专利名称：赖氨酸化合物和其在肽和蛋白质的位点选择性和化学选择性修饰中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及肽和蛋白质的位点选择性和化学选择性修饰。特别是，本发明提供了可以用作所述肽和蛋白质的结构单元(building block)的新的硫代赖氨酸和硒代赖氨酸化合物。因此所包括的赖氨酸残基随后可以用作与功能物质缀合的靶位点，然后通常将所述功能物质转移到硫代或硒代赖氨酸残基的ε或α胺中。本发明还涉及对选定的肽或蛋白质序列进行位点选择性和化学选择性修饰的这些方法，以及在这些方法的各自步骤中所获得的中间物和终产物。
背景技术：
蛋白质的共价位点特异性修饰是生物系统的关键过程。在包括蛋白质定位和运输、信号转导、转录调节以及靶向蛋白质破坏在内的细胞过程中，酶促修饰(如磷酸化、 糖基化、硫酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、异戊烯化、SUMO化(sumoylation)、类泛素化 (neddylation))发挥决定性作用。在蛋白质表面再现天然修饰对于研究它们的功能具有无法估量的价值。已经证明，位点特异性共价添加至蛋白质和肽的“非天然”部分，如荧光团、亲和标记、自旋标记探针、放射性标记和其他(生物正交)官能团，可用于体内和体外的多种应用和过程。随着在生物相容合成有机化学中的进展，已经展开充满机会的全新的领域，从而为连接组分的类型以及连接反应的选择提供高度多样性。化学连接涉及第一化学组分与第二化学组分的化学选择性共价连接。可以使用存在于蛋白质或肽以及第二连接组分上的独特的相互反应性官能团来使连接反应具有化学选择性。然而，由于存在于典型蛋白质中的官能度的种类和数量，研发选择性修饰蛋白质或肽的有效方法仍然是一项挑战。通常期望或需要位点特异性地修饰蛋白质，以使缀合的官能度与蛋白质或肽的固有属性进行最佳组合。因此，为了以受控的选择性方式使用此类修饰蛋白质，经常需要独特的、生物正交的化学柄(handle)或连接位点，用于将期望的分子与其连接或缀合。大多数产生生物缀合物的方法利用蛋白质表面上的胺(赖氨酸侧链和N末端)或硫醇(半胱氨酸侧链)的亲核性。对于蛋白质的位点特异性修饰，已经提出了许多方法，包括设计蛋白质的所有赖氨酸残基被置换的突变体或设计蛋白质除一个外的所有半胱氨酸残基被置换的突变体，以便将修饰位点限制为单个位置。激活的酸，如N-羟基琥珀酰亚胺酯，可以用于靶向胺；然而，蛋白质通常含有多个胺，甚至与赖氨酸侧链相比，蛋白质的氨基末端的PKa降低，这种标记通常是非特异性的。为了克服这一问题，研究人员已经研发除去所有表面赖氨酸的蛋白质靶。研究人员对肿瘤坏死因子-a (TNF-α)进行噬菌体展示选择来研发无任何赖氨酸的蛋白质，从而使得N末端剩余的单个胺位点特异性聚乙二醇化(PEGylation)。与随机标记的野生型TNF-α相比，研发的仅在N末端具有修饰的TNF-α的稳定性和生物活性获得改善。通常，在几乎所有位点置换给定类型的氨基酸的大规模氨基酸取代与蛋白质活性减少的缺陷有关。半胱氨酸标记通常比胺标记更具特异性，因为硫醇基更具亲核性，且可以通过定点诱变引入单个半胱氨酸而不影响蛋白质的功能。用小分子连接的马来酰亚胺、α-卤代酮或优先与硫醇反应的其他亲电子基团标记通过诱变引入的半胱氨酸。然而，单独的基于半胱氨酸的方法不能对蛋白质进行多重修饰(如引入用于荧光共振能量转移(FRET)分析的两个荧光团)，除非当两个半胱氨酸的反应性非常不同，且并不是所有的蛋白质靶标都允许引入半胱氨酸而不削弱功能。靶向存在于天然氨基酸额外的官能度的其他方法被认为有益地丰富了化学家进行蛋白质修饰的工具箱。Francis 和合作者(J. Am. Chem. Soc. 2004，126，10256)已经确定了特异性靴向色氨酸和酪氨酸残基的反应。利用铑卡宾体(rhodium carbenoid)可以实现色氨酸中吲哚官能度的修饰(在N-I或C-2处)。当应用于肌球蛋白或枯草杆菌蛋白酶(subtilising) Carlsberg (分别具有2个和1个色氨酸)时，修饰无一例外地以约50-60%的产率发生在色氨酸残基处。尽管该系统需要助溶剂来使有机试剂溶解，但是预期该助溶剂(乙二醇) 不使蛋白质靶变性。更显著的化学限制是需要使大多数蛋白质变性以及使肌球蛋白的血红素基丢失的非常低(1.5-3.5)的pH。尽管重建肌球蛋白的方法可能恢复蛋白质的结构，但是这些极端的条件会与许多靶标不相容。然而，结果确实表明，过渡金属复合物可以用于蛋白质中芳族残基的特异性生物缀合。Francis 和合作者(J. Am. Chem. Soc. 2004，126，15942)还描述了利用 ρΗ6· 5 的醛和苯胺选择性靶向酪氨酸的Mannich类型反应(Mannich_type reaction)。通过将荧光团连接于苯胺，实现了罗丹明与胰凝乳蛋白酶原A的缀合而不改变蛋白质的活性。不同酪氨酸的相对表面可及性允许对特定酪氨酸残基的选择性；对于胰凝乳蛋白酶原A而言，优先靶向三个表面酪氨酸中的一个。一些策略利用非天然存在的官能团。这类氨基酸可以通过包括全合成、通过连接合成片段和生物表达片段的半合成、转移反应等的方法引入。这些非天然存在的功能性生物正交基团的存在，使得可能单独靶向而无与天然存在的氨基酸侧链基团的非有意的交叉连接或其他反应。一个实例包括在蛋白质中可控地引入叠氮化物作为生物正交连接柄。已经证明可用于这方面的反应是Siarpless改良的炔和叠氮化物的Huisgen环化。在催化量的Cu(I) 的存在下，该环化化学选择性地发生，产生1，4_ 二取代三唑环。对于炔和叠氮化物而言，未观察到与常见生物学官能团的交叉反应性，并且这两种基团在生物学条件下都是稳定的。 该反应已用于范围从细胞表面病毒颗粒和蛋白质的修饰到小分子活性探针标记的碳水化合物结合蛋白和细胞蛋白质鉴定的应用。根据上述显而易见的是，尽管对选择性修饰的蛋白质有特别的兴趣，但是当前可用的每种技术都受累于具体的弊端。除了所述技术之外，通常非常缺乏可用且灵活的方法。 因此，仍然需要提供选择性(生物正交)连接柄的其他化学策略，以便补充或扩展来自生物学的方法。本发明的目的就是提供这样的策略。发明概述本发明提供了新的通常可应用的对肽和蛋白质进行位点选择性和化学选择性修饰的方法，其特别快速、灵活和经济。根据本发明，使用某些新的赖氨酸化合物作为蛋白质或肽合成中的结构单元，从而为位点选择性和化学选择性修饰提供特异性连接柄。具体地，对于肽或蛋白质的位点选择性和化学选择性修饰，本发明需要使用特定的硫代赖氨酸和硒代赖氨酸化合物，特别是化合物5-硫代赖氨酸(也称为δ -硫代赖氨酸)和4-硫代赖氨酸(也称为Y -硫代赖氨酸)以及5-硒代赖氨酸(也称为δ -硒代赖氨酸)和4-硒代赖氨酸(也称为Y-硒代赖氨酸)。本发明的赖氨酸化合物非常容易地由商购可获得的结构单元以高产率合成，如本文所述，这涉及数量相对较少的合成步骤。本发明赖氨酸化合物的设计具有两个重要的特征。首先，硫醇或硒醇基在各碳的定位允许发生非常有效的分子内转移反应。其次，硫醇或硒醇基可以随后利用报道的方法除去，由此恢复天然赖氨酸结构，或所述硫醇或硒醇基可以用作额外的缀合柄。所述方法快速，且产生定义明确的物质。硫醇或硒醇残基在赖氨酸的ε-胺，或者如果适用，α-胺附近的存在允许非常有利的S向N或Se向N的酯交换反应，由此将通过硫代或硒代酯化引入肽或蛋白质的选定的功能物质转移到所述ε _胺或α-胺。如实施例中更详细解释的，本发明人已经证明了本发明赖氨酸结构单元在选定的肽靶标的泛素化中的应用。通过使用El介导的全长泛素硫酯的合成和新研发的氨基酸 5-硫代赖氨酸，本发明人基于H2B、PCNA、PTEN和p53证明了选定的靶肽中赖氨酸残基的位点特异性泛素化。该方法也容易地适应其他功能物质或配体。在连接后，温和脱硫条件的使用不影响存在于肽或蛋白质中的结构单元或选定的功能物质的功能完整性。总之，本发明涉及某些赖氨酸化合物、合成它们的方法以及其作为结构单元在蛋白质或肽合成中的用途，通常作为用于对多肽或蛋白质序列进行位点选择性和化学选择性修饰的生物正交靶。本发明还涉及利用本发明的赖氨酸化合物合成和修饰选定的蛋白质或肽序列的方法。此外，本发明涉及在此类方法中获得的中间物和终产物。所附权利要求所限定的本发明的这些和其他方面，会在下文的描述和实施例中有更详细的描述和举例说明。发明详述本发明的第一方面涉及式(Ia)或(Ib)所示的赖氨酸化合物或所述赖氨酸化合物的酯、盐、溶剂化物或水合物
权利要求
1.式(Ia)或(Ib)所示的赖氨酸化合物或所述赖氨酸化合物的酯、盐、溶剂化物或水合物
2.权利要求1的赖氨酸化合物或其酯、盐、溶剂化物或水合物，其中X表示硫。
3.式(IIa)或(IIb)所示的非天然存在的肽
4.权利要求3的非天然存在的肽，其中所述配体是选自以下的功能物质染料、探针、 标记、标签、溶解性修饰剂、酶靶标、受体配体、免疫调节剂、辅因子和交联剂。
5.权利要求3或4的非天然存在的肽，其中选择R2和R4使得它们包括天然存在的多肽或蛋白质或其功能变体或片段的全部氨基酸序列的互补部分。
6.权利要求3或4中任一项的非天然存在的肽，其中选择R2和R4使得它们表示C— N 和N — C多肽部分，所述C — N和N — C多肽部分位于天然存在的多肽或蛋白质或其功能变体或片段的氨基酸序列中选定的单个氨基酸残基的侧翼，所述选定的单个氨基酸残基优选为赖氨酸残基。
7.权利要求3或4所定义的式(IIb)的非天然存在的肽，其中-R4表示多肽链且-R2表示-P2或氢。
8.权利要求3-6中任一项所述的非天然存在的肽，其用作治疗剂或诊断剂。
9.对选定的多肽或蛋白质序列进行位点选择性和化学选择性修饰的方法，包括i)合成或产生所述选定的多肽或蛋白质序列，其中将至少一个式(Ia)或(Ib)的赖氨酸化合物通过添加或取代掺入所述选定的序列，其中-P3表示氢或权利要求1所定义的保护基；ii)在所述赖氨酸化合物残基除去-P3所示基团，并缀合式-R5或_C(= 0)-R5'所示基团；其中-R5和_C( = 0)-R5’具有与有关式(IIa-IIc)所定义的相同的含义，所述赖氨酸化合物的残基位于硫或硒原子处。
10.权利要求9的方法，其中将-c(= 0)-R5’部分缀合于所述赖氨酸化合物的残基， 从而取代基团-P3以产生相应的硫代-或硒代酯，且所述方法包括随后步骤iii)所述式-C( = 0)-R5’所示的基团分子内转移至-ε胺基。
11.权利要求9或10的方法，其中所述选定的多肽或蛋白质序列的产生包括使用正交 tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对掺入所述赖氨酸化合物，其中响应于包含在编码所述选定序列的基因中的无义密码子或4碱基密码子而掺入所述赖氨酸化合物。
12.权利要求9-11中任一项的方法，其中所述选定的多肽或蛋白质序列是天然存在的多肽或蛋白质或其功能变体或片段。
13.权利要求9-12中任一项的方法，其中所述选择性修饰包括泛素化或构成泛素化。
14.合成权利要求1所定义的赖氨酸化合物的方法，所述方法包括以下步骤(ia)用有机硼烷化合物处理4-羟基赖氨酸或5-羟基赖氨酸化合物以获得氨基酸被保护的化合物，随后使所述氨基酸被保护的化合物与胺保护基反应，产生被保护的4-羟基赖氨酸或5-羟基赖氨酸；或(ib)用有机硼烷化合物处理4-氯赖氨酸、5-氯赖氨酸、4-溴赖氨酸或5-溴赖氨酸以获得氨基酸被保护的化合物，随后使所述氨基酸被保护的化合物与胺保护基反应，产生被保护的4-氯赖氨酸、5-氯赖氨酸、4-溴赖氨酸或5-溴赖氨酸；(iia)甲磺酰化步骤(ia)所获得的化合物，并随后使其与合适的硫代羧酸或硒代羧酸或其盐反应以产生相应的硫代或硒代酯；或(iib)使步骤(ib)所获得的化合物与合适的硫代羧酸或硒代羧酸或其盐反应以产生相应的硫代或硒代酯；(iii)用碱金属氢氧化物的水溶液水解步骤(iia)或(iib)所获得的硫代或硒代酯， 产生硫醇或硒醇化合物，随后使所述硫醇或硒醇化合物与能将权利要求1所定义的基团-P3 转移到所述硫醇或硒醇基团的物质反应；以及(iv)除去所述氨基酸保护有机硼烷基团，并任选地随后使所述化合物与胺保护剂反应，以产生上文所定义的式(Ia)或(Ib)的化合物。
15.权利要求1-2中任一项所述的赖氨酸化合物作为结构单元在选定的肽或蛋白质的合成中为对所述选定的多肽或蛋白质序列进行位点选择性和化学选择性修饰提供连接柄的用途。
全文摘要
本发明涉及新的硫代赖氨酸和硒代赖氨酸化合物，其可以用作肽和蛋白质结构单元，为所述肽和蛋白质的位点选择性和化学选择性修饰提供连接柄。具体地，本发明提供了化合物5-硫代赖氨酸(也称为δ-硫代赖氨酸)、4-硫代赖氨酸(也称为γ-硫代赖氨酸)、5-硒代赖氨酸(也称为δ-硒代赖氨酸)和4-硒代赖氨酸(也称为γ-硒代赖氨酸)(的用途)。硫醇或硒醇基团在各碳原子上的定位允许在与选定的配体缀合之后发生非常有效的分子内转移反应，随后可以利用报道的方法除去硫醇或硒醇，由此恢复天然赖氨酸结构，或所述硫醇或硒醇可以用作额外的缀合柄。所述方法快速且产生定义明确的物质。
文档编号A61K31/198GK102459160SQ201080031860
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月12日 优先权日2009年5月15日
发明者F·埃尔瓦利德, H·奥瓦 申请人:荷兰癌症研究所基金会