专利名称：全人TNFα-Fab抗体及其PEG化抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及TNFa抗体的Fab片段及其PEG化抗体。
背景技术：
自身免疫性疾病发病率高，全世界约有3. 55亿人患有各种自身免疫性疾病，1999 年世界卫生组织将风湿病与癌症和心血管疾病列为威胁人类健康的三大杀手。风湿病发病率高，致残率高，在我国，由风湿病导致的致残人群逾千万。这其中，以类风湿性关节炎(RA) 和强直性脊柱炎(AQ危害性最大，未经治疗的RA和AS的致残率分别高达70%和30%。目前常用对抗自体免疫性疾病的方法，不是利用类固醇(steroids)来减缓因免疫系统攻击组织所造成的炎症反应(inflammation)外，就是使用免疫抑制药物 (immuno-suppressant drugs)，抑制免疫系统的作用。不过，这两种方法都会造成严重的副作用，而且都只能减缓病情的发展速度，非根治疾病。在生物制剂抗TNF抗体问世之前，风湿病并无特效药物治疗，非留体类抗炎止痛药及改善症状的免疫抑制剂只能改善病人的症状，改善生活质量，不能完全缓解病情。仅此类的药物的用量在我国每年都已超过200亿。 因此，风湿病严重的影响了患者的身心健康，并且给患者带来了沉重的经济负担，同时也影响了社会的发展。目前的研究表明，肿瘤坏死因子-a (TNF- α )是RA和AS病变过程中起主要作用的细胞因子，实验和临床结果均证实TNF-α是治疗该病的适合靶点。据此，TNF-α的拮抗剂相继诞生了，包括Amgen公司的Enbrel (etanerc印t)，Centocor公司的Remicade (infliximab) ,Abbott 的 Humira(adalimumab)。Enbre 是人 TNF- α 受体禾口 Fc 的融合蛋白。 Remicade是一种人-鼠嵌合的抗人TNF-α单克隆抗体，可特异性结合可溶性及膜结合型 TNF- α。2002年12月Abbott公司的Humira成为第一个抗TNF- α的全人单克隆抗体，使单克隆抗体药物的研究开发进入了一个新的时代。由于是全人抗体，避免了 Remicade会产生免疫反应的缺点。针对TNF-α的抑制剂成为迄今为止最为成功的RA治疗药物。完整的单克隆抗体分子量大，且Fc段可补充细胞毒效应分子功能，并可延长在血清中的半衰期。但是完整的单克隆抗体由于它具有一下的缺陷，使得他的应用受限1、用量大，制备工艺复杂，目前国际上也只有少数生物企业掌握了大规模表达单克隆抗体的技术； 2、Fc片段分子量大，不易穿透细胞；3、价格昂贵；4、有时Fc诱导的细胞因子失活、受体封闭或病毒中和等作用不希望出现。近年来，国内外研究证明在一定条件下，Fab片段可以取代完整的单克隆抗体发挥作用。Fab片段具有以下优势1、可以在大肠杆菌大规模表达。中国是发酵大国，可以充分利用这种优势大力发展抗体技术；2、由于去除了 Fc片段，在药代动力学上表现了更好的组织穿透能力；3、内效应子缺乏。同时因为去除了 Fc片段，Fab片段具备了这些缺陷，包括1、由于在大肠杆菌表达，增加了 Fab片段的抗原性；2、由于去除了 Fc片段，在体内代谢加快，半衰期减短。PEG修饰技术的出现可以很好的改善Fab片段的上述缺陷。比利时UCB制药公司和Nektar公司合作开发将聚乙二醇与人源化抗TNF-α小型抗体Fab (肿瘤坏死因子)结
3合，实验证明二者结合后仍能保持与TNF-α的结合活性，并且显著延长半衰期，减少给药次数。聚乙二醇化抗TNF- α小型抗体Fab (CDD-870，Cimzia)在2008年获得FDA批准用于治疗类风湿性关节炎。1977年，Abuchowski利用与聚乙二醇(PEG)共价结合来改变BSA (牛血清白蛋白)的免疫原性，开启了现代聚乙二醇化技术。经过30多年的研究发展，PEG化修饰已经成为现代医药领域成熟的“黄金标准”技术，广泛应用于蛋白质(肽类)、酶、抗体及小分子药物的修饰。PEG可将干扰素之类的蛋白质药物分子包裹起来形成凝胶剂，因其分子量变大，不易通过肾脏排泄，故能大大延长蛋白质类药物在体内的作用时间。蛋白药物的 PEG修饰已卓有成效，1991年第一种用PEG修饰的蛋白药物PEG-ADA被FDA批准上市，近几年上市的有PEG-干扰素、PEG-GSF, PEG-生长抑素。超氧化物歧化酶目前处于临床前研究的PEG修饰的蛋白药物有几十种.蛋白质多肽类经聚乙二醇修饰后具有以下优点1、溶解度和稳定性增加；2、免疫原性和抗原性减少，毒副作用降低；3、血浆半衰期延长和体内系统暴露增加；4、体内生物活性和疗效增加。生物制剂抗TNF-α的问世及在风湿疾病中的使用，是风湿病治疗的一场革命，目前临床使用的结果表明，抗TNF- α抗体不仅可以有效地阻止中晚期RA和AS患者的炎症进程，且对早期病人有根治疗效。鉴于大量的RA和AS患者以及其抗TNF-α治疗的有效性， 生物制剂有巨大的市场效益，因此，开发具有自主知识产权的抗TNF-α药物，对于我国的国计民生以及国际竞争战略均具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是公开一种全人TNFa抗体的Fab抗体及其编码基因。本发明的另一个目的是公开上述全人TNF α抗体的Fab抗体的PEG化的产物。本发明的第三个目的是公开上述全人TNFa抗体的Fab抗体的制药用途。本发明一方面公开了一种全人TNF α抗体的Fab抗体，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO :7，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO :8。进一步的，所述全人TNF α抗体的Fab抗体，其轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO 12，重链的氨基酸序列为SEQ ID NO 13。进一步的，上述全人TNF α抗体的Fab抗体经PEG化修饰。本发明第二方面，公开了一种多核苷酸，该多核苷酸编码上述全人TNFa抗体的 Fab抗体重链可变区、轻链可变区、重链Fd段或全长轻链。所述编码全人TNF α抗体的Fab抗体轻链可变区的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ IDNO 5,所述编码全人TNF α抗体的Fab抗体重链可变区的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ IDNO 6,所述编码全人TNF α抗体的Fab抗体全长轻链的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ IDNO :11，所述编码全人TNF α抗体的Fab抗体重链Fd段的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ IDNO :14ο上述多核苷酸可用于构建工程菌，表达全人TNF α抗体或其Fab抗体。本发明第三方面，公开了一种遗传工程化的宿主细胞，它是用含有前述多核苷酸的载体转化或转导的宿主细胞。优选的，所述宿主细胞为真核细胞或和原核细胞，分别为中国仓鼠卵巢细胞和大肠杆菌。上述宿主细胞可用于表达全人TNF α抗体或其Fab抗体。
本发明第四方面，公开了上述全人TNF α抗体的Fab抗体及其PEG化抗体的制药用途。全人TNF α抗体的Fab抗体可用于制备治疗与TNF α相关的炎症的药物，如制备治疗类风湿性关节炎的药物。制备药物时，可将本发明的全人TNFa抗体的Fab抗体或其PEG 化抗体与常规的药用载体混合配制。将本发明的Fab抗体或其PEG化抗体用于治疗类风湿性关节炎等与TNF α相关的炎症时的用法用量，可参照现有的TNFa抗体的常规用法用量。本发明有益效果本发明的全人TNF α抗体与TNF有较好的亲和力，体外能有效中和TNF对细胞的杀伤；其次，本发明的Fab抗体可以在大肠杆菌大规模表达，使生产成本大大降低，并且没有补体结合和ADCC等效应引发的副作用；第三，采用PEG化表面改性技术，以减小其被内皮系统吞噬的概率，延长在血液循环系统中的时间，同时又实现在体内缓释的目的，避免了小分子抗体半衰期短的缺点，在保持其抗TNFa活性的同时，使之更适合体内应用。
具体实施例方式本发明采用了下述试验思路取活动性类风湿关节炎病人外周血分离白细胞获得阳性克隆。分离阳性克隆的总RNA，反转录获取cDNA。进行PCR扩增，克隆并测序获得抗人 TNFa抗体的重链及轻链可变区的编码序列。1.构建全长的重链编码区和轻链编码区，克隆入表达载体pci-neoanvitrogen 公司产品)，将载体转染CHO细胞，表达全人TNFa-Fab抗体。通过MTX筛选，提高抗体的表达量。2.重链编码区和轻链编码区，按照常规方法克隆到PC0M3H载体，转化至大肠杆菌细胞，诱导表达TNFa-Fab抗体，通过加入葡萄糖，蔗糖等优化措施，提高抗体的表达量。3.将大量表达的TNFa-Fab抗体纯化后进行PEG化。下面结合实施例进一步阐述本发明。实施例1分泌抗人TNFa抗体的B细胞的获得取活动性类风湿关节炎病人外周血5毫升，用淋巴细胞分离液分离白细胞，进行培养，根据ELISA结果鉴定阳性克隆。1.选择血样为了获得分泌抗人TNFa的人B细胞，首先用人TNFa (购自深圳晶美公司)常规包被96孔板，每孔用该蛋白250ng，包被过夜。然后，用5%脱脂奶粉室温封闭2小时，奶粉用 pH7. 2PBS配制。洗涤后，加入不同病人血清100微升，室温温育1小时。然后加入过氧化物酶标记的羊抗人IgG，室温放置1小时。洗涤至少5遍后，加入含TMD或其他显色剂，室温或37度处理20分钟。最后，加入终止液。加入的过氧化物显色底物加入10分钟后，用 50 μ IlN的硫酸终止反应，读取450nm光密度值。选取阳性且OD值高的血清作为获选血样。2.分离并富集分泌抗TNF抗体的人B-细胞3.在适当条件下对分泌抗TNF抗体的人B-细胞进行培养4.抗体-反应ELISA筛选用ELISA检测抗TNFa IgG的分泌。对经EBV永生法转化的人B细胞培养液上清的样品进行筛选。其中，选择具有最好的结合能力的阳性克隆，且为IgGl。实施例2全人TNFa-Fab抗体基因可变区的获得取阳性克隆细胞5000-10000 个，用 iTrizol (GIBCO)分离总 RNA，用 Superscript IIIFirst-strand反转录酶(invitrogen公司产品)以获取cDNA。上述操作均按照厂家说明书进行。用下述引物和条件进行PCR，所用扩增酶为Τ0Υ0Β0的KOD-plus以确保扩增过程中减少可能的突变。
轻链上游引物GCTAGCGCCGCCACCATGGACATGCGGG(SEQ ID NO 1) 轻链下游引物TTTGATCTCAAGCTTGGTCC(SEQ ID NO 2) 重链上游引物CCGGAATTCGCCGCCACCATGGAGTT(SEQ ID NO 3) 重链下游引物ACTCGAGACGGTGACCAGTGTA(SEQ ID NO 4) PCR条件
a)反应体系的组成 V
成分数量(μ )IOX PCR反应缓冲液525 mM Mg2SO45KOD-plus聚合酶(5单位/微1升)上游引物、下游引物(2微克/各1微升，共计25微微升)升cDNA1. 5μ1灭菌三蒸水至50微升反应条件预变性94度4分钟主循环94度20秒，55度20秒，72度1分钟。循环数30后延伸72度10分钟PCR过程在Applied Biosystems热循环仪上进行。b)电泳鉴定与胶回收按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，两个 PCR的产物分别为650bp和690bp左右，与理论大小相符。用华舜公司的胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行，各得DNA约1. 5微克。克隆与测序上述产物按照T-克隆法常规克隆到PMD19-T vector，鉴定出正确克隆后进行测序。克隆方法采用Tkara公司试剂盒，操作按照说明书进行。对阳性克隆进行测序，结果显示，该两个克隆分别为人TNF-Fab抗体的轻链和重链的可变区编码基因。测序结果如下
权利要求
1.一种全人TNF α抗体的Fab抗体，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID Ν0:7，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO :8。
2.如权利要求1所述全人TNFα抗体的Fab抗体，其特征在于，所述全人TNF α抗体的 Fab抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO 12，重链的氨基酸序列为SEQ ID NO :13。
3.如权利要求1或2所述全人TNFα抗体的Fab抗体，其特征在于，所述全人TNF α抗体的Fab抗体经PEG化修饰。
4.一种多核苷酸，该多核苷酸编码权利要求1或2所述全人TNF α抗体的Fab抗体重链可变区、轻链可变区、重链Fd段或全长轻链。
5.如权利要求4所述多核苷酸，其特征在于，所述编码全人TNFα抗体的Fab抗体轻链可变区的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ ID NO :5，所述编码全人TNF α抗体的Fab抗体重链可变区的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ ID NO :6，所述编码全人TNF α抗体的Fab抗体全长轻链的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ ID NO: 11，所述编码全人TNF α抗体的Fab抗体重链Fd段的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ ID Ν0:14。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，它是用含有权利要求4或5所述多核苷酸的载体转化或转导的宿主细胞。
7.如权利要求6所述遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞。
8.如权利要求7所述遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为中国仓鼠卵巢细胞，所述原核细胞为大肠杆菌。
9.如权利要求1-3中任一权利要求所述全人TNFα抗体的Fab抗体用于制备治疗与 TNFa相关的炎症的药物的用途。
10.如权利要求9所述全人TNFα抗体的Fab抗体的用途，其特征在于，所述治疗与 TNFa相关的炎症的药物为制备治疗类风湿性关节炎的药物。
全文摘要
本发明公开了一种全人TNFα抗体的Fab抗体及其PEG化抗体。本发明的全人TNFα抗体的Fab抗体，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO7，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO8。本发明还进一步公开了该全人TNFα抗体的Fab片段的编码基因，及其表达宿主细胞。本发明的全人TNFα抗体的Fab抗体可用于治疗与TNFα相关的炎症，与TNF有较好的亲和力，可在CHO细胞及大肠杆菌中大规模表达，生产成本低，且没有补体结合和ADCC等效应引发的副作用，经PEG化表面改性技术后，半衰期获得了延长，更适合体内应用。
文档编号A61P19/04GK102336834SQ20101023426
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者倪健, 朱向玲 申请人:苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司