一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统及其制备方法

专利名称：一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药制药领域，涉及蛋白质和基因工程药物的纳米乳新型载药系统， 具体涉及一种蛋白质药物新型纳米乳载药系统及其制备方法。
背景技术：
随着生物科技及分子生物学的发展，越来越多的高纯度蛋白质药物出现并开始应 用于医药领域。蛋白质药物与其他药物相比，具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明 确、成本低廉、成功率高、安全可靠等优点，从而成为医药产品中的重要组成部分。自1982 年美国Lilly公司将第一个重组蛋白质药物_重组胰岛素投放市场来，以蛋白质药物研发 为主的全球生物技术公司总数已近5000家，上市公司600余家。到目前为止，全球已批准 适应症多达220种的150个蛋白质药物上市，其产值和销售额已超过400亿美元。虽蛋白 质药物发展迅速，但其研发方面还面临着严峻和巨大挑战，这根本原因在于以下自身特点 与不足(1)结构复杂，影响因素多，理化性质不稳定，质量不易控制和检测，稳定性差，使 其保存、运输过程均需低温或冻干，使用也不方便；(2) —些蛋白质药物的分子量大，口服 给药易受胃肠道PH、菌群及酶系统破坏，生物膜穿透性差，吸收困难，生物利用度低，非注射 给药一般仅为百分之几；(3)扩散差、分配系数小使其难通过生物屏障及脂质膜，传递效率 与靶向性较低；(4)显著的肝、胃肠首过效应，经过首过效应后仅保留2 3% ； (5)生物半 衰期短，体内清除率高。由于蛋白质药自身特点，用药方式大多只能用频繁地注射给药，但 这往往会对患者造成费用高、顺应差、安全性差、治疗率低等问题。蛋白质药物和其他药物 一样都要理想、合适的载药系统，才能发挥出最佳的药物效果。由于载药系统是蛋白质药物 研发是非常关键和重要环节，用药物载药系统来改变蛋白质药物自身不足，成为当前研发 白勺 ^^ ； ^^ O由于蛋白质药物不稳定性和成本原因，在研究中通常先要用蛋白质模型药物进行 研究。因此，国内外蛋白质药物研发中，通常用具有性质稳定，在多数生化反应中不发生作 用，价格低廉，蛋白分子量较小、溶解度较大、稳定性较好且容易较大量、高纯度的制备的人 和牛血清白蛋白作为蛋白质药物研发中标准的蛋白质模型药物。同时，它还常被作为生物 相容性和水溶性的生物大分子被广泛研究。由于蛋白质药物的载药系统是蛋白质药物研发中重要和关键的环节，因此标准 的蛋白质模型药物牛和人血清白蛋白的载药系统也成为国内外蛋白质药物研究的热点。 以BSA为蛋白质药物模型，国外内研究主要有胡凯莉(2009)制备的乳铁蛋白修饰聚乳 酸-聚羟基乙酸和乳铁蛋白修饰聚乳酸纳米粒载药系统[1]；张慧芳(2009)以丙烯酸和 N-乙烯基吡咯烷酮为反应单体，用原位聚合法制备BSA纳米囊和微球[2]。薛璇(2008)制 备出粒径为2.0 3. Oum，载药量为14. 72%，包封率为92. 07%的BSA凝胶[3]；王黎(2007) 制备的BSA多囊脂质体M。Byimg Soo Kim(2009)用聚乳酸-聚乙二醇酸(PLGA)和聚乙烯 醇为材料，制备的用FITC标记的BSA微球[5] ；Yunqing Kang (2009)以聚L-丙交酯(PLLA) 材料，制备 1. 22um 的 BSA 微球[6] ；MarciIene Μ. A (2009)制备的直径 170 520nm 的 BSA纳米球[7] ；Yujun Wang (2009)用壳聚糖为材料，制备直径为10 20nm的磁性BSA纳米粒 [8] J. C. Gayet (1996)制备出 BSA-PEG 凝胶[9] ；Tse-Ying Liu (2005)制备含缺钙性羟基磷 灰石BSA控释系统_ ；M. Igartua (1998)用PLGA材料制备出粒径在0. 6 2um的BSA微 球[11]；曹金娜(2009)制备的包封率为46. 82%的N-三甲基壳聚糖BSA脂质体[12]；夏洪 男(2009)用生物可降解材料PLG607材料，用溶剂挥发法制备了粒径为40 70im，包封 率为46. 3%的BSA微球[13]；黄婉丹(2009)以PLGA为材料，制备复乳-溶剂挥发法制备 BSA-PLGA微球[14]；张良珂(2005)用Ca2+，Ba2+为交联剂，制备果胶BSA凝胶微丸[15]；梁晓 晖(2008)制得平均粒径为284. lnm，包封率为34. 21%,Zeta电位为+27. ImV的肝靶向BSA 脂质体[16]。国内专利主要有戴传云以磷脂和海藻酸钠为材料，制备的BSA多泡脂质体 [CN1727001A]；张阳德的BSA纳米粒[CN1736489A]；张丽娜以壳聚糖和海藻酸钠为材料，制 备BSA微囊[CN1546557A]；王身国制备亲水性药物BSA释放体系[CN1393217A]、脂肪族内 酯共混物释药体系[CN1393267A]和生物可降解持续释药体系[CN1393218A]；张政朴以四 臂型聚乙烯丙交酯为材料，制备BSA微球[CN1927906]；王荣民制备纳米级BSA微球及纳米 囊[CN101401490A]；杜予民制备羧甲基壳聚糖纳米粒[CN100393782C]。以人血清白蛋白 (HAS)为药物模型的主要有孟慧(2009)用PLGA、N-甲基_2_卩比咯烷酮、苯甲酸苄酯为材料 制备可注射HSA凝胶[17]。刘世芸(2009)以用聚乳酸为材料，用复乳法制备出粒径在10 40 μ m，包封率为85. 25%，负载率为14. 52%的复合HSA微球[18]。总之，以牛和人血清白蛋白作为标准蛋白质模型药物的蛋白质药物载药系统研究 主要集中在纳米粒、纳米囊、纳米微球、微囊、多泡脂质体、脂质体；药用辅料主要是PLA、 PLAG、PLG607、三甲基壳聚糖、壳聚糖、聚乳酸-聚羟基乙酸、聚3-羟基丁酸酯、磷脂和海藻 酸钠、PVP、PLLA等；制备方法多用复乳_溶剂挥发法、原位包合法、乳化交联法、吸附法等。 这些载药系统或药用辅料、制备方法存在以下问题(1)药物包封率及载药量低；(2)使用 材料毒副作用较大，制备过程中有机溶媒残余量大，毒性大；(3)制造工艺复杂、条件要求 高、工艺操作时间长；(4)制备过程易破坏药物；(5)具有突释效应；(6)生物相容性不理 想，产率低、不易灭菌、稳定性和重复性差，难大规模生产；(7)原料价格昂贵，生产成本高。 用纳米乳载药系统可较好地解决。纳米乳(Nanoemulsion)，曾称微乳状液、微乳液或微乳剂，现又称纳米乳液、纳 米乳状液、纳米乳剂，是一个由油、水、表面活性齐U、助表面活性剂四个组分组成的、粒径为 1 lOOnm、液滴多为球形，大小比较均勻，透明或半透明、具热力学稳定和各向同性、热压 灭菌或高速离心稳定不分层的胶体分散系统。其具有的显著特点有各向同性的透明液体， 热力学稳定，经热压灭菌或高速离心不分层；自发形成、工艺简单，易于制备、制备过程不需 特殊设备、制剂质量稳定；在一定程度上能保护药物在胃肠、肝脏内免遭酶解，避免药物首 过效应；粒径小，增强药物在胃肠道吸收，提高生物利用度；改变药物在体内分布，具有一 定的组织与器官靶向性；对于易水解药物保护作用，有缓释作用。由于纳米乳以上的显著 优势，因此在国内外研究如火如荼，尤其是在蛋白质药物方面。研究主要有葛伟(2009) 制备了胃癌特异性(MAGE1-HSP70/SEA)纳米乳疫苗，可明显提高细胞的免疫应答，具有明 显抗肿瘤活性[19’2°] ；Makidon(2009)制备了洋葱伯克氏菌17kDa的外膜蛋白纳米乳疫苗。 免疫后，可明显提高CD-I小鼠血清的IgG和SIgA水平，增强抗体交叉中和反应水平[21]； Bielinska(2008)制备HIV gpl20重组抗原水包油纳米乳[22] ；Paul E(2008)用大豆油、酒精为材料，制备出粒径小于400nm无需注射的纳米乳乙肝疫苗。实验证实该疫苗无毒、免疫 效果好、可产生长久的免疫力[23]；葛伟(2008)制备了肿瘤基因工程(MAGE-1/HSP70/SEA) 纳米乳疫苗，口服、皮下、静脉和腹腔注射4种途径免疫C57BL/6小鼠后，都能有效地抑制肿 瘤生长[24]。Bielinska(2007)用非离子表面活性剂为原料，制备含炭疽芽孢杆菌保护性 抗原(rPA)纳米乳[25]；孙玉静(2005)包裹含肿瘤特异性抗原MAGE-1-HSP70融合蛋白与 适量超抗原SEA配比组成的复合抗原，制备出肿瘤基因工程纳米乳疫苗。体内实验表明能 显著激活针对MAGE-I的细胞免疫反应，对小鼠肿瘤模型能产生明显的治疗效果[26]。师瑞 (2005)研制出胃癌MG7基因特异性纳米乳疫苗具有将强的免疫原性和较强的抗肿瘤作用 [27]。Hamoudal (2001)制备I型单纯性疱疹、流感病毒A和牛痘的纳米乳疫苗[28]。上述用 纳米乳作为蛋白质药物的载药系统成功研究为本发明提供坚实的理论基础和可行性。

发明内容
理想药物及其制剂应遵循“三效”、“三小”和“五便”原则，“三效”高效、速效、长
效；“三小”剂量小、副作用小、毒性小；“五便”生产、储藏、运输、携带、使用。而理想载药 系统的则应具有(1)所用全部辅料均是药用辅料，符合药典标准、生物相容性好，安全无 毒副作用；(2)载药量大，能满足用药要求；(3)包封率高，至少80%以上；(4)生产过程和 工艺简单，易推广、无有积溶剂残留；(5)制剂质量稳定、安全，有效；(6)粒径小，吸收快，在 体内维持时间长，且具有一定的缓释和靶向作用。设计思路由于蛋白质药物在医药制药领域非常重要地位，其载药系统成为研究 热点。针对蛋白质药物本身特点及载药系统中存在不足与缺陷，根据药物所遵循的三原则 和理想载药系统的要求，利用现代纳米乳技术对蛋白质药物进行包裹，提出一种包封率高 和载药量大、制备过程和工艺简单、使用药用辅料安全且无有机溶剂残留，且可极大提高蛋 白质药物的稳定性、成本低廉、便于应用和推广的，粒径在1 IOOnm范围，符合纳米乳质量 要求的蛋白质药物新型纳米乳载药系统。实现上述目的的技术方案是一种蛋白质药物新型纳米乳载药系统，由下列部分 组成0. 15%蛋白质药物、10% 30%的表面活性剂、5% 25%的助表面活性剂、 3% 20%的油相、0% 10%的稳定剂，20% 70%的水相，所述表面活性剂为聚山梨酯 或聚氧乙烯脂肪酸酯，助表面活性剂为失水山梨醇脂肪酸酯或者C2 C4的一元醇或多元 醇，所述油相为食用药用液体石蜡、食用色拉油或有机酸酯，所述水相为蒸馏水，生理盐水， pH为6. 5 7. 5磷酸盐缓冲液中的一种或几种，所述稳定剂为甘露醇、甘氨酸和丙氨酸。所述的蛋白质药物包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胰岛素、肌红蛋白，或者水 溶性或难溶性蛋白质类似药物，所述蛋白质药物浓度范围牛血清白蛋白1 10% ；胰岛 素1 5% ；肌红蛋白1 10% ；人血清白蛋白1 10%。所述聚山梨酯为吐温-80、吐温-85、吐温60中的一种或几种，所述聚氧乙烯脂 肪酸酯为聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油中任一种及一种以上组合；其有效量为吐 温-80 10 30%、吐温-85 10 30%、吐温60 :5 30%、聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40) 10 30%、聚氧乙烯蓖麻油(EL35) :10 30%。所述失水山梨醇脂肪酸酯是司盘-85、司盘80和司盘60中的任一种及一种以上组 合；其有效量为司盘-85 5 15%、司盘80 5 15%、司盘60 5 10%。
所述C2-C4的一元醇或多元醇为无水乙醇、正丁醇、甘油、1，3-丁二醇、1，3-丙二 醇中的任一种，其有效量为无水乙醇5 10% ；甘油5 10% ；1，3-丙二醇5 10% ； 1，3_ 丁二醇5 10%，正丁醇5 10%。较优选组合表面活性剂与助表面活性剂的互配为吐温80/司盘80、吐温85/司 盘 85、RH40/ 丙二醇、EL35/ 丙二醇。所述有机酸酯为肉豆蔻酸异丙酯(IPM)、油酸乙酯、乙酸乙酯、GTCC中的任一种， 其中油相的有效量分别为IPM :10 20%、油酸乙酯5 20%、乙酸乙酯10 20%、 GTCC :3 15%。所述稳定剂的有效量为甘露醇1 10%、甘氨酸1 10%、丙氨酸1 10%。优选EL35 丙二醇IPM(27% 9% 3% )，蛋白质药物浓度4. 5%和生理盐 水56. 5%，丙氨酸5%。所述纳米乳的粒径为1 lOOnm。所述纳米乳载药系统可以是上述纳米乳的水和缓冲液无限稀释液。本发明的另一目的是提供一种蛋白质药物新型纳米乳载药系统的制备方法，具体 包括下列步骤1)按配方称取蛋白质药物、溶剂、表面活性剂、助表面活性剂、油相、稳定剂、水相2)将所述量的表面活性剂与蛋白质药物混勻且使牛血清白蛋白部分溶解；3)再加入所述量的助表面活性剂让蛋白质药物完全溶解，得到澄清的溶液；4)再加入所述量的油相和稳定剂，搅拌下缓慢加入处方量70%水相，得到澄清的 溶液；5)最后再加入余量水相，混勻，得到澄清透明的纳米乳。所述步骤⑵的混勻为4°C下，转速为50 100r/m搅拌。所述步骤(4)中的搅拌为在25°C 37°C恒温水浴下，转速为100 200r/m搅拌。所述制备方法还包括纳米乳的除菌、检测和包装步骤，所述除菌为采用0. 2μπι微 孔滤膜过滤。本发明的蛋白质药物新型纳米乳载药系统是由表面活性剂、助表面活性剂、油 相、水相及稳定剂组成。制备出的该纳米乳是粒径在1 IOOnm间的乳滴分散在另一种液 体中形成的具有各向同性的热力学稳定的胶体分散系统。处方设计原则纳米乳作为药物载体，首先应在国家食品药品卫生药用辅料目录， 并符合药物载体基本要求，即无毒、无刺激、无不良药理作用、具有良好的生物相容性、不影 响主药的药效和稳定性；另外由于纳米乳自身特性，它对各处方组成还有特殊的要求，在用 滴定法绘制伪三元相图的基础上，筛选出形成稳定的纳米乳区的较大区域作为其最优化处方。表面活性剂是纳米乳形成所必需的物质，其主要作用是降低界面张力形成界面 膜，促使纳米乳形成；增加主药的溶解性，确保制剂的稳定性。表面活性剂分为非离子型表 面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、嵌段共聚物、两性离子表面活性剂、氟化 表面活性剂6类。目前较常用的脂肪酸山梨坦(亲油性)、聚山梨酯(吐温类，亲水性)、聚 氧乙烯脂肪酸酯类(商品名Myr j，亲水性)、聚氧乙烯脂肪醇醚类(商品名Brij，亲水性)、聚氧乙烯、聚氧丙烯共聚物类(聚醚型，商品名Poloxamer或Pluronic)、蔗糖脂肪酸酯类和 单硬脂酸甘油酯、琥珀酸甘油酯/Brii类和EmLphor、Labraso 1。但是表面活性剂的选择决 定于所形成的纳米乳的特性和使用目的。HLB值在4 7的表面活性剂可制备W/0型纳米 乳，HLB值在8 18内的表面活性剂可制备0/W型纳米乳。本发明采用高HLB值的表面活 性剂吐温类和聚氧乙烯脂肪酸酯类，这些表面活性剂，无毒无刺激，生物相容性好，有一定 的营养作用，是制备各种纳米乳的较好辅料。优选吐温60、吐温80、吐温85、聚氧乙烯蓖 麻油(EL35)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH-40)。纳米乳的形成还要求有短暂的负表面张力。因此，常需要有助表面活性剂的参与。 助表面活性剂有三方面作用协助表面活性剂降低界面张力，降低表面活性剂分子间的排 斥力；增加界面流动性，减少纳米乳形成时的界面弯曲能，使纳米乳自发形成；调节表面活 性剂的HLB值，使表面活性剂在油-水界面有较大的吸附。最常用的是适宜HLB值的非离 子表面活性剂。本发明用目前最常用的司盘类(85、60、80)为其主要的助表面活性剂，同时 还加入具有增强助表面活性剂的作用的低链醇类溶剂(乙醇、甘油、1，3_ 丁醇、正丁醇，丙 二醇)，可让纳米乳中所使用的油相与界面膜上表面活性剂分子之间保持渗透和联系，并易 于与表面活性剂形成界面膜，从而更有利于纳米乳的形成。本发明采用的油相有色拉油、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸/葵酸 三甘油脂(GT°C C)、药用液体石蜡中等，这些油相材料均可食用，无毒无刺激，生物相容性 好，有一定的营养作用，是制备各种纳米乳的主要医药辅料。本发明还加入少量的稳定剂O 10%，可让本发明的剂型稳定性更好，便于储存。本发明与其它现有技术相比，具有以下的有益效果1.解决蛋白质和基因工程药物的稳定性差，制备蛋白质的纳米乳可极大蛋白质提 高其稳定性。2.制备的蛋白质药物新型纳米乳载药系统可进一步加入任意比例的水分稀释，热 力学性质稳定，可用微孔滤膜过滤除菌，易于制备、运输和储存、澄清透明的纳米乳；3.解决目前蛋白质的药物存在的药物包封率及载药量低，本发明制备的蛋白质药 物新型纳米乳载药系统的载药量大，包封率高，提高药效。4.本发明所选择的原料均是药用辅料，制备过程不涉及任何有机溶剂，无残留，安 全无毒，制备过程温和，对蛋白质无破坏作用。5.本发明采用的配方和方法简单可行、成本低廉，可以便于大规模工业化生产。


1.部分蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳外观图，图中主要处方依次为1号为吐温80、司盘80、IPM ；2号为吐温85、司盘85、 IPM、3 号为PMH40/丙二醇、吐温 85、司盘 85、IPM、4 号为EL35、丙二醇、IPM。2.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳透射电镜图，3.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳粒径与粒度分布图，4. BCA法检测蛋白含量的标准曲线方程图，5.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的稳定性部分研究结果图，图中1和2号处方质量稳定，3号发生明显絮凝，4、5号变成半透明，有明显破乳和乳析。6.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳室温放置不同时间的SDS-PAGE图，图6从做左到右条带次依次为最优含4. 5%的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳 米乳在室温放置30、60、180、360d ；而相同质量比的牛血清白蛋白的溶液室温放置30和 60d。7.不同pH下的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的电位，8.不同温度下的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的粒径，9.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的电泳分析其完整性图，从左到右的顺序依次为空白纳米乳剂未破乳上清，空白纳米乳剂未破乳沉淀，空 白纳米乳剂破乳上清，空白纳米乳剂破乳沉淀，蛋白分子Marker、蛋白质模型药物牛血清 白蛋白纳米乳剂未破乳上清，蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂未破乳沉淀，蛋白质 模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂破乳上清，蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂破乳沉 淀、牛血清白蛋白水溶液。10.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的免疫印迹分析其特异性图，从左到右的顺序依次为牛血清白蛋白水溶液，蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米 乳剂破乳沉淀，蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂破乳上清，蛋白质模型药物牛血清 白蛋白纳米乳剂未破乳沉淀，蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂未破乳上清，蛋白分 子预染Marker、空白纳米乳剂破乳沉淀、空白纳米乳剂破乳上清、空白纳米乳剂未破乳沉 淀、空白纳米乳剂未破乳上清。11.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳在体外抗腐蚀图，从右到左的顺序依次为条带1和2分别为牛血清白蛋白水溶液放入水中0. 5h， lh,条带3和4分别为牛血清白蛋白水溶液放入人工胃液中0. 5h，lh,条带5、6、7分别为蛋 白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳处方1水溶液放入人工胃液中0. 5h、lh、3h，条带8、9、10 分别为蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳处方2水溶液放入人工胃液中0. 5h、lh、3h。12.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳对正常小鼠口服后，IgG效价柱形图，13.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳对正常小鼠口服后，IgG效价变化折线 图。
具体实施例方式下面结合具体试验例中选择目前常用的两种比较标准蛋白质模型药物人和牛血 清白蛋白、肌肉红蛋蛋白和胰岛素共4种蛋白质药物为本发明的纳米乳载药系统的药物有 效成分；在实施例来用目前用的最多的蛋白质模型药物牛血清白蛋白为药物载体，进一步 对阐述和证实蛋白质药物的新型纳米乳载药系统的有益效果。由于蛋白质药物种类繁多， 不可能一一举例，因此并不意味着本发明仅仅限于此。实施例实施例1 蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统(IOOg)1)称取牛血清白蛋白5g、正丁醇5g、吐温_8030g、司盘_8010g、药用IPM 10g、蒸 馏水39g.2)将所述量的表面活性剂与牛血清白蛋白混勻，并在转速为50 100r/m恒温磁力搅拌器搅拌，温度在4°C下先让牛血清白蛋白部分溶解；3)再加入所述量的助表面活性剂和溶剂让牛血清白蛋白完全溶解，得到澄清的溶 液；4)再加入所述量的油相和稳定剂Ig甘露醇，25°C 37°C恒温水浴，并在转速为 100 200r/m恒温磁力搅拌器搅拌，缓慢加入约70%处方量蒸馏水，得到澄清的溶液；5) 最后再加入余量的蒸馏水，混勻，得到澄清透明的溶液。6)最后用微孔滤膜过滤除菌，检测质量合格后，灌装、密封、保存。制备的蛋白质药物牛血清白蛋白的纳米乳载药系统外观黄色、澄清透明、粒径在 1 IOOnm间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，载药量为4. 5%，包封率为93%，室温和 4°C放置半年后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。实施例2 蛋白质药物人血清白蛋白纳米乳载药系统1)称取人血清白蛋白lg、甘油5g、吐温_8010g、司盘_805g、药用液体石蜡5g、生 理盐水69g，备用；步骤2)、3)同实施例1相同；4)再加入所述量的油相和稳定剂5g甘露醇，25°C 37°C恒温水浴，并在转速为 100 200r/m恒温磁力搅拌器搅拌，缓慢加入蒸馏水，得到澄清的溶液；5)最后再加入余量的蒸馏水，混勻，得到澄清透明的溶液。6)最后用微孔滤膜过滤除菌，检测质量合格后，灌装、密封、保存。制备的蛋白质药物人血清白蛋白的纳米乳载药系统外观澄清透明、粒径在1 IOOnm间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，载药量为1. 9%，包封率为93%，室温和4°C 放置半年后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。实施例3蛋白质药物胰岛素纳米乳载药系统1)称取胰岛素0. 5g、无水乙醇5g、吐温_6010g、司盘_805g、色拉油5g、甘氨酸5g、 蒸馏水69g，备用；步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。制备的蛋白质药物胰岛素纳米乳载药系统外观澄清透明、粒径在1 IOOnm间， 12000rpm, IOmin高速离心后不分层，载药量为0. 49%，包封率为99%，室温和4°C放置半年 后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。实施例4蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统1)称取牛血清白蛋白8g、丙二醇5g、吐温-6030g、司盘_6010g、GTCC 10g、 ρΗ6· 80. OlM磷酸盐缓冲液32g，备用；步骤2)、3)同实施例1相同；、4)再加入所述量的油相和稳定剂5g丙氨酸，25 V 37°C恒温水浴，并在转速为 100 200r/m恒温磁力搅拌器搅拌，缓慢加入蒸馏水，得到澄清的溶液；5)最后再加入余量的磷酸盐缓冲液，混勻，得到澄清透明的溶液。6)最后用微孔滤膜过滤除菌，检测质量合格后，灌装、密封、保存。制备的蛋白质药物胰岛素纳米乳载药系统外观深黄色、澄清透明、粒径在1 IOOnm间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，载药量为7. 2%，包封率为90%，室温和4°C 放置半年后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。实施例5 蛋白质模型药物人血清白蛋白纳米乳载药系统1)称取人血清白蛋白 4. 5g、l，3 丁二醇 10g、EL3520g、司盘 _8015g、GTCClOg、 pH7. 40. OlM磷酸盐缓冲液37. 5g，备用；步骤2)、3)同实施例1相同。
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4)再加入所述量的油相和稳定剂3g甘氨酸，25°C恒温水浴，并在转速为100 200r/m恒温磁力搅拌器搅拌，缓慢加入蒸馏水，得到澄清的溶液；5)最后再加入余量的磷酸盐缓冲液，混勻，得到澄清透明的溶液。6)最后用微孔滤膜过滤除菌，检测质量合格后，灌装、密封、保存。制备的蛋白质药物人血清白蛋白纳米乳载药系统外观澄清、透明、粒径在1 IOOnm间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，实际载药量4. 1 %，包封率91 %，室温和4°C 放置半年后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。实施例6 蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统1)称取牛血清白蛋白 10g、l，3 丁二醇 5g、RH4027g、GTCC 3g、甘露醇 10g、 ρΗ7· 40. 05Μ磷酸盐缓冲液45g，备用；步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。制备的蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统外观深黄色、澄清、透明、粒径在 1 IOOnm间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，载药量为9. 1 %，包封率为91 %，室温和 4°C放置三个月后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。实施例7 蛋白质药物胰岛素蛋白纳米乳载药系统1)称取胰岛素2g、甘油10g、EL3530g、液体石蜡15g、甘氨酸IOg pH7. 40. IM磷酸 盐缓冲液33g，备用；步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。制备的蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统外观澄清、透明、粒径在1 IOOnm间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，载药量为1. 76 %，包封率为88 %，室温和4°C 放置半年后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。实施例8 蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统1)称取牛血清白蛋白15g、甘油10g、EL3530g、乙酸乙酯10g、0. 9%生理盐水35g， 备用；步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。制备的蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统外观深黄色、澄清、透明、粒径在 1 IOOnm间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，载药量为13.8%，包封率为92 %，室温 和4°C放置三个月后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。实施例9 蛋白质模型药物人血清白蛋白纳米乳载药系统1)称取人血清白蛋白10g、甘油5g、RH-4030g、司盘_855g、色拉油15g、pH6. 80. IM 磷酸盐缓冲液30g，备用；步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。制备的蛋白质药物人血清白蛋白纳米乳载药系统外观澄清、透明、粒径在1 IOOnm间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，载药量为8. 7%，包封率为87%，室温和4°C 放置三个月后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。实施例10 蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统1)称取牛血清白蛋白lg、无水乙醇10g、RH_4014g、司盘_605g、油酸乙酯5g、甘氨 酸10g、蒸馏水55g，备用；步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。制备的蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统外观澄清、透明，粒径在1 IOOnm间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，载药量为0. 96 %，包封率为96 %，室温和4°C 放置一年后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。实施例11 蛋白质药物肌红蛋白纳米乳载药系统1)称取肌红蛋白10g、正丁醇10g、吐温8020g RH-40 10g、司盘-80 5g、乙酸乙酯20g、丙氨酸lg、蒸馏水24g，备用；步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。制备的蛋白质药物肌红蛋白纳米乳载药系统外观澄清、透明、粒径在1 IOOnm 间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，载药量为4. 25%，包封率为85%，室温和4°C放置 一年后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。实施例12 蛋白质药物肌红蛋白纳米乳载药系统1)称取肌红蛋白5g、吐温8530g、司盘-8515g、IPM20g、蒸馏水30g，备用；步骤2)、 3)、4)、5)、6)同实施例1相同。制备的蛋白质药物肌红蛋白纳米乳载药系统外观澄清、透明、粒径在1 IOOnm 间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，载药量为4. 35%，包封率为87%，室温和4°C放置 半年后，纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。实施例13 蛋白质药物肌红蛋白纳米乳载药系统1)称取肌红蛋白lg、甘油5g、吐温8520g、EL3510g、司盘-855g、GTCC 15g、甘氨酸 lg、蒸馏水43g，备用；步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。制备的蛋白质药物人血清白蛋白的纳米乳载药系统外观澄清透明、粒径在1 IOOnm之间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，实际载药量4. 5 %，包封率92 %，室温和 4°C放置半年后，纳米乳不发生明显的絮凝、分层和药物析出。实施例14 蛋白质模型药物人血清白蛋白纳米乳载药系统1)称取人血清白蛋白5g、丙二醇10g、吐温6010g、吐温8015g、司盘-8515g、油酸 乙酯15g、甘氨酸5g、甘露醇5g、蒸馏水20g，备用；步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同制备的蛋白质药物人血清白蛋白的纳米乳载药系统外观澄清透明、粒径在1 IOOnm之间，12000rpm, IOmin高速离心后不分层，实际载药量4. 5%，包封率92%。室温和 4°C放置半年后，纳米乳不发生明显的絮凝、分层和药物析出。实施例15 蛋白质药物胰岛素蛋白纳米乳载药系统1)称取胰岛素5g、吐温8510g、吐温8015g、司盘_8515g、液体石蜡10g、甘氨酸5g、 甘露醇5g、蒸馏水35g，备用；步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同制备的蛋白质药物胰岛素纳米乳载药系统外观澄清透明、粒径在1 IOOnm之间， 12000rpm, IOmin高速离心后不分层，实际载药量4. 5 %，包封率91 %。试验例在以下的试验例，主要用标准蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳为蛋 白质药物的代表进行证明本发明蛋白质药物的新型纳米乳载药系统及其制备方法所带来 的效果。试验材料与仪器设备试验材料牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, Fraction V, > 98% ), Sigma 公司生产；吐温80、吐温85、吐温60、司盘80、司盘85、司盘60购至中国上海国药集团；BCA 试剂盒，购至武汉博士德公司；聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)，德国 BASF公司生产，购至北京凤礼精求商贸有限责任公司；GTCC英国CRODA公司生产，购至北京 凤礼精求商贸有限责任公司；乙酸乙酯、油酸乙酯均购至北京凤礼精求商贸有限责任公司。 低分子蛋白Marker和预染蛋白Ladder Marker均购至Fermentas公司。仪器设备透射电镜(荷兰PHILIPS公司)；NanOZS90Zeta电位及粒度分析仪(英 国马尔文公司)；SDS-PAGE电泳装置电泳仪(Mini-Protein III)、半干电转仪、酶标仪、洗
12板机均是BIO-RAD公司；ND-1000紫外分光光度计(美国NanoDrop公司)、药物稳定检测箱 等国家免疫制剂技术工程研究中心现有仪器。试验例1 蛋白质模型药物牛血清白蛋白的纳米乳制备及其理化性质检测1.蛋白质模型药物牛血清白蛋白的纳米乳最优处方的筛选油相的筛选选择IPM(CH)、色拉油(C17 22)、乙酸乙酯(C4)、油酸乙酯(C20)、GTCC (C18)、 液体石蜡(C16 C20)等6种不同碳链长短的油，20°C黏度大小依次为液体石蜡(110 230mPas)、GTCC (25. 0 33. OmPas)、色拉油(8. 5mPas)、IPM (5 6mPas)、油酸乙酯 (5. 15mPas)、乙酸乙酯(0. 449mPas)。分别取上述6种油适量，分别置具塞锥形瓶中，加入过 量的牛血清白蛋白，4°C水浴，震摇24h到达平衡。用BCA法测定牛血清白蛋白在各种油相 中的溶解度。结果表明IPM(C14)、色拉油、乙酸乙酯、油酸乙酯、GTCC、液体石蜡分别为 0. 35mg/g、0. 15mg/g、0. 14mg/g、0. 13mg/g、0. 12mg/g、0. 08mg/g，在 IPM 的溶解度最大，为 0.35mg/g。这可能与IPM的碳链长短与黏度有关，有利于药物在油相中的分布和溶解。因 此，选择IPM作为蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的最优化油相。表面活性剂和助表面活性剂的筛选用筛选蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳 油相的方法对表面活性剂吐温80、吐温85、吐温60、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)、聚氧乙烯氢化 蓖麻油(RH40)和助表面活性剂(CoSF)，即司盘80、司盘85、司盘60、以及乙醇、甘油、丙二 醇的同样方法筛选牛血清白蛋白的饱和浓度。在用其较大浓度的表面活性剂和助表面活性 剂，全面设计实验组，按 9 1、8 2、7 3、6 4、5 5、4 6、3 7、2 8、1 9，(SF 和CoSF的质量比)，称取SF-CoSF，加入所选择的油相，涡旋震荡，滴加水，观察各组的变化， 以离心(13，OOOrpm, 30min)稳定性和乳滴粒径为主要的评价标准，从而确定出形成纳米乳 的SF和CoSF。以表面活性剂/助表面活性剂(混合表面活性剂)、油相和去离子水作为等 边三角形的3个顶点，绘制伪三元相图，相图每条边上的点分别表示相应两组分之间的比 例关系，相图任意一点表示相应体系中各组分的质量百分含量。根据油、水、混合表面活性 剂在临界点的质量分数，绘制伪三元相图，确定最大的纳米乳区。纳米乳的评价标准评价标准为制备的液体呈澄清透明或半透明；有蓝色乳光； 高速离心(13000r/m，30min)离心后，稳定不分层；平行光入射后有丁达尔现象；通过透射 电子显微镜和激光粒度仪，检测出乳滴在1 IOOnm之间。若制备的混合液体呈乳白色，平 行光入射后有散射现象，则为乳剂；若澄清透明、稠厚，则为凝胶。同时在相转变过程还会产 生液晶。利用液晶有折光存在，在偏光显微镜检测中，会出现明暗变化，所以往往用其来区 分液晶和凝胶，如发亮为液晶，不发亮的凝胶。对上述表面活性剂与助表面活性剂的溶解度测定结果是牛血清白蛋白在吐温 80、吐温85、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)、司盘80、司盘85、正丁 醇、丙二醇均有较大的溶解度(大于0.2mg/ml)，符合可以制备纳米乳要求。但是根据其最 大的伪三元相图区域，最终确定其表面活性剂与助表面活性剂互配较优组合为吐温80/ 司盘80、吐温85/司盘85、RH40/丙二醇、EL35/丙二醇。2.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳制备根据序贯设计思想，以水、油、SF/CoSF为三相，采用滴定法绘制伪三元相图。选择离心(13，000rpm，30min)稳定，直径在1 IOOnm的纳米乳区为处方候选区。精确称取 处方量的牛血清白蛋白，处方量的表面活性剂与助表面活性剂(表面活性剂与助表面活性 剂为上述筛选出来的4种较优互配组合)，处方量的油相，先加入大约70%的水溶液或缓 冲液，搅拌均勻，最后逐步加入水或缓冲液，即得澄清透明的纳米乳液，部分结果见图1。从 图1可看出，制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳外观淡黄色澄清透明液体。根据 绘制伪三元相图的最终表明制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的最优化处方为 EL35 丙二醇IPM(27% 9% 3% )，牛血清白蛋白浓度4. 5%和生理盐水56. 5%，丙 氨酸5%。以下性能检测如无表明处方均采用的该最优化处方。3.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的形态少量纳米乳适量，用水稀释100倍后，滴在覆有支持膜的铜网上，静止IOmin后用 滤纸片吸干，再滴加2%磷钨酸(pH为7. 4)溶液于铜网上负染3min，自然挥干，用透射电子 显微镜观察并摄制照片，结果见图2。结果表明，纳米乳在电镜下均呈圆球形，内部为油相，见图2从电镜下，随机选取 不少于500个液滴测量粒径，得纳米乳液滴粒径范围在1 lOOnm，平均粒径为21. 8nm。4.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的溶液颜色用蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳最优化处方制备的纳米乳液均为淡黄色 澄清、均一、透明液体，根据《中国药典》(2005年版)II部附录IXA溶液颜色检查法，配制黄 绿色调标准比色液。纳米乳液颜色与黄绿色调1号比色液相比，不得更深。5.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的澄清度根据《中国药典》(2005年版)II部附录IXB澄清度检查法下检查，为澄清的溶液。 经蒸馏水稀释后，即出现明显的淡黄色的乳光。6.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的粒径和粒度分布取模型蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳适量，用适量蒸馏水稀释后用激光粒度测 定仪进行测定，纳米乳的粒径与粒度分布见图3。测定结果图3表明，实验制备的蛋白质模 型药物牛血清白蛋白纳米乳平均粒径21. 81nm。小于50nm的粒子占75% ；小于60nm的粒 子占90%，可见制得的纳米乳载药系统的粒径分布范围窄，粒径比较均勻。7.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的理化性质检测考察了空白纳米乳和模型蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳的黏度(旋转式黏度 计)、折光率(25°C、阿贝折光仪)、电导率(电导率仪)、Zeta电位(电势显微电泳仪)。结 果见表1。从表1结果表明，药物的加入使纳米乳的电导率增加，Zeta电位减小，而黏度和 折光率无明显变化(P > 0. 05)。表1纳米乳的理化性质测定η = 3 (χ士 s)
样品黏;Ι/πιιη2 折光率电导率/mS_1Zeta 电位/mV空白纳米乳5.24±0.041.422±0.0021328±12.530.1&t0.03牛血清蛋白纳米乳5.31±0.051.412±0.0142345±13.824.21±0.01 试验例2 蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的质量检测
1.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的载药量和包封率和测定1)绘制标准曲线①实验方法参照BCA蛋白试剂盒进行根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1 体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混勻。②稀释标准品溶液将冻干的标准品用0. 9% NaCl稀释成2000ug/mL的储存液， 让后 0. 9% NaCl 用将其稀释成浓度分别为:0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000ug/ mL。分别取25u L的稀释不同浓度的标准品溶液的样品分别添加到96孔的微孔中。③各孔加入200u L BCA工作液，充分混勻，盖上96孔板盖，37°C放置30min。④用Nanodrop ND-1000C紫外分光光度计，选择562nm为测定波长，根据吸光度值 与蛋白浓度之间的关系绘制标准曲线。绘制的标准曲线方程，见图4，线性关系良好，标准曲线方程为Y = 0. 0008X+0. 1637 (R2 = 0. 9951，线性方程范围25_1000ug/mL)，具有较高的相关性和较宽的 检测范围，因该检测方法此可用于BCA检测BSA的包封率和载药量。2)蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳蛋白浓度的测定称取制备好的模型蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳和空白的纳米乳各三份，每份 lg(体积约Iml)。将其分别放置在无菌的3mlPE管中，用0. 9% NaCl稀释稀释到牛血清白 蛋白的理论值为250 500mg/ml，然后分别将稀释好的牛血清白蛋白直接用无水乙醇按照 体积比为(1 2)加入后，摇勻使其破乳后，高速离心(13000，30min)，离心后取其上清和沉 淀，其中沉淀用上清液体中相同的体积的0. 9% NaCl进行稀释，用BCA法测定破乳前的上 清液(C游上)和沉淀中的牛血清白蛋白的浓度(C游沉)、破乳后的上清液(C破上)和沉 淀中的牛血清白蛋白的浓度(C破沉)。根据稀释倍数和体积量，各取25uL溶液，添加到96 孔板中，用BSA标准试剂盒检测方法，测定其吸光度值，并将吸光度值代入标准曲线方程， 分别计算出破乳前牛血清白蛋白的在上清液中的质量(M游上)和沉淀中的质量(M游沉)、 破乳后的牛血清白蛋白在上清液(M破上)和沉淀中的牛血清白蛋白的质量(M破沉)。载药量=[(M破沉)+ (M破上)]/M总X 100 %。包封率=[(M破沉)+ (M破上)-(M游上)-(M游沉)]/ [ (M破沉)+ (M破上)]X 100 %其中M总为称取的纳米乳总质量。试验测定三批纳米乳剂的载药量分别为4. 5%,4. 3%,4. 4%平均值为4. 4% ；包 封率分别为98. 3%,97. 5%,93. 5%，其平均值为96. 4%。制备出的牛血清白蛋白具有较大 的载药量，且包封率高达96. 4 %，完全符合纳米乳的质量要求，且解决了目前牛血清白蛋白 的载药量和包封率低的最大问题。2.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的稳定性检测按照《中华人民共和国药典》2000年版附录197页相关规定进行，纳米乳稳定性试 验分为加速稳定性试验及长期稳定性试验两部分。加速稳定性试验取蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳适量3份，分别放置在 4°C、25°C、40°C、6(rC条件下，分别于5、10、30、45、60、90d取样考察，首先对其外观是否发 生明显絮凝、分层、沉淀、乳析、破乳等及载药量、包封率情况进行考察；分别将纳米乳样品 适量装于离心管中，高速离心(13000，30min)，用上述相同的指标观察进行考察。将纳米乳 熔封于5ml安瓿瓶中，放置在自然光照射条件下，分别于l、3、7、10d取样，对其进行外观考
15察，观察是否有浑浊、破乳、分层等现象。长期稳定性试验取蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳适量3份，分别分别放 置在4°C、25°C、40°C、60°C条件下，分别于30d、60d、90d、180d、360d取样考察对其进行外观 考察，观察是否有浑浊、破乳、分层等现象。同时放置室温的30d、60d、180d、360d的蛋白质 模型药物牛血清白蛋白纳米乳和牛血清白蛋白水溶液的样品按照载药量和包封率检测制 备的方法进行处理后的上清液用SDS-PAGE观察牛血清白蛋白降解情况。见图5和图6，制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的外观无明显絮凝、分 层、沉淀、乳析、破乳，且其载药量和包封率为发生明显的改变。这表明制备的蛋白质模型 药物牛血清白蛋白纳米乳具有良好的稳定性。从图6可看出，蛋白质模型药物牛血清白蛋 白纳米乳在室温放置30、60、180、360d均有明显的一条带；而牛血清白蛋白的溶液在30和 60d有明显一条带，且在60d的条带，蛋白质虽然为一条带，但浓度减少，表明蛋白质明显降 解。从图6可看出，制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的稳定性得到较高的提高。3.用电位及粒度分析仪检测蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的稳定性取用蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳最优化处方制备的纳米乳适量，用适量 蒸馏水稀释后用激光粒度测定仪，测定牛血清白蛋白的纳米乳在不同温度下的纳米乳的粒 径，其粒径变化图，见图7和表2。从图7的不同温度下的纳米乳粒径图可看出，随着温度升 高，蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的平均粒径增大，但是当温度大于80°C，其平均粒 径小于30nm，当温度高于80°C，其平均粒径增大变化趋势非常明显，当温度到90°C，其平均 粒径还是小于lOOnm。图7结果表明，蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳非常稳定，可以 室温保存。表2不同温度下的纳米乳粒径
权利要求
一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统，其载药系统组合特征在于0.1％～15％的蛋白质药物、10％～30％的表面活性剂、5％～25％的助表面活性剂、3％～20％的油相、0％～10％的稳定剂，20％～70％的水相；所述表面活性剂为聚山梨酯或聚氧乙烯脂肪酸酯，助表面活性剂为失水山梨醇脂肪酸酯或者C2～C4的一元醇或多元醇，所述油相为食用药用液体石蜡、食用色拉油或有机酸酯，所述水相为蒸馏水，等渗的生理盐水、pH为6.5～7.5磷酸盐缓冲液中的一种或几种，所述稳定剂为甘露醇、甘氨酸和丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统，所述的蛋白质药物 包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胰岛素、肌红蛋白，或者水溶性或难溶性蛋白质类似药 物，所述蛋白质药物浓度范围牛血清白蛋白1 10% ；胰岛素1 5% ；肌红蛋白1 10% ；人血清白蛋白1 10%。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统，所述表面活性剂 为聚山梨酯为吐温-80、吐温-85、吐温60中的一种或几种，聚氧乙烯脂肪酸酯为聚氧乙烯 氢化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油中任一种或其组合；其有效量分别为吐温-80 10 30%、吐 温-85 10 30%、吐温60 5 30%、聚氧乙烯氢化蓖麻油10 30%、聚氧乙烯蓖麻油 10 30%。
4.根据权利要求2所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统，所述助表面活性剂 为失水山梨醇脂肪酸酯是司盘85、司盘80和司盘60中的任一种及一种以上组合；C2 C4的一元醇或多元醇为无水乙醇、正丁醇、甘油、1，3_ 丁二醇、1，3_丙二醇中的任一种；其 有效量分别为司盘-85 5 15%、司盘80 5 15%、司盘60 5 10% ；无水乙醇5 10% ；甘油5 10% ；1，3-丙二醇5 10% ；1，3-丁二醇5 10%，正丁醇5 10%。
5.根据权利要求3所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统，表面活性剂与助表 面活性剂的互配组合为吐温80/司盘80、吐温85/司盘85、聚氧乙烯氢化蓖麻油/丙二醇、 聚氧乙烯蓖麻油/丙二醇。
6.根据权利要求1 4任一所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统，所述的有 机酸酯是IPM、油酸乙酯、乙酸乙酯、GTCC中的任一种，其中油相的有效量分别为IPM :10 20%、油酸乙酯5 20%、乙酸乙酯10 20%、GTCC :3 15%、药用液体石蜡5 15%、 食用色拉油5 15%;所述稳定剂的有效量分别为甘露醇1 10%、甘氨酸1 10%、 丙氨酸1 10%。
7.根据权利要求6所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统，蛋白质模型药物牛 血清白蛋白4.5%、聚氧乙烯蓖麻油27%、丙二醇9%、肉豆蔻酸异丙酯3%、等渗的生理盐 水56. 5%，丙氨酸5%。
8.根据权利要求1 7任一所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统，用水或缓 冲液无限稀释，粒径在1 IOOnm范围。
9.权利要求1 7任一所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统的制备方法，具 体包括下列步骤1)按配方称取蛋白质药物、表面活性剂、助表面活性剂、油相、稳定剂、水相备用；2)将所述量的表面活性剂与蛋白质药物混勻且使蛋白质药物部分溶解；3)再加入所述量的助表面活性剂让蛋白质药物在4°C下完全溶解，得到澄清的溶液；4)再加入所述量的油相和稳定剂，搅拌下缓慢加入处方量70%水相，得到澄清的溶液；5)最后再加入余量水相，混勻，得到澄清透明的纳米乳。
10.根据权利要求9所述的制备方法，所述步骤(2)的混勻为4°C下，转速为50 IOOr/ m ；所述步骤⑷中的搅拌是25°C 37°C下恒温水浴，转速为100 200r/m ；所述制备方法 中还包括纳米乳的除菌、检测和包装步骤，所述除菌为用0. 2 μ m微孔滤膜过滤。
全文摘要
本发明的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统及其制备方法，主要用以标准蛋白质模型药物牛血清白蛋白等为药物模型，制备出了蛋白质药物的纳米乳载药系统。其组合特征在于0.1％～15％的蛋白质药物、10％～30％的表面活性剂、5％～25％的助表面活性剂、3％～20％的油相、0％～10％的稳定剂，20％～70％的水相。本发明的蛋白质药物纳米乳载药系统可较大提高蛋白质药物的稳定性，保留良好免疫学与生物学活性，载药量大、包封率高、制备工艺简单、成本低廉、安全无毒、无有机溶剂残留、便于运输和储存，较好地解决目前蛋白质药物存在的稳定性差、药效容易丧失、载药量和包封率低、制备工艺复杂和有机溶剂残留、毒性大等问题。
文档编号A61K38/28GK101961314SQ20101029208
公开日2011年2月2日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者刘唯, 刘开云, 孙红武, 张卫军, 毛旭虎, 邹全明, 郭刚 申请人:中国人民解放军第三军医大学