专利名称：用于受控的活性物质释放的催化性核酸的依赖于温度的激活的制作方法
用于受控的活性物质释放的催化性核酸的依赖于温度的激活本发明描述了一种活性物质释放系统，其通过具有催化活性的核酸来运作。在第一步中，该具有催化活性的核酸通过外部刺激而从与纳米颗粒相结合的寡核苷酸抑制剂链上释放。在第二步中，释放出的具有活性的核酸与其底物(纳米颗粒-活性物质缀合物)相结合，由此释放出共价地、静电地、配位地或离子地结合的活性物质或者嵌入的活性物质。专利申请W02006/108405被确定为最接近的现有技术并且涉及纳米颗粒，其中治疗有效的物质与所述纳米颗粒相结合，并且其中所述治疗有效的物质从所述纳米颗粒上的脱落通过交变磁场引起或起始。但是，已证明，活性物质从纳米颗粒上的直接热释放对于在相对较小的温度升高下达到所释放出的活性物质的治疗有效浓度(例如在肿瘤细胞中)来说经常不是足够有效的。现在，本发明的任务是提供一种方法和合适的用于该方法的具有偶联的活性物质的复合物，其使得能够在小的温度升高下就使活性物质显量释放，并因此相比于在W02006/108405中所公开的方法而言导致进一步的效率提高。本发明通过提供一种活性物质释放系统而解决了该任务，所述活性物质释放系统包含复合物I和复合物2，其中复合物I借助于具有催化活性的核酸的温度诱导的释放而被激活，并且其中所述具有催化活性的核酸反过来从第二复合物中催化释放出所述活性物质。如在实施例中所表明的，这例如借助于作为具有催化活性的核酸的L-RNA来实现，其中所述具有催化活性的核酸在生理条件下以与以抑制剂形式的L-DNA杂交的状态存在。在人血清中的稳定性测试之中，该复合体是长时间稳定的。此外，通过使用L-核酸可以排除与存在于靶生物体中的天然(例如内源性)核酸酶的相互作用。通过寡核苷酸抑制剂链的碱基序列和长度来调整与所述颗粒相结合的缀合物的解链温度，从而使得在生理条件下不发生解杂交(在本发明的范围内是指38°C，也就是比正常体温稍高的温度)。因此，在体温的情况下，所述双链是稳定的，从而完全抑制了所述催化性核酸。然而，如果使所述颗粒升温，例如通过在交变磁场中的磁感应，那么所述催化性核酸就从所述抑制剂DNA上解杂交，这导致所述双链的解开，并且释放出具有催化活性的核酸。现在这些具有催化活性的核酸可以酶促切割第二复合物了，所述第二复合物包含载体，所述载体通过用作所述催化性核酸的底物的分子与治疗性活性物质相连接。通过所述切割，释放出所述活性物质，其因此可以发挥其作用。因此，在第一个方面，本发明涉及活性物质释放系统，其包含复合物1，其包含至少一个与寡核苷酸抑制剂链相连接的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸抑制剂链与具有催化活性的核酸杂交；和复合物2，其包含与至少一个底物分子相连接的载体，其中所述底物分子与至少一个治疗性活性物质相连接，其中所述治疗性活性物质可通过所述底物分子的切割而释放，其中所述底物分子的切割通过所述具有催化活性的核酸来实现。特别地，本发明涉及活性物质释放系统，其由下列构成与寡核苷酸抑制剂链相连接的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸抑制剂链与具有催化活性的核酸杂交；和与底物寡核苷 酸相连接的另外的纳米颗粒，其中所述底物寡核苷酸与治疗性活性物质相连接，所述治疗性活性物质可通过由所述具有催化活性的核酸切割所述底物寡核苷酸而释放。定义术语“特异性地”是指，所述具有催化活性的核酸优选地仅对所述底物寡核苷酸起作用并切割它，而对其他寡核苷酸不显示活性。术语“生理条件”是指，在靶生物体中，优选地在人生物体中，在各靶组织中于细胞内或细胞外存在的物理化学条件。术语“基本上没有活性物质的解裂”是指，少量释放的活性物质在靶组织中不引起不利反应。特别地，这意味着，在释放试验(例如实施例3A)中，在4小时(h)的时间段期间，释放出少于10%，特别优选地少于1%，和特别地少于O. 5%的所使用的活性物质。术语“催化性核酸”或“具有催化活性的核酸”是指诸如“DNA核酶(DNAzyme)”、核酶、经修饰的核酸以及核酸类似物的核酸分子，其可以无需蛋白质组分的參与而特异性地催化化学反应。对于该方法，不仅可以使用天然存在的催化性核酸，而且还可以使用通过进 化方法(例如SELEX)而产生的核酸。此外，可以借助于自动化固相合成来制备催化性核酸。术语“通过交变磁场引起或起始”是指，交变磁场或脉冲直接引起释放或脱落，或者释放或脱落间接地(例如通过酶的激活或热的产生)被引起。术语“完全杂交”是指，所使用的具有催化活性的核酸的所有分子都以杂交状态存在。由于根据本发明优选地用过量的抑制剂链进行运作，因而在完全杂交的情况下，寡核苷酸抑制剂链可以以游离状态存在。术语“大约”是指，±5%的偏差，特别地±1%的偏差。特别地，本发明涉及活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链共价地，特别是通过交联剂(连接体I)，与所述纳米颗粒相结合。连接体1，以及后来引入的连接体2和连接体3，可以要么直接地由在纳米颗粒(或载体)和寡核苷酸之间的两个官能团共价地形成。优选地，其可以由肽键、三唑环或ニ硫桥组成，或者通过其他ニ聚化反应、缩合反应、烧基化反应或Click反应而形成。此外,它们可以由同双官能交联剂或异双官能交联剂组成，所述交联剂插入在寡核苷酸的官能团和纳米颗粒(或载体)的官能团或反应性表面之间。为此，可能必要的是，通过在寡核苷酸合成中使用经修饰的核苷酸，而为其提供用于寡核苷酸的偶联的所需的官能团。优选地，将该经修饰的核苷酸在末端处掺入到所述寡核苷酸中。所使用的交联剂在生理条件下是不可切割的。根据它们携帯何种反应基团，对于根据本发明的连接体I、连接体2和连接体3，可以区分出不同的交联剂类群。异双官能交联剂具有两个不同的反应性末端，由此可能的是，顺次进行缀合并因此避免不希望的分子内副反应。例如，磺基-SMCC (4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-I-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酷)、磺基-NHS (N-羟基磺基琥珀酰亚胺)、EDC (I-こ基-3-[3- ニ甲基氨基丙基]碳ニ亚胺盐酸盐)或磺基-LC-SPDP (3-(2-吡啶基联硫基)-丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酷)属于异双官能交联剂类群。磺基-SMCC
权利要求
1.活性物质释放系统，其包含 i)复合物I，其包含至少ー个与寡核苷酸抑制剂链相连接的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸抑制剂链与具有催化活性的核酸杂交，和 )复合物2，其包含与至少ー个底物分子相连接的载体，其中所述底物分子与至少ー个治疗性活性物质相连接， 其中所述治疗性活性物质可通过所述底物分子的切割而释放，其中所述底物分子的切割通过所述具有催化活性的核酸来实现。
2.根据权利要求I的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链共价地，特别是通过连接体1，与所述纳米颗粒相结合。
3.根据权利要求I至2之一的的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸选自RNA、DNA、L-RNA、L-DNA和经修饰的核酸，其特别地包含SH-修饰的核苷酸，其优选地具有10至100个核苷酸的长度，特别地具有12至60个核苷酸的长度，其中所述具有催化活性的核酸优选地为RNA，特别是核酶，特别是锤头状核酶，其特别地包含序列5’ -GGC UCG A⑶GAU GAG GCG C_3’ (SEQ ID NO:I)。
4.根据权利要求3的活性物质释放系统，其中所述连接体I通过氨基基团与交联剂和在所述寡核苷酸抑制剂链的5’-末端处的SH-修饰的核苷酸的SH基团的反应而形成，其中所述氨基基团通过在纳米颗粒表面上的氨基硅烷修饰而引入，并且所述交联剂优选地为磺基-SMCC或磺基-GMBS。
5.根据权利要求I至4之一的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链选自RNA、DNA、L-RNA, L-DNA和经修饰的核酸，其特别地包含SH-修饰的核苷酸，其优选地具有10至100个核苷酸的长度，特别地具有10至60个核苷酸的长度，其特别地包含序列5’ -GCCT CATCAG TCG AGC C_3’ (SEQ ID NO:2)。
6.根据权利要求I至5之一的活性物质释放系统，其中在复合物I中，所述寡核苷酸抑制剂链与所述具有催化活性的核酸的比例> 1，特别地I至2。
7.根据权利要求I至6之一的活性物质释放系统，其中在复合物I中，具有序列5’-GCCT CAT CAG TCG AGC C-3’ (SEQ ID NO:2)的寡核苷酸抑制剂链与具有序列5，-GGC UCGACU GAU GAG GCG C_3，(SEQ ID NO: I)的具有催化活性的核酸的比例为I. O至I. 3，特别地大约I. Io
8.根据权利要求I至7之一的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸在生理条件下以与所述寡核苷酸抑制剂链完全杂交的状态存在，并且在43°C的情况下，至少ー个具有催化活性的核酸，优选地5%，更优选地10%，特别地20%的所结合的、具有催化活性的核酸解杂交。
9.根据权利要求I至8之一的活性物质释放系统，其中所述纳米颗粒具有包含至少ー种顺磁性或超顺磁性氧化铁的核心。
10.根据权利要求9的活性物质释放系统，其中所述顺磁性或超顺磁性纳米颗粒在交变磁场中升温。
11.根据权利要求I至10之一的活性物质释放系统，其中所述纳米颗粒包含至少ー个包壳，优选地硅烷包壳或者SiO2包壳和硅烷包壳。
12.根据权利要求I至11的活性物质释放系统，其中所述底物分子为寡核苷酸。
13.根据权利要求I至12的活性物质释放系统，其中所述载体为聚合物，特别是生物聚合物，SiO2颗粒，金属颗粒，特别是金颗粒，或者氧化颗粒，优选地为表面经修饰的氧化铁微粒，其作为凝胶、微颗粒、微球体或纳米颗粒，特别地作为氧化纳米颗粒而存在。
14.根据权利要求I至13的活性物质释放系统，其中所述底物分子共价地，特别是通过连接体2共价地与所述载体相连接，其中所述连接体优选地为磺基-SMCC或磺基-GMBS。
15.根据权利要求12至14之一的活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸选自DNA、RNA、L-DNA, L-RNA和经修饰的核酸，其中所述经修饰的核酸优选地具有特别地末端偶联官能化，特别是氨基官能团、巯基官能团、或羧基官能团、炔官能团或叠氮化物官能团。
16.根据权利要求15的活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸具有10至100个核苷酸的长度，优选地15至60个核苷酸的长度，更优选地20至30个核苷酸的长度，其特别地包含序列 5，-GCG CCG AAACAC CGU GUC UCG AGC-3，(SEQ ID NO:3)。
17.根据权利要求I至16的活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质选自包括核酸、siRNA、反义RNA、氨基酸、适体、肽、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、聚糖、脂质、脂蛋白和低分子量活性物质的组，其中所述治疗性活性物质特别地为低分子量活性物质，并且优选地具有抗增殖、抑制细胞、细胞毒性、抗迁移、抗血管发生、抗血栓形成、抗炎、消炎、抗凝、抗细菌、抗病毒和/或抗真菌的作用，特别是抑制细胞或细胞毒性的作用，特别地，其中所述治疗性活性物质为多柔比星或甲氨蝶呤。
18.根据权利要求I至17之一的活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质共价地，特别是通过连接体3共价地与所述底物分子相连接。
19.根据权利要求18的活性物质释放系统，其中所述连接体3选自氨基基团和腙，特别地，其中甲氨蝶呤通过该氨基基团与甲氨蝶呤的羧基基团之间的肽键进行偶联。
20.根据权利要求I至19的活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质在其与所述底物分子和/或所述连接体3相结合期间是无活性的，并且随着所述底物分子或者说所述连接体3的释放或者在随后被细胞吸纳后而被激活。
21.根据权利要求I至20的活性物质释放系统，其中只要所述具有催化活性的核酸以从所述寡核苷酸抑制剂链上解离的状态存在，其就可以切割所述底物分子， 其中优选地，下列适用于通过所述具有催化活性的核酸来进行的所述底物分子的切割反应所述底物分子的浓度> KM, 其中kMt优选地> O. 05/分钟，更优选地> O. 5/分钟，特别优选地> I/分钟，特别地≥ 5/分钟。
22.根据权利要求I至21的活性物质释放系统，其中复合物I与复合物2的比例<2，优选地< I。
23.根据权利要求12至21的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链、所述具有催化活性的核酸和所述底物寡核苷酸为镜像核酸，其中所述寡核苷酸抑制剂链优选地为L-DNA，其特别地包含序列 5’ -G CCT CAT CAG TCG AGC C-3’ (SEQ ID NO:2)，所述具有催化活性的核酸优选地为L-RNA，其特别地包含序列5’-GGC UCG A⑶GAUGAG GCG C_3’ (SEQID NO: I)，和所述底物寡核苷酸优选地为L-RNA，其特别地包含序列5’ -GCG CCG AAA CACCGU ⑶C UCG AGC-3’ (SEQ ID NO:3)。
24.在权利要求I至11之一中更详细地定义的复合物I。
25.在权利要求I或者12至20之一中更详细地定义的复合物2。
26.包含根据权利要求I至26之一的活性物质释放系统的药物。
27.包含根据权利要求I至26之一的活性物质释放系统的药物，其用于治疗和/或预防増殖性疾病，癌症，炎性疾病，特别是自身免疫疾病，和细菌感染。
28.根据权利要求27的药物，其中将复合物I和复合物2同时或顺次引入到患者中。
29.根据权利要求27的药物，其中在去除肿瘤时将复合物I和复合物2引入到瘤床中。
30.用于从根据权利要求I或者12至20之一的复合物2上释放活性物质的方法，其包括下列步骤 i)将根据权利要求I至11之一的复合物I引入至复合物2的空间邻近处，在允许释放出的具有催化活性的核酸扩散至所述底物寡核苷酸以及对其进行切割的条件下，和 )复合物I主动或被动升温，从而释放出所述具有催化活性的核酸。
全文摘要
本发明的目标为包含两种复合物的活性物质释放系统。第一复合物包含与寡核苷酸抑制剂链相连接的纳米颗粒，所述寡核苷酸抑制剂链与具有催化活性的核酸杂交。第二复合物包含与底物分子相连接的载体，所述底物分子与治疗性活性物质相偶联。通过外部刺激，所述第一复合物的该具有催化活性的核酸被释放出来，并与所述第二复合物的该底物分子特异性地结合。这导致所述底物分子的切割，由此释放出与其结合的活性物质。
文档编号A61K9/00GK102711727SQ201080056951
公开日2012年10月3日 申请日期2010年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者J·高, M·菲施勒, V·A·埃德曼 申请人:马格福斯股份公司