专利名称：重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白及其在神经细胞保护方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种融合有TAT蛋白转导结构域和人源性 蛋氨酸亚砜还原酶hMsrA以及硫氧还原蛋白Trx所形成的融合蛋白(重组Trx-TAT-hMsrA 融合蛋白)，及其制备方法和在神经细胞保护方面的应用。
背景技术：
大量现代神经科学研究表明，氧自由基介导的病理损伤参与多种神经系统重大疾 病的发生和发展。脑部丰富的脂质含量和相对缺乏的抗氧化酶水平使其在氧化应激中更易 受损。多种因素(如异常折叠蛋白积聚、缺血再灌注损伤等)通过线粒体有氧呼吸等途径诱 导神经元产生更多的活性氧(R0S)，如02_.、Η202、0Η·和1O2,而衰老过程中常伴有ROS清除系 统(如谷胱甘肽还原系统、超氧化物歧化酶等)的减弱，从而导致氧自由基或氧化产物的异 常积累，引发神经系统重大疾病的发生。蛋白质是大多数细胞生理活动的物质基础，氧自由 基对于功能性蛋白如离子通道、酶以及受体等的氧化修饰，往往会导致蛋白质功能的失活、 异常甚至蛋白质的降解加剧，从而介导细胞生理功能的紊乱。蛋白质分子中最易受到攻击 的是含硫氨基酸残基，包括半胱氨酸残基(cysteine，Cys)和蛋氨酸(methionine，Met)残 基，Cys的氧化产物包括次磺酸基二硫化物和磺基，通常以二硫化物为主。体内存在硫氧还 原蛋白等还原性物质或体外存在DTT时，二硫键易被还原成巯基。半胱氨酸残基氧化形成 二硫键，会影响包括L型钙离子通道、谷氨酸受体等神经系统重要蛋白的功能，申请者所在 实验室的大量研究表明，使用巯基还原性药物逆转还原这种变化，可以治疗衰老相关的突 触功能损伤。蛋氨酸残基氧化是蛋白质功能氧化性损伤另一个关键诱导因素。在弱氧化剂 作用下，蛋氨酸易被氧化成MetO，在更强氧化剂如Ch-T的作用下，可进一步氧化成Met02。 MetO可由蛋氨酸还原酶还原成Met，但Met02非常稳定，生理条件下不能被还原。从结构上 看，正常蛋氨酸侧链很长，有弹性，无极性。氧化成MetO后，侧链变得僵硬，极性变大，从而 使整个蛋白质功能改变。国外大量实验室的研究表明，关键蛋白质的蛋氨酸残基氧化，和多 种神经系统重大疾病的发生发展密切相关。申请者所在实验室的大量研究表明，蛋白质蛋 氨酸残基的氧化修饰和离子通道功能异常、突触可塑性损伤以及细胞钙稳态失衡都有着密 切关系。因此，调节蛋白质蛋氨酸残基的氧化，可能成为治疗神经系统重大疾病的新策略。蛋氨酸亚砜还原酶A (methionine sulfoxide reductase A, MsrA)是目前发现的 可在生物体内还原逆转蛋白质蛋氨酸残基氧化结构变化和功能损伤的主要抗氧化酶系统。 MsrA在很多生物体中，从进化上非常古老的古细菌大肠杆菌到植物和哺乳动物中均有发 现，其抗氧化作用对于生物体的生存具有特别重要的意义。大量研究表明，MsrA是一种存 在于生物体中的抗氧化修复因子。过表达MsrA基因可以显著减轻氧化应激引起的人T细 胞、人Lens细胞、PC12细胞和WI-38SV40等细胞的损伤和凋亡。有研究认为，MsrA与衰老 及哺乳动物寿命密切相关。因此，调节MsrA的基因表达，为治疗多种氧化相关的病理疾病 提供了全新的视角和技术手段。而硫氧还原蛋白(Trx)是一种低分子量、进化上高度保守
3的有还原二硫键氧化产物活性的蛋白质，主要功能是调节细胞胞内氧化还原平衡，参与氧 应激诱导的细胞凋亡。它既是MsrA系统在体内发挥功能最重要的伴侣分子，同时也是还原 体内半胱氨酸残基氧化最重要的功能分子，我们设想，通过基因重组的方法，制备一种MsrA 和Trx的融合蛋白。在神经系统重大疾病中，许多疾病和氧化损伤及细胞凋亡密切相关，包 括帕金森综合症、缺血性脑损伤、老年痴呆症、血管性痴呆等。应用这种融合蛋白，在这些疾 病的治疗中可能起到重要的作用。蛋氨酸亚砜还原酶A (MsrA)和硫氧还原蛋白(Trx)从本质上讲都是功能性蛋白， 可以按照基因工程的方法进行制备。但是，蛋白质类生物技术药物很难进入细胞，外周给药 也很难透过血脑屏障。为了克服蛋白质药物的这些成药性差的缺点，研制能够用于中枢神 经系统疾病的新型生物技术药物，我们设想通过基因重组改造作为功能性蛋白的MsrA和 Trx0 HIV-I病毒是一种具有很强穿透细胞和进入中枢神经系统能力的蛋白质颗粒，其进入 细胞和进入中枢神经系统的关键结构域是其Tat蛋白第49-57位氨基酸。这种Tat蛋白来 源的穿膜结构域小肽，在运载蛋白质进入细胞方面已经表现出极强的应用前景。我们设想 通过基因工程方法，将Tat蛋白来源的穿膜结构域小肽、人源性蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白以 及硫氧还原蛋白构建成融合蛋白，从而将来用于制备治疗神经系统重大疾病相关药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种融合蛋白，使其具有神经细胞保护作用。本发明的另一个任务是提供该融合蛋白的制备方法和应用。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种融合蛋白由硫氧还原蛋白Trx和TAT蛋白转导结构域以及人源 性蛋氨酸亚砜还原酶hMsrA组成，本发明专利申请将该融合蛋白称为重组Trx-TAT-hMsrA 融合蛋白。本发明提供的重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白，一共416个氨基酸，其中1-109位氨 基酸是Trx蛋白，110-165位氨基酸是连接区，166-179位氨基酸是TAT蛋白，180-416位氨 基酸是hMsrA蛋白。本发明提供的重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白有如SEQ ID NO :1所示的 氨基酸序列，分子量为45KD。重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白包含三个功能区，每个功能区的功能如下Trx主要 功能是调节细胞胞内氧化还原平衡；TAT蛋白是一个富含碱性氨基酸的多肽片段，主要功 能是引导重组Trx-Tat-hMsrA融合蛋白穿透细胞膜；人源性蛋氨酸亚砜还原酶hMsrA是体 内唯一可以还原蛋白质蛋氨酸残基氧化的还原酶，主要功能是修复蛋白质氧化性损伤。由 于许多疾病和氧化损伤密切相关，包括帕金森综合症、缺血性脑损伤、老年痴呆症、血管性 痴呆等，本发明重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白可用于这些疾病的治疗。实验资料一本发明专利申请实施例1提供了本发明重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白的制备方 法。实验资料一提供本发明重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白鉴定资料。1.重组 Trx-TAT-hMsrA 融合蛋白的 Western blot 鉴定融合蛋白做Western blot检测鉴定试验。电泳条件和实施例二保持一致。按表 三配制转移缓冲液。按表四配制TBST缓冲液。电泳结束后，根据蛋白market切出目的蛋白位置(45KD)左右的胶，与NC膜、滤纸一起浸入转膜液中平衡至少15分钟。按着负极，海 绵，滤纸，胶，NC膜，滤纸，海绵，正极的顺序将其放入转膜盒中，恒流湿转法将蛋白从胶转移 至NC膜上。转膜结束后，将NC膜浸没在封闭液中(5%去脂奶粉溶于TBST)中封闭1小时， 将NC膜置于适当浓度的一抗(1%去脂奶粉溶于TBST配制)中，4°C振荡孵育过夜。TBST 充分漂洗后，加入HRP标记的二抗，室温下振荡孵育1小时.TBST充分漂洗后，ECL荧光剂， 5分钟，根据荧光强度，适当曝光压片显影.胶片扫描后，用Image J软件分析显影的密度。
表三
权利要求
一种重组Trx Tat hMsrA融合蛋白，其特征在于序列如SEQ ID N01所示。
2.编码权利要求1所述的重组Trx-Tat-hMsrA融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于 序列如SEQ ID NO :2所示。
3.根据权利要求1所述的重组Trx-Tat-hMsrA融合蛋白，其特征在于重组 Trx-Tat-hMsrA融合蛋白中1_109位氨基酸是Trx蛋白，110-165位氨基酸是连接肽， 166-179位氨基酸是TAT蛋白，180-416位氨基酸是hMsrA蛋白。
4.权利要求1或3所述的重组Trx-Tat-hMsrA融合蛋白在制备治疗神经系统重大疾病 药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的重组Trx-Tat-hMsrA融合蛋白在制备治疗神经系统重大疾 病药物中的应用，其特征在于，所述的神经系统重大疾病是帕金森综合症、阿尔茨海默综合 症、缺血性脑损伤或血管性痴呆。
全文摘要
本发明公开了一种融合蛋白Trx-TAT-hMsrA的制备方法及其在神经细胞保护方面的应用。融合蛋白Trx-TAT-hMsrA含有TAT蛋白转导结构域和硫氧还原蛋白Trx，以及人源性蛋氨酸亚砜还原酶hMsrA。本发明的融合蛋白具有还原功能性蛋白蛋氨酸残基氧化、治疗氧化应激损伤、减缓帕金森症相关神经元病变、防治钙离子超载等多种生物学效应，同时其具有很好的透过细胞膜进入神经细胞的能力，是一种成药性好的新型生物技术候选药物。
文档编号A61K38/44GK101974089SQ201010197729
公开日2011年2月16日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者吴鹏飞, 张醉, 曾建华, 杨远坚, 王芳, 陈建国 申请人:华中科技大学