A DNA ；(4)将Bacmid-hIL-28ADNA由脂质体介导转染家蚕培养细胞BmN，培养细胞后取上清， 获得重组杆状病毒BmNPV-hIL-28A。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用所述家蚕Bombyxmori重组杆状 病毒接种家蚕幼虫或蛹的方法为将重组杆状病毒BmNPV-hIL-28A感染家蚕培养细胞BmN 进行扩增，采用扩增后的重组杆状病毒BmNPV-hIL-28A接种至五龄家蚕幼虫或蛹。
4.一种含有人白介素28A的药物的制备方法，其特征在于，采用权利要求1所述制备方 法所得感染重组杆状病毒的家蚕幼虫或蛹，经冷冻干燥后制成口服药物制剂。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种家蚕生物反应器制备带有人白介素28A的方法，通过基因工程方法获得重组的带人白介素28A(hIL-28A)基因的家蚕Bombyx mori重组杆状病毒，并用该病毒接种家蚕幼虫或蛹，使人白介素28A在家蚕幼虫或蛹中获得高效表达。由于本发明用家蚕生物反应器生产重组人白介素28A(hIL-28A)，家蚕可食可药，表达hIL-28A的家蚕幼虫和蛹可直接冷冻干燥，表达产物无需纯化，可以直接作为口服药物使用，因此具有制备工艺简单、成本低，口服药物方便使用等优点，同时可以减少注射剂型的一些副作用。
文档编号A61P35/00GK101845442SQ20101016109
公开日2010年9月29日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者曹广力, 薛仁宇, 贡成良, 郑小坚, 陆叶 申请人:苏州大学