专利名称：阴地蕨提取物在制备抗肿瘤转移药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药提取物的新用途，具体涉及阴地蕨提取物在制备抗肿瘤转移药物 中的应用。
背景技术：
国际癌症研究中心(IARC)最新报告，全球癌症病人数以年均3% -5%的速度递 增，癌症已成为全球最大的公共卫生问题。世界卫生组织(WHO)预计2007年到2030年期 间，癌症新发病例数将增加37% (由1130万例增至1550万例)，死亡人数增加45% (由 790万人增至1150万人)。由此可见，恶性肿瘤是目前威胁人类健康的重要疾病，其侵袭和 转移的特性是导致临床上大多数肿瘤患者死亡的主要因素。因此，研究出安全、有效的抗肿 瘤转移新药具有重要的实践意义。癌症严重威胁人类健康，是世界各国面临的重要社会问 题之一。近年来，中药或天然药物抗肿瘤作用的研究已成为新热点。王光凤等采用多种肿瘤模型，研究橘皮中提取的黄酮化合物川陈皮素的抗肿瘤作 用。结果显示，川陈皮素8 32mg/kg小鼠黑色素瘤B16的抑瘤率为42. 24% 65. 95%, 对小鼠Lewis肺癌的抑瘤率为38. 84% 59. 09%;对小鼠S180肉瘤的抑瘤率为36. 02% 45. 98%。川陈皮素与小剂量的紫杉醇、丝裂霉素、52氟尿嘧啶、顺钼和阿霉素联用时，表现 明显的协同效应。川陈皮素对小鼠Lewis肺癌腋皮下接种肺转移的抑制率为33. 63% 38. 94% ；对小鼠Colon26结肠癌腹腔接种腹膜转移的抑制率为37. 74% 43. 40%。(王 光凤，王小晨，肖璘，等.柑橘黄酮川陈皮素的抗肿瘤作用研究，中草药，2007,38(11) 1694-1697)，但以上研究都只能对某种肿瘤细胞发挥作用，研究还不够深入。
发明内容
发明目的本发明的目的在于提供阴地蕨提取物的新用途，即在制药领域中的新 用途。技术方案本发明涉及阴地蕨提取物在制备抗肿瘤转移药物中的应用。为了更好地理解本发明的实质，下面将阴地蕨提取物的药理试验及实验结果来说 明其在制药领域中的新用途。以下是阴地蕨提取物抗肿瘤转移作用的研究，实验方法及结果如下一、阴地蕨提取物的制备取处方量的阴地蕨药材，加入8倍药材重量的体积浓度为70%乙醇进行加热回 流，回流0. 5小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至相对密度1. 10 1. 25(90 95°C )， 的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。二、阴地蕨提取物对自发性B16F10黑色素瘤转移模型的影响1.实验材料1.1实验动物与细胞
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清洁级C57BL/6小鼠(雌性，6_8周龄，16_20g)，上海斯莱克实验动物有限责任公 司，许可证号SCXK (沪)2007-0005 ；B16F10黑色素瘤细胞株。1.2实验药物阴地蕨提取物，福建省立医院，批号090602。1.3实验试剂DMEM(美国GIBC0公司批号1340114)，PBS(实验室自制)，小牛血清(天津 市洋生物制品科技有限公司批号:QWTC0701), Trypsin(AMRESC0公司批号=2009/08) EDTA(AMRESC0公司批号0105)，甲醛(上海久亿化学试剂有限公司批号20070610)，生理 盐水(上海华源长富药业有限公司批号070405045)，NaHC03(南京化学试剂有限公司批 号050480039)，液体石蜡(上海久亿化学试剂有限公司批号20040701)。1.4实验器材
莱卡倒置荧光显微镜(德国莱卡公司型号DM1L)，精密移液器(法国吉尔森公 司型号P2)，全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号MLS-3020)，超净工作台(苏净集 团安泰公司制造型号SW-CJ-ZFD)，超低温冰箱(美国纽艾尔公司型号Nu-6511)，C02培 养箱(FORMA型号3111)，纯水仪(美国Spring公司型号S/N 020579)，电子天平(德 国赛多利斯有限公司型号BT323S)，台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号 DHG9123A)，冰箱(西门子公司型号KG18V21TI)，液氮罐(CBS型号:2001)，离心机(上海安 亭科学仪器厂型号KA-1000)，PH计(HANNA公司型号HI_221)，注射器。2.实验方法2. 1制备B16F10细胞悬液常规培养B16F10肿瘤细胞，实验前4-5天，按1 10细胞传代于细胞培养瓶中， 以免细胞生长过度而出现不完全融合。每个培养瓶大约含6-8 X 106细胞，取对数生长期的 细胞，弃去培养液，用PBS洗净，加入lmL 0. 25%胰酶+0. 02% EDTA消化液，放入细胞培养 箱中，l-3min后，轻敲培养瓶使细胞脱落。加10mL DMEM，用移液管吹打细胞，获得单细胞悬 液，转入50mL聚丙烯离心管。离心细胞(1200rpmX10min)，然后用PBS洗两遍。用苔盼蓝 计数细胞，调整细胞浓度为lX107/mL。2. 3复制B16F10自发性肿瘤转移模型每只C57BL/6小鼠左后肢足垫皮下注射含5 X 105个B16F10细胞的悬液0. 05mL, 这些小鼠每五天称一次体重。于接种后第八天按照左足垫上原发瘤的大小将小鼠随机分为 四组模型组对照组(生理盐水组)、阴地蕨提取物低剂量组(2g/kg小鼠体重)、阴地蕨提 取物中剂量组(4mg/kg小鼠体重)、阴地蕨提取物高剂量组(6g/kg小鼠体重)，每组动物数 为10只。从接种的第九天开始各组灌胃给予相应剂量的药物，模型组给予相应的生理盐 水，每日一次，直至处死动物，采集标本。在接种后第23天，麻醉小鼠，截除荷瘤下肢，10% PBS-福尔马林固定原发瘤组织，称取原发肿瘤重量以及用直尺测量原发瘤的长轴(L1)和 纵轴(L2)，按照以下公式计算原发瘤的体积0.5236XL1X(L2)2。切除原发灶后22天处 死小鼠，取出肺，避免镊子触及脏器表面损伤组织，用PBS洗净组织。10% PBS-福尔马林固 定肺组织，称取肺重，拍照并且在解剖显微镜下计算肺肿瘤结节数。3.实验结果3. 1阴地蕨提取物对B16F10黑色素瘤自发性转移模型肺转移的影响
实验结果采用Excel统计软件学生t检验进行检验，由实验数据可以看出，阴地蕨 提取物各剂量组与对照组相比对黑色素瘤自发性转移模型的肺转移结节数均有抑制作用， 且呈现剂量相关性阴地蕨提取物2g/kg剂量组(P < 0. 05)、阴地蕨提取物4g/kg剂量组 (P < 0. 01)、阴地蕨提取物6g/kg剂量组(P < 0. 01)。对于肺重的影响，阴地蕨提取物6g/ kg剂量组的肿瘤重量明显低于对照组的肺重(P < 0. 01)，其他两组无明显作用。3. 2阴地蕨提取物对B16F10黑色素瘤原发位肿瘤体积和重量的影响从表1-2可以看出，与生理盐水组相比，阴地蕨提取物对于接种B16F10黑色素瘤 细胞后的小鼠足垫部的原发位肿瘤无论是体积以及重量都没有明显的影响作用。4.结论阴地蕨提取物能够抑制B16F10黑色素瘤肺转移，而且也抑制转移灶的生长，但是 对原发肿瘤细胞增殖没有影响，从小鼠体重变化可以看出，阴地蕨提取物的毒副作用很小， 为今后体内安全用药提供基础。三、阴地蕨提取物对B16F10黑色素瘤细胞实验性肺转移影响1.实验材料同前2.实验方法2. 1制备细胞悬液同前2. 2复制B16F10实验性肿瘤转移模型取C57BL/6小鼠置于小鼠注射固定器，尾静脉注射0. 2mL细胞悬液(含5X 105肿 瘤细胞)。接种过肿瘤细胞的小鼠随机分为4组模型组对照组(生理盐水组)、阴地蕨提 取物低剂量组(2g/kg小鼠体重)、阴地蕨提取物中剂量组(4mg/kg小鼠体重)、阴地蕨提取 物高剂量组(6g/kg小鼠体重)，每组动物数为10只，从接种后开始各组灌胃给予相应剂量 的药物，模型组给予相应的生理盐水，每日一次，给药23天，处死小鼠，取肺脏。避免镊子触 及脏器表面，防止损伤组织，用PBS洗净组织。10% PBS-福尔马林固定肺组织，称取肺重， 拍照，评价阴地蕨提取物对B16F10肿瘤血行肺转移的影响。3.实验结果实验结果采用Excel统计软件学生t检验，从各组取出的肺组织可以看出，模型组 的肺组织转移肿瘤结节数目显著多于给药组，由于肺结节太多，无法计数统计，对肺重的统 计分析表明，阴地蕨提取物高剂量组(6g/kg)和阴地蕨提取物中剂量组(4g/kg)均能抑制 小鼠肺组织重量，P值分别为P < 0. 01和P < 0. 05。阴地蕨提取物给药前后小鼠体重差异 不大，且与对照组相比，小鼠体重未发现有大幅度减少，各组的死亡率显示，阴地蕨提取物 药物对于小鼠的体内毒性较小。4.结论阴地蕨提取物给药组小鼠的死亡率与对照组相当，而且体重与给药前也没有明显 的减少，说明阴地蕨提取物的毒副作用很小，阴地蕨提取物可以很好的抑制实验性B16F10 黑色素瘤肺转移，阴地蕨提取物对于B16F10细胞直接入血之后的血行过程，黏附过程以及 穿出血管过程有一定的抑制作用。有益效果阴地蕨别名一朵云、花蕨、独立金鸡、独脚蒿、冬草、郎萁细辛、背蛇生、破天云、散 血叶、小春花、蛇不见、吊竹良枝、良枝草、独脚金鸡、丹桂移星草、黄连七、鸡爪莲。为阴地蕨科植物阴地蕨的全草。分布于陕西、江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、湖北、湖南、广东、广 西等地。主治清热解毒；平肝熄风；止咳；止血；明目去翳。主小儿高热惊搐；肺热咳嗽； 咳血；百日咳；癫狂；痫疾；疮疡肿毒；瘰疬；毒蛇咬伤；目赤火眼；目生翳障。现代药理学研 究，阴地蕨提取物具有抑制肿瘤转移作用。
具体实施例方式结合具体实施方式
，对本发明进一步说明如下阴地蕨为阴地蕨科植物 Septeridiumternatum(Thunb.) Lyon的带根全草，为福建民间习用草药，性味甘平，味淡。具 有平肝、清热、镇咳和清火、明目、解毒祛风的功效。其主要化学成分为黄酮类木犀草素和 阴地蕨素等。实施例1取50克阴地蕨药材，加入8倍药材重量的体积浓度为70%乙醇进行加热回流，回 流0. 5小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至相对密度1. 10 1. 25(90 95°C )，的浸 膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。
权利要求
阴地蕨提取物在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
2.阴地蕨提取物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种从阴地蕨中提取的木犀草素、阴地蕨素等提取物在抗肿瘤药物中的新用途，该提取物具有抗肿瘤转移作用，具体表现为抑制自发性肿瘤转移和实验性肿瘤转移，可用于制备抗肿瘤转移药物。
文档编号A61K36/11GK101849975SQ20101020363
公开日2010年10月6日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者庄捷, 王凌, 王少明, 阮君山 申请人:福建省立医院