专利名称：检测甲型h1n1病毒抗原的免疫检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及利用基因工程技术制备的DNA疫苗，及 由其制备的单克隆抗体和免疫检测试剂。
背景技术：
血凝素(hemagglutinin HA)是流感病毒的主要外膜蛋白，HA具有免疫原性，能使 人体产生保护性抗体，但其容易变异，是流感流行的原因。制备针对流感病毒血凝素蛋白特 异性单抗和多抗是流感病毒蛋白分型检测的基础，目前针对HA的抗体制备采用常规的蛋 白免疫方法，其中王慧娟等⑴在昆虫杆状病毒中表达甲型Hmi的HA蛋白用于免疫抗原和 筛选抗原。张祥斌等2(ChineseVeterinary Science 2008. 38(11) :962-967)用大肠杆菌 表达猪流感的HA经纯化用于免疫抗原和筛选抗原。关于甲型Hmi的HA为目标的流感分型检测试剂盒目前还未见报道，现有的文献 工作仅仅局限于抗体制备上，目前检测试剂主要存在问题在于由于ELISA试剂局限性，而 临床样本(主要咽拭子)病毒含量极低，低于ELISA试剂的检测限，无法检出。如将病毒接 种细胞培养可检出病毒。该试剂如配合病毒培养可大大改善对临床样本的检出。
发明内容
本发明的一个目的在于提供含有甲型Hmi病毒血凝集素蛋白DNA序列的重组表 达载体和由其表达的针对甲型Hmi病毒抗原的DNA疫苗。本发明的另一个目的在于提供一种杂交瘤细胞，以上述甲型Hmi病毒DNA疫苗免 疫小鼠后制备得到。本发明的又一个目的在于提供一种针对甲型Hmi病毒抗原的单克隆抗体，由上 述杂交瘤细胞制备。本发明的再一个目的在于提供一种免疫诊断试剂。根据本发明的一方面，本发明提供针对甲型Hmi病毒抗原的DNA疫苗，通过将合 成的甲型HlNl流感病毒A/California/04/2009HA基因(序列如SEQ IDN0. 1所示)插入 ρ⑶NA3. 1 (+)载体多克隆位点(如附图1)构建含有甲型Hmi病毒DNA序列的重组表达载 体ρ⑶NA3. 1/SF-HA载体，提取重组质粒DNA，即获得甲型Hmi病毒DNA疫苗。根据本发明的另一方面，本发明提供针对甲型Hmi病毒抗原的单克隆和多克隆 抗体，用上述甲型Hmi病毒DNA疫苗免疫小鼠，取其脾脏细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合 后制备杂交瘤细胞，筛选杂交瘤细胞，获得表达稳定分泌单克隆抗体，二株筛选出来具有对 甲型Hmi流感病毒高特异性，且表达稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为2B1和 3G4，于2010年9月27日提交到中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC C201095和CCTCCC201096。培养上述2B1和3G4细胞株，制备单克隆抗体，纯化并鉴定，其 分别属于IgGh亚类和IgGl亚类。用上述甲型Hmi病毒DNA疫苗免疫动物，例如兔，制备多克隆抗体。
根据本发明的又一方面，提供检测甲型Hmi病毒抗原的免疫学方法和免疫检测 试剂，这样的检测法通常包括一个或多个能够识别和结合甲型Hmi病毒抗原的抗体，并且 可以在本领域技术人员公知的各种免疫学测试法中实现，包括但不限于各种类型的放射免 疫实验、酶联免疫吸附实验(ELISA)、酶联免疫荧光实验(ELIFA)等。在本发明的一个优选实施方案中，提供一种使用ELISA方法检测甲型Hmi病毒抗 原的免疫检测试剂。本发明进一步提供为以上的检测应用的试剂盒。试剂盒中包含酶联免疫所需的针 对甲型Hmi病毒抗原的单克隆和多克隆抗体，试剂盒也包含与抗原或抗体结合的酶结合 物和/或含报告分子的试剂，所述报告分子例如生物素结合蛋白质、例如抗生物素蛋白或 链霉素抗生物素蛋白，例如酶、荧光素或放射性同位素标记物。此外，试剂盒中还包含阳性 和阴性对照物以及其他必要时可以包含在其中的缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器和试剂 盒的使用说明书。本发明在抗体制备的基础上利用生物素-亲和素放大系统进一步研制特异性检 测甲型HmiELISA检测试剂盒，直接用DNA疫苗做免疫原，筛选抗原用WHO提供的甲型Hmi 裂解疫苗株3(上海生物制品所提供)。其优点在于1)在单抗制备上利用核酸疫苗进行免疫，避免了用全病毒蛋白做基础免疫蛋白 成分过多、过杂的缺点，大大提高了免疫效率。同时，核酸疫苗在动物真核细胞中表达也避 免了用基因表达单一抗原免疫造成许多空间位点缺失的缺点。同时用全病毒甲型Hmi疫 苗株3做筛选抗原，普通流感裂解疫苗Hmi/H3N1 (购自赛诺菲巴斯德公司)做对照筛选抗 原，该方法获得抗单一组分蛋白(HA)特异性好、亲和力高的单抗细胞株和多克隆抗体，这 为后面免疫检测提供了质量非常好的抗体来源，对试剂盒灵敏度和特异性的提高起了关键 的作用。2)DNA免疫较常规蛋白免疫强而持久，因此用DNA免疫制备单克隆抗体和多克隆 抗体可以省时省力。3)检测方法上用生物素-亲和素放大系统，大幅度提高提高试剂的灵敏度。
图1为pcDNA3. 1 (+)载体结构图。生物材料的保藏分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为2B1和3G4，于2010年9月27日提交到中 国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC C201095和CCTCC C201096。
具体实施例方式以下实施例以举例的方式描述本发明，其不应视为对本发明的限制。所使用的实 验材料如无特别说明，均为市售购买。实施例1DNA疫苗的制备甲型 Hmi 流感病毒 A/California/04/2009HA 基因序列如 SEQ ID NO. 1 所示， HA序列经上海生工合成后双酶切OChoI/Apal)插入ρ⑶NA3. 1 (+)载体多克隆位点，构建成 pCDNA3. 1/SF-HA 载体。
质粒DNA的大量制备按照QIAGEN公司生产的QIAGEN Plasmid Maxi Kit的步骤，提取重组质粒DNA， 将所得DNA溶于TE溶液，在紫外分光光度计上测定所制备的质粒DNA的0D260值和0拟80 值，按照计算DNA的纯度及浓度的公式算出DNA的纯度和浓度。根据其初始浓度稀释至终 浓度为ι μ g/ μ ι，作电泳鉴定，其余置-20°c冰箱保存备用。实施例2鼠抗Hmi病毒抗原单克隆抗体的制备1.免疫方法和稈序免疫途径采用股四头肌肌肉注射法，每只6-8周龄BALB/c小鼠注射DNA的量为 50 μ g，注射后在接种位点两侧5mm加入正反各3次的电击(100V电压，电击时间为50ms)， 初次免疫后3周进行加强免疫一次。2.单抗制备2. 1细胞融合2. 1. 1处死小鼠，无菌操作下取出脾脏，将脾脏放于5ML RPMI-1640的培养皿中 (不加血清)，切成2半，然后用灭菌器材将细胞挤压出来。2. 1. 2将细胞吸到1支无菌塑料管中，静置5分钟使组织块沉降下来，将细胞移入 另一支无菌试管并于300XG离心10分钟。2. 1. 3洗下培养中SP2/0 (Agl4)细胞在同样的离心机中沉淀。2. 14将此2个沉淀悬浮在5ml RPMI-1640 (不加血清)中，彼此混合并在300XG离 心10分钟。2. 15轻轻敲打管子使沉淀分散，并置管于37°C水浴。2. 16将预热的50%聚乙二醇(PEG)和RPMI-1640 (不加血清)带到准备融合的操 作箱内。2. 17于1分钟内在细胞沉淀中滴加入0. 8ml 50% PEG。保持37°C，立即滴加入 2ml预热的RPMI-1640 (无血清)，12分钟左右，然后在3分钟内加入8mlRPMI_1640。2. 18细胞在300XG离心10分钟。轻轻悬浮在所需容量的RPM_1640_20% FCS中， 并接种到96孔板上。。2. 19培养板置于37 °C 5 % C02孵温箱内培养，24小时后，每孔加入等体积的 RPMI-1640-2XHAT-20% FCS培养液。然后培养板放在孵温箱内直至出现杂交瘤细胞集落， 早期杂交瘤细胞培养物。直至集落达2-3MM时需要筛选上清液中抗体的活性。经鉴定适合 于进一步克隆的杂交瘤细胞，用无菌巴斯德管吸出于M孔培养板中并进一步克隆。直至形 成稳定的分泌抗体的细胞株。2. 2细胞株筛选全病毒甲型Hmi疫苗株3包被进行ELISA筛选，同时用普通流感 裂解疫苗Hmi/H3N1 (购自赛诺菲巴斯德公司)做对照筛选抗原，筛选出单抗只是特异性针 对甲型Hmi病毒反应，与普通流感不反应。用这种方式我们筛选到亲和力高特异性好的两 株抗甲型Hmi流感病毒抗原的单克隆抗体，分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为2B1和 3G4，于2010年9月27日提交到中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC C201095 和 CCTCC C201096。2. 3单抗制备每株细胞扩大培养注射到降植烷处理BALB/C小鼠腹腔制备腹水， 经PROTEIN-Α亲和纯化，抗体纯度用SDS-PAGE鉴定，要求上样蛋白质在25KD和50KD出现清晰两条带。纯度在90%以上。克隆编号及亚类如表1 表1 克隆编号和对应的亚类
权利要求
1.一种重组表达载体，含有如SEQ ID NO. 1所示的甲型Hmi流感病毒血凝集素蛋白基因。
2.权利要求1所述的重组表达载体，其中将如SEQID NO. 1所示的甲型Hmi流感病毒 血凝集素蛋白基因插入PCDNA3. 1(+)载体的多克隆位点而构建。
3.针对甲型Hmi流感病毒抗原的DNA疫苗，由权利要求1所述的重组表达载体产生。
4.杂交瘤细胞，由权利要求3所述的DNA疫苗免疫小鼠制备，其保藏号为CCTCC C201095。
5.针对甲型Hmi流感病毒抗原的单克隆抗体，由权利要求4所述的杂交瘤细胞制备。
6.针对甲型Hmi流感病毒抗原的多克隆抗体，由权利要求3所述的DNA疫苗免疫动物 制备。
7.一种免疫检测试剂，包含权利要求5所述的针对甲型Hmi流感病毒抗原的单克隆抗体。
8.权利要求7所述的免疫检测试剂，其进一步包含权利要求6所述的针对甲型Hmi流 感病毒抗原的多克隆抗体。
9.一种试剂盒，包含权利要求7所述的免疫检测试剂。
10.检测样本中甲型Hmi流感病毒抗原的方法，包括将待测样本与权利要求7所述的 免疫检测试剂接触，根据检测结果判断样本中是否存在甲型Him流感病毒抗原的步骤。
全文摘要
本发明提供含有甲型H1N1病毒血凝集素蛋白DNA序列的重组表达载体和由其表达的针对甲型H1N1病毒抗原的DNA疫苗，将合成的甲型H1N1流感病毒HA基因插入质粒载体构建含有甲型H1N1病毒HA基因序列的重组表达载体，提取重组质粒DNA，即获得甲型H1N1病毒DNA疫苗，用甲型H1N1病毒DNA疫苗免疫小鼠，制备单克隆抗体，本发明也提供检测甲型H1N1病毒抗原的免疫学方法和免疫检测试剂，本发明获得特异性好、亲和力高的单抗细胞株和多克隆抗体，由此制备的免疫检测试剂灵敏度好、特异性高。
文档编号A61K48/00GK102041265SQ20101050155
公开日2011年5月4日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者严兵, 陈建军 申请人:中国科学院武汉病毒研究所