专利名称：地衣芽孢杆菌菌粉及微生态制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)的制备及应用。
背景技术：
专利号为92113318. 9的中国专利(授权公告号CN 10443MC，授权公告日1999 年7月观日)公开了一种地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) 63516株(其微生物 保藏号是CGMCC NO 0183)生态制剂的制备方法。该专利提供的制备地衣芽孢杆菌生态制 剂的技术方案是菌种经在PH为7. 2-7. 4的肉汤培养基内培养18-Mh，制成种子液，在PH 为7. 2-7. 4的琼脂培养基内对种子液进行扩大培养48h，制成菌苔液；收集菌苔液，放入离 心瓶中离心，获得湿菌泥；按1 5的重量比在菌泥中加入无水碳酸钙，并在65°C的烤箱内 烘烤，脱水干燥制成原菌粉；然后在原菌粉中加入重量比为1 9药用乳糖和药用淀粉稀 释，制成成品粉。在实际生产过程中，通用的制备地衣芽孢杆菌菌粉(即上述专利中所述的原菌 粉，在药典中统称为菌粉)的方法如下启开存放地衣芽孢杆菌冻干菌的安瓶，加入少量营养肉汤培养基，将溶解的冻干 菌种菌悬液摇勻后加入到温度为37°C的肉汤培养基内培养Mh(小时)；取培养所得的菌液 接种到温度为37°C的琼脂培养基上，培养Mh ；从琼脂培养基上选取优势菌落，经斜面种子 制备后接种到盛有营养肉汤培养基的三角瓶中，在温度为37°C，转速为145-155转/分的恒 温振荡箱内进行摇瓶培养6 8h，制备成种子液；对种子液进行发酵培养20-4 ,离心制得 湿菌体(即上述专利中所述的湿菌泥)；在湿菌体中加入5-8倍重量的无水碳酸钙，混合后 在烤箱或热风循环烘箱中干燥，制成菌粉。上述现有技术的缺点在于，第一、获得的活菌数少；第二、生产周期长，耗能高，生 产成本高；第三、生产效率低，工作量大。
发明内容
为解决活菌数少；生产周期长，耗能高，生产成本高；生产效率低，工作量大的问 题，本发明提出新的地衣芽孢杆菌菌粉及微生态制剂的制备方法。本发明涉及一种地衣芽孢杆菌菌粉的制备方法，包括菌种选育、发酵、离心、干燥， 制备菌粉。在进行菌种选育前，对地衣芽孢杆菌冻干菌菌种进行温度梯度复苏培养，所述温 度梯度复苏培养分为至少两个温度梯度复苏阶段，其中第一温度梯度复苏阶段为菌种的恢 复适应期，温度为25 士 1°C，培养时间为池以上，最后一个温度梯度复苏阶段为菌种的繁殖 期，温度为37士 1°C，培养时间为6_12h。优选地，所述温度梯度复苏培养包括三个温度梯度复苏阶段，在该三个温度梯度 复苏阶段，温度梯度依次为25 士 1°C、30 士 1°C、37 士 1°C，培养时间依次为2 乩、2 8h、 6 1 所述培养基的PH为7. 0-7. 4。采用温度梯度复苏培养，可使地衣芽孢杆菌逐步适 应最终的培养温度，激活菌体内的酶的活性，进而提高菌体的新陈代谢速度，加快菌体繁殖
3速度。进一步地，所述菌种选育包括在恒温振荡箱中制备种子液，在制备种子液时，所用 的培养基的PH为7. 0-7. 4，培养时间为2-他。恒温振荡箱勻速转动，可使菌体与空气和营 养液充分接触，能够为菌体的生长提供充足的营养，进而加快菌体的生长繁殖速度。进一步地，所述发酵工艺在发酵罐中进行，温度37 士 1°C，罐压0. 02 0. 04MPa,时 间12 3 发酵终点为芽孢形成率达到70%以上。在发酵罐中通入一定量的空气，使菌体 与空气能够充分接触，促进菌体生长。进一步优选地，制备菌粉时，湿菌体与无水碳酸钙的比例1 3 7，优选1 3， 在60士2°C的热风循环烘箱中干燥0. 5-2h。进一步地，可将所述菌粉作为制备人用、兽用或者农用地衣芽孢杆菌微生态制剂 的原料。在制备地衣芽孢杆菌人用微生态制剂时，药用乳糖和药用淀粉的比例为3 7， 混合均勻后加入适量乙醇，均勻混合后制成湿颗粒，在温度为60-100°C的干燥机内干燥 l-2h。
具体实施例方式本发明的制备工艺如下1、培养基的配制(1)营养肉汤培养基蛋白胨1.0%、牛肉膏0.5%、氯化钠0. 5 %溶于纯化水，用氢 氧化钠调PH7. 0 7. 4。(2)营养琼脂培养基蛋白胨1. 0%、牛肉膏0. 5%、氯化钠0. 5%、琼脂粉1. 6%溶 于纯化水，用氢氧化钠调PH7. 0 7. 4。2、地衣芽孢杆菌冻干菌的复苏2. 1、启开冻干菌种存放的安瓶(打开前对菌种管外壁进行消毒，一般采用浓度为 70%的酒精棉)，用吸管将少量营养肉汤培养基(约0. 3ml)注入其中，并将其中溶解的冻干 菌种菌悬液摇勻。2. 2、在200 500ml三角瓶内加入适量(约50 100ml)营养肉汤培养基，将上 述菌悬液全部倒入三角瓶。将其放置在培养箱中，按如下温度25 士 1 °C、30 士 1 °C、37 士 1 °C分 别培养2 6h、2 8h、6 12h。2. 3、显微镜下革兰氏染色镜检观察地衣芽孢杆菌菌种的生长情况，第一梯度阶段 应有分散的地衣芽孢杆菌出现，菌种处于恢复适应期。第二梯度阶段有均勻的单个菌链状 排列出现，菌种逐步适应后开始进入繁殖阶段。第三梯度阶段该菌多数为链状排列，菌种处 于旺盛的生长期，其间或有少量散在的该菌出现，并不得有或少许有形成芽孢的该菌(数 量应在10%以内)，否则，废弃。2. 4、暂不接种的复苏后的菌种应置于试管斜面上，密封后置入冰箱4 8°C中保藏。在对菌种进行温度梯度复苏时，除了上述描述的分为三个温度梯度阶段外，还可 分为两个、四个或更多个温度梯度阶段，只要达到这样的条件就行，即菌种在第一梯度阶段 处于恢复适应期，温度为室温即25士 1°C，培养时间在以上，最后进入繁殖阶段，温度为
437士 1°C，培养时间为6-12h。3、菌种选育3. 1、从复苏后的菌种中选择优势菌落(1)、用上述复苏后的菌液在营养琼脂平板上划线，在温度37士 1°C下培养16 24h。(2)、在平板上选择浅灰白色不透明、呈扁平略显圆形、边缘不整齐的单菌落革兰 氏染色，在显微镜下观察应为革兰氏阳性杆菌并层状或链状排列整齐、菌体大小均勻、形态 一致。挑取单菌落进行生化反应特性鉴定，应符合地衣芽孢杆菌的特征应能发酵D-葡萄 糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露醇，水解淀粉，液化明胶，VP反应阳性，否则，废弃。3. 2、斜面种子制备(1)、在试管或茄瓶内的营养琼脂培养基表面上进行菌种传代培养。在温度 37 士 1°C下培养16 24h。O)、挑取试管或茄瓶内的菌体，进行革兰氏染色在显微镜下观察，应无杂菌，该菌 体应大小均勻、形态一致、层状排列较整齐、多为芽孢状态，否则，废弃。(3)、暂不接种的斜面种子应置于冰箱4 8°C中保藏。3. 3、摇瓶种子液制备(1)、挑取上述斜面菌种的菌落，接种在盛有600_3000ml营养肉汤培养基的 3000-5000ml三角瓶中进行摇瓶培养，培养基PH7. 0-7. 4，在温度为37°C，转速为145-155转 /分，优选为150转/分的恒温振荡箱内培养2 他。O)、显微镜下革兰氏染色观察摇瓶种子液培养情况，应纯菌生长、多数为链状排 列(或网状)间有少量散在的该菌，并不得有或少许有形成芽孢的该菌(数量应在10%以 内)，否则，废弃。(3)、暂不接种上罐的种子液应密封置入冰箱4 8°C中保藏。4、发酵培养4. 1、在500-1000L种子罐内加入配制的营养肉汤培养基，PH7. 0-7. 4，通入蒸汽实
罐灭菌。4. 2、将经纯菌检查合格的种子液接种在种子罐内并通入无菌压缩空气搅拌培养， 温度37士 1°C，罐压0. 02 0. 04MPa，时间2 8h。4. 3、显微镜下革兰氏染色观察种子罐种子液培养情况，应纯菌生长、多数为链状 排列(或网状)间有少量散在的该菌，并不得有或少许有形成芽孢的该菌(数量应在10% 以内)，否则，废弃。4. 4、将上述种子罐内的种子液移入1-5个1000-10000L发酵罐内，通入无菌压缩 空气继续扩大培养，温度37士 1°C，罐压0. 02 0. 04MPa,时间10 ^h。观察芽孢形成情 况，发酵终点芽孢形成率应在70%以上。5、离心将芽孢形成率大于70%的发酵罐中的发酵液用高速离心机分离，离心速度为 80 士 aiil/秒，收集湿菌体。6、干燥将湿菌体与100-500目的无水碳酸钙按1 3 7的比例混合，优选200目的无水碳酸钙，在60士2°C的热风循环烘箱中干燥0. 5-浊，干燥后水分应< 3. 0%。7、制菌粉将干燥后的湿菌体放入粉碎机中过100目粉碎得菌粉。然后取样对菌粉进行活菌数测定和杂菌检查活菌数应在每克100亿活菌以上； 不得检出大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和志贺菌等致病菌；非致病 性杂菌数应< 500个/g ；真菌应< 100个/g。8、包含地衣芽孢杆菌的人用微生态制剂的制备将药用乳糖和药用淀粉按3 7的比例称量，置于混合机内先干混15分钟，使二 者混合均勻，加入适量浓度为50%乙醇继续混合10分钟后，使三者均勻混合，得到湿润的 混合物，并将其用16目筛制成湿颗粒，将湿颗粒置沸腾干燥机内在温度60-100°C下进行 干燥，干燥l_2h，干燥后水分应< 5.0% ；根据菌粉的活菌数，按微生态制剂中活菌数每克 ^ 1. 5X109CFU，计算菌粉的投料量，将菌粉与空白颗粒置于三维混合机中，混合均勻制成 菌粉的微生态制剂。8'、包含地衣芽孢杆菌的兽用微生态制剂的制备利用按步骤1-7所列的制备方法制成的地衣芽孢杆菌菌粉制备兽用微生态制剂。8〃、包含地衣芽孢杆菌的农用微生态制剂的制备利用按步骤1-7所列的制备方法制成的地衣芽孢杆菌菌粉制备农用微生态制剂。实施例1、启开一份地衣芽孢杆菌冻干菌63516株(其微生物保藏号是CGMCC NO 0183)，均分为五份，分别标记为A、B、C、D和E。对A进行温度梯度复苏培养，各梯度阶段温度依次为25 士 1°C、30 士 1°C、37 士 1°C， 依次对应的培养时间分别是4h、4h、12h ；选取三组特征近似的优势菌落，分别标记为1、2和 3，经过摇瓶种子液和发酵培养时间不完全相同的培养后，对发酵液进行离心后得湿菌体; 将湿菌体和无水碳酸钙按1 3的比例混合后干燥，制成菌粉，得到的结果如表1所示。其 中，培养过程中所用培养基的PH为7. 0-7. 4。表1
权利要求
1.一种地衣芽孢杆菌菌粉的制备方法，包括菌种选育、发酵、离心、干燥及制菌粉工艺 步骤，其特征在于，在进行菌种选育前，对地衣芽孢杆菌冻干菌菌种进行温度梯度复苏培 养，所述温度梯度复苏培养分为至少两个温度梯度复苏阶段，其中第一温度梯度复苏阶段 为菌种的恢复适应期，温度为25士 1°C，培养时间为池以上，最后一个温度梯度复苏阶段为 菌种的繁殖期，温度为37士 1°C，培养时间为6-12h。
2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，所述温度梯 度复苏培养包括三个温度梯度复苏阶段，在该三个温度梯度复苏阶段，温度梯度依次为 25士 1°C、30士 1°C、37士 1°C，培养时间依次为 2 6h、2 8h、6 12h。
3.根据权利要求1或2所述的地衣芽孢杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，所述菌种选 育包括在恒温振荡箱中制备种子液，在制备种子液时，所用的培养基的PH为7. 0-7. 4，培养 时间为2-8h。
4.根据权利要求1或2所述的地衣芽孢杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，所述发酵工 艺在发酵罐中进行，温度37 士 1°C，罐压0. 02 0. 04MPa，时间12 36h。
5.根据权利要求1或2所述的地衣芽孢杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，制备菌粉 时，湿菌体与无水碳酸钙的比例1 3 7，在60士2°C的热风循环烘箱中干燥0.5-池。
6.根据权利要求5所述的地衣芽孢杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，所述湿菌体与 所述无水碳酸钙的比例为1 3。
7.一种包含地衣芽孢杆菌的人用微生态制剂的制备方法，其特征在于，先按3 7的 比例混合药用乳糖和药用淀粉，然后加入适量乙醇，均勻混合后制成湿颗粒，接着将所述湿 颗粒放在温度为60-100°C的干燥机内干燥l_2h，最后将干燥的空白颗粒与根据权利要求1 至6中任意一项所述的方法制备的菌粉按一定比例混合制成微生态制剂成品。
8.一种包含地衣芽孢杆菌的兽用微生态制剂的制备方法，其特征在于，利用根据权利 要求1至6中任意一项所述的方法制备地衣芽孢杆菌菌粉。
9.一种包含地衣芽孢杆菌的农用微生态制剂的制备方法，其特征在于，利用根据权利 要求1至6中任意一项所述的方法制备地衣芽孢杆菌菌粉。
全文摘要
本发明涉及地衣芽孢杆菌的制备及应用。为解决现有技术中培养地衣芽孢杆菌时获得的活菌数少；生产周期长，耗能高，生产成本高；生产效率低，工作量大的问题，本发明提出新的地衣芽孢杆菌菌粉及微生态制剂的制备方法，在该方法中，先对地衣芽孢杆菌冻干菌菌种进行温度梯度复苏培养，然后进行菌种选育、发酵、离心、干燥，制备菌粉，再以所制得的菌粉为原料制备微生态制剂。对地衣芽孢杆菌冻干菌菌种进行温度梯度复苏培养，可使其逐步适应最终的培养温度，同时激活菌体内的酶的活性，进而提高菌体的新陈代谢速度，加快菌体繁殖速度，从而提高培养所获得的活菌数，缩短生产周期，提高生产效率。
文档编号A61K35/74GK102120972SQ201010578718
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者张守真, 郑燕鹏 申请人:北京顺达四海生物药业有限公司