专利名称：用于增强抗肿瘤抗体疗法的方法
用于增强抗肿瘤抗体疗法的方法
背景技术：
在过去四分之一世纪中，单克隆抗体技术是最著名的科学进步之一。这种研究的快速转化延长了上千癌症患者的生存。第一个被批准的单克隆抗体是利妥昔单抗，它是一种抗⑶20的鼠-人嵌合性IgGl抗体，已经成为患有B细胞淋巴瘤患者的医护标准。抗HER2(曲妥珠单抗)和抗EGF受体(西妥昔单抗)的单克隆抗体也相似地分别改变了患有乳癌、结直肠癌和头颈癌的被选患者的自然病程。尽管单克隆抗体的有前景的活性，患有难治的或晚期癌症的患者中的反应率并未达到最理想，典型地在25%以下。增强单克隆抗体的 活性的努力集中在细胞毒性化疗的各种组合上。这在很大程度上忽略并可能部分拮抗单克隆抗体借此发挥功能的免疫机制。获得性免疫细胞和固有免疫细胞参与肿瘤细胞的监测和消除。在固有细胞中是自然杀伤细胞(NK细胞)构成了固有免疫系统的主要组成成分。在肿瘤和感染病毒的细胞的排除中NK细胞发挥主要作用。这种细胞通过释放小的蛋白质细胞质颗粒(称为穿孔素和颗粒酶)，其通过凋亡引起靶细胞死亡来进行杀伤。自然杀伤细胞的活性受到严格的调节，并需要激活信号。例如，通过抗体激活Fe受体允许NK细胞通过抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)去裂解细胞。经激活，NK细胞释放包含颗粒酶和穿孔素的颗粒。穿孔素在靶细胞的细胞膜中形成孔，颗粒酶和相关分子穿过该孔可以进入，从而诱导凋亡。ADCC是针对肿瘤的单克隆抗体疗法发挥作用的一个主要机制。然而，常规的细胞毒性化疗引起骨髓抑制，减少了 NK细胞群，从而降低ADCC的疗效。相比之下，具有加强的NK细胞功能的疗法可能会提供改善单克隆抗体的活性而不增加非癌细胞毒性的能力。临床上这是显著的，因为由于较大的年龄、晚期的疾病或事先的疗法而增加的癌症患者群体不是常规细胞毒性化疗的候选者。本发明解决了这个问题。
发明内容
本发明提供了增强针对肿瘤抗原的单克隆抗体的抗肿瘤作用的方法。在本发明的方法中，通过顺序施用针对一种或多种肿瘤抗原的抗体以及抗一种或多种NK细胞上可诱导的共刺激分子的激动抗体，来尤其加强ADCC的功能，其反过来又增强靶细胞的杀伤。对诊断患有肿瘤的个体首先施用针对肿瘤的抗体。经过一段时间后,NK细胞上调可诱导的共刺激分子(比如CD137、0X40、GITR、CD30或IC0S)的表达，所述NK细胞是对于ADCC关键的固有免疫效应细胞。随后，施用靶向NK细胞上诱导的共刺激分子的第二抗体(包括但不限于抗-CD137、抗-0X40、抗-GITR、抗-CD30或抗-IC0S)。在一些实施方式中，施用针对肿瘤的抗体之后评价上述共刺激分子的表达，以确定第二剂给药的最佳时间。或者，凭经验确定定时时间段，并且普遍适用。显示所述剂的组合及其顺序施用，来提供一种在单独的单剂施用中观察不到的肿瘤特异性、治疗协同作用的水平。该方法特异性增强针对肿瘤抗原的单克隆抗体的抗肿瘤功能。因为第二抗体靶向通过针对肿瘤的抗体在NK细胞上可诱导表达的共刺激分子，该方法允许特异性刺激ADCC介导的肿瘤细胞杀伤中涉及的NK细胞，而省去其它NK细胞，从而限制了潜在的非特异性副作用。在本发明的一些实施方式中，可诱导共刺激分子是⑶137。在这种方法中，对诊断患有肿瘤的个体首先施用肿瘤选择性的抗体。经过一段足以上调CD137在免疫系统细胞中的表达的时间后，施用第二剂，而所述剂是CD137的激动剂。在一些实施方式中，在各施用步骤之前，确定在血细胞上的⑶137表达水平，其中表达的提高表明第二剂可以施用了。
图1A-1C.与⑶20-阳性肿瘤B细胞孵育之后，利妥昔单抗诱导⑶137在人NK细胞上的上调。用淋巴瘤细胞系与曲妥珠单抗或利妥昔 单抗培养24小时后，分析来自三个健康供体的外周血的⑶137在⑶3XD56+NK细胞上的表达。(A)显示用⑶20_淋巴瘤细胞系(0CI-Lyl9)或CD20-阳性淋巴瘤细胞系(Ramos，DHL-4，Raji)细胞系培养的来自三个健康供体的⑶137+细胞在⑶3TD56+NK细胞中的百分比。(B)显示在淋巴瘤细胞系(0CI_Lyl9、Ramos,DHL-4和Raji)上的⑶20表面表达。根据淋巴瘤细胞系的MFI相对于同种型的MFI中的IoglO-倍增加对直方图进行着色。(C)显示用⑶20-阳性淋巴瘤细胞系、Ramos和利妥昔单抗培养24小时后，来自代表性的健康供体的CD137在NK细胞亚群003工056胃和⑶3XD56 上的表达。图2A-2F.抗⑶137激动性mAb增加肿瘤细胞上利妥昔单抗介导的NK细胞细胞毒性。用下列五种条件培养24小时之后仅培养基KD20-阳性淋巴瘤细胞系(Raji、Ramos或DHL-4);肿瘤和利妥昔单抗；肿瘤和抗CD137抗体；或肿瘤、利妥昔单抗和抗CD137激动抗体(A, Raji, *p = . 01 ；B, Ramos, *p = . 003, C, DHL-4, *p = . 002)，分析从健康供体外周血中分离并纯化的NK细胞的通过CD107a动员的脱颗粒。在铬释放试验中分析NK细胞对Raji、Ramos和DHL-4肿瘤细胞的细胞毒性(D-F)。与铬标记的Raji、Ramos和DHL-4细胞孵育4小时前，纯化预激活的NK细胞(如材料和方法中描述的)。(D-F)显示通过铬释放在不同的效应物(激活的NK细胞)靶(Raji)细胞比率下用下列条件培养的靶细胞的裂解百分比仅用培养基( )、抗CD137(A)、利妥昔单抗( )或利妥昔单抗和抗CD137( ■)抗体(D, Raji, *p = . 01 ；E, Ramos, *p = . 01, F, DHL-4, *p = . 009)。 图3A-3D.抗⑶137激动mAb增强鼠抗⑶20mAb的体内抗淋巴瘤活性。用5X106BL3750淋巴瘤肿瘤细胞对C57BL/6小鼠皮下接种至腹部上。A-B)肿瘤接种后，小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG对照( )、在第3天接受抗CD20抗体(■)、在第4天接受抗⑶137抗体( )，或在第3天接受抗⑶20抗体和在第4天接受抗⑶137抗体(▲)。然后监测小鼠(每组10只)的肿瘤生长(A，*p < 001)和总存活率(B，*p = 048)。C-D)显示具有相同治疗顺序但是治疗延迟至肿瘤接种后8天的肿瘤生长和存活。小鼠或者在第8天接受大鼠IgG对照( )、在第8天接受抗CD20抗体(■)、在第9天接受抗CD137抗体( )，或在第8天接受抗CD20抗体和在第9天接受抗CD137抗体(▲)。然后监测小鼠(每组10只)的肿瘤生长(C，*p < . 001)和总存活率(D，*p < . 001)。图4A-4B.抗⑶20和抗⑶137mAbs的组合活性要求适当的mAb施用顺序。用5X106BL3750淋巴瘤肿瘤细胞对C57BL/6小鼠皮下接种至腹部上。肿瘤接种后，小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG对照( )、在第3天接受抗CD20mAb和在第4天接受抗CD137mAb (A),或在第3天接受抗CD20mAb和在第3天接受抗CD137mAb (■) 然后监测小鼠(每组10只)的肿瘤生长(A，*p < . 001)和总存活率(B，*p = . 001)。图5A-5D.通过抗⑶137激动mAb对抗⑶20mAb的抗淋巴瘤活性的增强取决于NK细胞和巨噬细胞。(A)对来自肿瘤接种后4天的生淋巴瘤的C57BL/6小鼠的外周血细胞亚群的 CD 137 在 CD3IL I+NK 细胞(NK)、F4/80+ 巨噬细胞(Mcp)和 CD3+CD8+T 细胞(CD8)和⑶3+CD4+T细胞(⑶4)上的表达进行分析，其中小鼠在第3天用IgG对照或抗⑶20抗体进行治疗(n =每组3只小鼠，*p = . 001)。(B)对来自肿瘤接种后7天的生淋巴瘤的C57BL/6小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞的⑶137在⑶3-NK1. I+NK细胞(NK)、F4/80+巨噬细胞(Mtp)和⑶3+CD8+T细胞(CD8)和⑶3+⑶4+T细胞(CD4)上的表达进行分析，其中小鼠在第3天用IgG对照或抗⑶20抗体进行治疗(n =每组3只小鼠Zp = . 012,NS =不显著)。(C-D)用5X106BL3750淋巴瘤肿瘤细胞接种C57BL/6小鼠。肿瘤接种后，小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG对照( )、在第_1、0、5、10、15、20和25天接 受抗-脱唾液酸基-GMl且在第3天接受抗CD20抗体以及在第4天接受抗CD137抗体(■)、在第_2、0、4、8、12、16、20和24天接受氯膦酸二钠脂质体(L.)且在第3天接受抗CD20抗体和在第4天接受抗CD137抗体(▼)，在第-1、0、5、10、15、20和25天接受抗⑶8mAb且在第3天接受抗⑶20抗体和在第4天接受抗⑶137抗体( )，或在第3天接受抗⑶20抗体和在第4天接受抗⑶137抗体(A)0然后监测小鼠(每组10只)的肿瘤生长(C，*p = 002)和总存活率(D，*p < 001)。图6A-6C.在播散性人淋巴瘤异种移植模型中，抗⑶137激动mAb增强利妥昔单抗的体内抗淋巴瘤活性。用3X IO6荧光素酶标记的Raji淋巴瘤肿瘤细胞通过眼后窦静脉接种SCID小鼠。肿瘤接种后，小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG对照( )、在第3天接受利妥昔单抗(■)、在第4天接受抗CD137抗体( )，或在第3天接受利妥昔单抗和在第4天接受抗⑶137抗体(A)。每周连续治疗，总共4周。代表治疗后第10、第20和第30天的小鼠的荧光素酶成像显示于(A)中。然后监测小鼠(每组5只)的定量生物发光(B，*p = 001)和总存活率(C，*p = 013)。图7A-7C.利妥昔单抗包被的、自体淋巴瘤细胞诱导来自患有B细胞恶性肿瘤的人类患者的NK细胞上的CD137上调。仅用培养基、曲妥珠单抗或利妥昔单抗培养24小时后，分析来自患有B细胞恶性肿瘤的人类患者的外周血和循环肿瘤细胞(CTC)的CD137在⑶3XD56+NK细胞上的表达(A和B)。(A)显示对于患有边缘区淋巴瘤(MZL)带有70% CTC的患者，⑶16和⑶137在⑶3TD56+NK细胞上的表达。(B)显示在患有滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、MZL、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和⑶20阳性急性淋巴细胞白血病(ALL)的25名患者的人群中⑶137+在^31056+沖(细胞中的百分比。(C)显示用利妥昔单抗培养24小时之后，来自患有FL( )、CLL(_)、MZL(e)、DLBCL (' )和⑶20阳性ALL ( )的患者样本的外周血CTC百分比和⑶137在⑶3TD56+NK细胞表面的表达之间的相关性，R2 = 0. 87，p < . 001。图8A-8C.预激活后在NK细胞上的CD137诱导和时序表达(Temporalexpression)。用培养基、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、淋巴瘤细胞系(Raji、Ramos、DHL-4或0CI-Lyl9)和利妥昔单抗培养24小时后，分析从健康供体中纯化的NK细胞的⑶137表达(A)。用Raji细胞系和利妥昔单抗培养0、4、16、24、48和72小时后，分析从健康供体中纯化的NK细胞的CD137表达(B)。对于显示于图8C中的实验，将来自代表性健康供体的外周血单核细胞用Raji、Ramos或DHL-4和利妥昔单抗孵育24小时。然后在进行细胞毒性试验之前分析预激活的NK细胞的CD137表达(C)。图9A-9B.抗⑶137激动mAb增加细胞因子的释放和利妥昔单抗介导的预激活NK细胞的细胞毒性。为了评价NK细胞干扰素-Y分泌，从健康PBMC中分离纯化的NK细胞，并与利妥昔单抗(lOiig/mL)和福照的(5000拉德)淋巴瘤肿瘤细胞(Raji)以I : I的比例共同培养24小时。24小时后，NK细胞经分离并用于纯度评估(如通过⑶3TD56+流式细胞术确定的> 90%纯度)(A-B)。预激活的纯化的NK细胞然后仅在培养基中、或单独用抗0)13711^13(81^-663513，101^/1^)、单独用利妥昔单抗(10 y g/mL)或利妥昔单抗加上抗⑶137mAb (均为10 u g/mL)培养4小时，收获上清并通过ELISA分析干扰素-、(A，*p= 027)。NK细胞对Raji肿瘤细胞的细胞毒性在铬释放试验中进行分析，在有或没有在先的NK细胞预激活的情况下(B)。预激活的和未预激活的纯化的NK细胞与铬标记的Raji孵育4小时。通过铬释放在不同的效应物(连续的线表示预激 活的NK细胞，虚线表示未预激活的NK细胞)靶(Raji)细胞比率下用下列条件培养的靶细胞的裂解百分比仅用培养基( )、抗⑶137 ( ▲)、利妥昔单抗( )或利妥昔单抗和抗⑶137 ( ■)抗体fp = . 024)。图10.抗⑶137激动mAb增加利妥昔单抗介导的NK细胞脱颗粒。仅用培养基、⑶20-阳性淋巴瘤细胞系(Raji、Ramos或DHL-4)、肿瘤和利妥昔单抗、肿瘤和抗⑶137抗体、或肿瘤、利妥昔单抗、和抗CD137激动抗体培养24小时之后，分析从健康供体外周血分离并纯化的NK细胞的⑶107a动员的脱颗粒。用Ramos培养后NK细胞上⑶107a表达的代表性流式细胞图。图IIA-11C.用HER2-阳性肿瘤细胞孵育之后，曲妥珠单抗诱导⑶137在人类NK细胞上的上调。用乳癌细胞系和IgG对照、曲妥珠单抗或利妥昔单抗培养24小时后，分析来自三名健康供体的外周血的⑶137在⑶3TD56+NK细胞上的表达。(A)显示用HER2+乳癌细胞系(BT474M1)培养24小时后，来自代表性健康供体的⑶69+和⑶137+在⑶3TD56+NK细胞上的表达。(B)显示HER2在乳癌细胞系(MCF7、BT474M1、SKBR3和HER18)上的表面表达。根据乳癌细胞系的MFI相对于同种型的MFI中的IoglO-倍增加对直方图进行着色。
(C)显示用可变表达的HER2乳癌细胞系(MCF7、BT474M1、SKBR3、HER18)培养24小时后，来自三个健康供体的⑶137在NK细胞⑶3TD56+上的表达。图12A-12C.如通过细胞活力测定的，抗⑶137激动mAb增加曲妥珠单抗介导的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。预激活的NK细胞在用MCF7、BT474M1和HER18孵育18小时之前进行纯化。(A-C)显示用NK细胞、肿瘤、仅培养基、抗CD137、曲妥珠单抗、或曲妥珠单抗和抗CD137抗体培养之后，通过膜联蛋白和7AAD活力染色的凋亡靶细胞的百分比(A，MCF7细胞系，B，BT474M1 肿瘤系 *p = 03 ；C, HER18，**p < 01)。图13.如通过铬释放测定的，抗⑶137激动mAb增加曲妥珠单抗介导的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。在铬释放试验中分析NK细胞对BT474M1肿瘤细胞的细胞毒性。预激活的NK细胞在用铬标记的BT474M1孵育4小时之前进行纯化。显示的是通过铬释放在不同的效应物(激活的NK细胞)靶(BT474M1)细胞比率下用下列条件培养的靶细胞的裂解百分比仅用培养基( )、抗CD137(V)、利妥昔单抗(▲)、或利妥昔单抗和抗CD137(_)抗体(P = 006)。图14A-14B.抗⑶137激动mAb增强曲妥珠单抗的体内抗乳癌活性。皮下注射0. 72mg/60天释放的P雌二醇丸之后I天，用5X 106BT474M1乳房肿瘤细胞对nu/nu裸鼠皮下接种至腹部上。(A-B)肿瘤接种后，小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG对照(籲)、在第3天接受曲妥珠单抗抗体(■)，在第4天接受抗CD137抗体( )，或在第3天接受曲妥珠单抗和第4天接受抗CD137抗体(▲)，每周重复各治疗，共三周。然后监测小鼠(每组10只)的肿瘤生长(A，*p < 001)和总存活率(B，**p = 003)。图15A-15C.抗CD137激动mAb增强曲妥珠单抗的体内抗乳癌活性，同时保留了HER2特异性。皮下注射0. 72mg/60天释放的P雌二醇丸之后I天，用5X 106MCF7乳房肿瘤细胞对nu/nu裸鼠在左侧腹皮下接种，以及用5X 106HER18乳房肿瘤细胞在右侧腹皮下接种。A-C)肿瘤接种后，小鼠然后或者在第3天接受曲妥珠单抗，或在第3天接受曲妥珠单抗和在第4天接受抗⑶137抗体，每周重复各治疗，共三周。A)肿瘤模型。B)然后监测代表性的小鼠(每组10只中的3只)的肿瘤生长 。C)治疗组的肿瘤生长，肿瘤类型包括用曲妥珠单抗治疗的小鼠左侧腹的MCF7 (〇)和右侧腹的HER18 ( □ □)，以及用曲妥珠单抗和抗CD137mAb治疗的小鼠左侧腹的MCF7 ( )和右侧腹的HER18 ( ■ ) (*p < 001)。图16.抗CD137激动mAb增强曲妥珠单抗体内抗HER2+原发性乳房肿瘤的抗乳癌活性。200cGy全身辐射(TBI)后24小时，用I X 106HER2+原发性乳房肿瘤细胞通过乳房内注射来接种SCID小鼠。在第40天，将小鼠随机编入四组(每组5只小鼠)中的一组，包括在第40天治疗的IgG对照( )、在第40天曲妥珠单抗治疗(■)、在第41天抗⑶137mAb治疗( )，或在第40天曲妥珠单抗且在第41天抗CD137mAb治疗(▲)。在各组中每周重复治疗，共三次治疗。然后监测小鼠的肿瘤生长Cp = . 016)。图17A-17B.用EGFR-阳性肿瘤细胞孵育之后，西妥昔单抗诱导CD137在人类NK细胞上的上调。用头颈癌细胞系和仅培养基、利妥昔单抗或西妥昔单抗培养24小时后，分析来自三名健康供体的外周血的⑶137在⑶3TD56+NK细胞上的表达。(A)显示EGFR在头颈癌细胞系(103、SCC4、PCU SCC6)上的表面表达。根据乳癌细胞系的MFI相对于同种型的MFI中的IoglO-倍增加对直方图进行着色。(B)显示用可变表达的EGFR头颈癌细胞系(SCC6、PC1和SCC4)培养24小时后，来自三个健康供体的⑶137在NK细胞⑶3TD56+上的表达。图18A-18C.如通过细胞活力测定的，抗⑶137激动mAb增加西妥昔单抗介导的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。预激活的NK细胞在用SCC6、PCl和SCC4孵育24小时之前进行纯化。(A-C)显示用仅肿瘤、或肿瘤和NK细胞和培养基、西妥昔单抗、抗CD137、西妥昔单抗和抗CD137抗体培养之后，通过膜联蛋白和7AAD活力染色的凋亡靶细胞的百分比(A，SCC6, *p = . 002 ；B, PCI, **p = . Oil ；C, SCC4, ***p = . 001)。图19.如通过铬释放测定的，抗⑶137激动mAb增加西妥昔单抗介导的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。在铬释放试验中分析NK细胞对SCC6肿瘤细胞的细胞毒性。新鲜的且预激活的NK细胞在用铬标记的SCC6细胞孵育5小时之前进行纯化。显示的是通过铬释放在不同的效应物(新鲜的NK细胞)靶(SCC6)细胞比率下用下列条件培养的靶细胞的裂解百分比仅用培养基( )、抗CD137 ( ▼)、西妥昔单抗(▲)、或西妥昔单抗和抗⑶137 ( ■)抗体Cp = . 003)，或者预激活的NK细胞作为效应物和SCC6靶，且西妥昔单抗和抗⑶137( )抗体培养的靶细胞的裂解百分比( = . 002)。图20.抗⑶137激动mAb增强西妥昔单抗的体内抗头颈癌活性。用3X 106SCC6头颈肿瘤细胞对nu/nu裸鼠皮下接种至腹部上。肿瘤接种后，小鼠然后或者在第21天接受大鼠IgG对照( )、在第21天接受西妥昔单抗(■)、在第22天接受抗CD137抗体( )、或在第21天接受西妥昔单抗和在第22天接受抗CD137抗体(▲)，每周重复各治疗，共三次治疗。然后监测小鼠(每组10只)的肿瘤生长(A，*p < . 001)。图21A-21B—对患有头颈癌的患者输注西妥昔之后，循环NK细胞上调⑶137。分析来自患有头颈癌的患者的新鲜外周血的⑶137在⑶3TD56+NK细胞上的表达。(A)显示0期，生物标志物，实验方案(NCT01114256)。(B)显示西妥昔单抗输注之前和之后，新鲜外周血⑶3TD56+NK细胞中⑶137+细胞的百分比。
具体实施方式
提供了方法用于增强针对肿瘤抗原的单克隆抗体的抗肿瘤作用。在本发明的方法中，通过顺序施用抗体的组合来加强ADCC功能并增强靶细胞杀伤。显示相对于单一剂的施用，剂的组合和顺序施用提供协同作用。针对肿瘤的抗体的施用上调可诱导的共刺激分子如CD137、0X40、GITR、CD30或ICOS在NK细胞上的表达，NK细胞是对ADCC关键的固有免疫效应细胞。随后，施用靶向诱导的共刺激分子的第二激动抗体(包括但不限于抗-CD137、抗-0X40、抗-GITR、抗-⑶30或抗-IC0S)。在一些实施方式中，评价施用针对肿瘤的抗体之后上述共刺激分子的表达，以确定第二剂给药的最佳时间。或者，凭经验确定定时时间段，并且普遍适用。因为第二抗体靶向通过针对肿瘤的抗体已经在NK细胞上可诱导表达的共刺激分子，该方法允许特异性刺激ADCC介导的肿瘤细胞杀伤中涉及的NK细胞，而省去其它NK细胞，从而限制了潜在的非特异性副作用。进一步说明本发明之前，应当理解的是本发明不限于如此描述的具体实施方式
，正因为如此，当然有变化。还应理解本文所使用的术语仅出于描述具体实施方式
的目的，并无意进行限制，因为本发明的范围将只受到附加权利要求的限制。当提供值的范围时，应理解除非另有指明，否则该范围的上限和下限之间的和任何其它规定的各居中值或所规定范围中的居中值至下限单位的十分之一涵盖在本发明的范围内。受限于规定范围内任何明确排除的限制，这些更小范围的上限和下限可独立地包含在更小的范围内，并也包括在本发明范围内。当规定的范围包括一个或两个限制时，排除一个或两个包括的限制的范围也包括在本发明内。可按照逻辑上可行的所叙述事件的任何顺序以及所叙述的事件顺序来实施本文叙述的方法。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，优选现描述的方法和材料。本文提及的所有出版物纳入本文作为参考，结合所引用的出版物来公开和描述方法和/或材料。必须指出，如本文和附加权利要求中所用，除非另有指明，否则单数形式“一”和“该”包括复数指代。应进一步注意的是，这样起草权利要求来排除任何可选的要素。正因如此，这种表述结合权利要求要素的叙述作为这种排除性术语如“仅”、“只”等的使用、或者作为“负”限制的使用的前提基础。本文讨论的出版物仅因为其在本申请提交日之前公开而提供。本文任何情况不能解释为承认本发明凭借在先的发明无权先于这种出版物。此外，提供的出版日期可能不同于实际的出版日期，这可能需要单独证实。定义可诱导的共刺激分子。如本文所用，可诱导的共刺激分子是一种表达在免疫细胞(包括但不限于自然杀伤(NK)细胞)上的多肽，其表达在NK细胞激活期间被诱导或显著上调。共刺激分子的激活增强效应细胞的功能，例如增加由激活的NK细胞介导的ADCC。这种可诱导的共刺激分子包括但不限于^137、(《 40、6几1 、^30、10)5等，是本领域技术人员已知的。这种分子的激动剂，包括结合并激活共刺激分子的抗体，是本发明方法所关注的。许多这种共刺激分子是肿瘤坏死因子受体家族(TNFR)的成员。TNFR相关分子没有任何已知的酶活性，并且依赖于细胞质蛋白质的募集来激活下游信号通路。CD137。CD137，也可以称为Ly63、ILA或4-1BB，是一种肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员。该受体家族的成员及其结构上相关的配体是各种生理过程重要的调节子并在免疫应答调节中发挥重要作用。⑶137由激活的NK细胞、T和B淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞表达。基因编码255个氨基酸的蛋白质，其具有胞外域中的3个富含半胱氨酸的基序(该受体家族的特征)、跨膜区、以及含有潜在磷酸化位点的短N-端胞质部分。原代细胞中的表达是严格激活依赖性的。该受体的配体是TNFSF9。报道人⑶137仅结合其配体。激动剂包括天然配体(TNFSF9)、适配体(见 McNamara 等人(2008) J. Clin. Invest. 118 :376-386)和抗体。CD134。0X40(CD134)及其结合伙伴0X40L (CD252)，是肿瘤坏死因子受体/肿瘤坏死因子超家族的成员，并表达于激活的T细胞以及一些其它淋巴和非淋巴细胞上。0X40和0X40L调节来自T细胞、抗原呈递细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞的细胞因子产生，并调节细胞因子受体信号传导。GITR0糖皮质激素诱导的TNFR相关的(GITR)蛋白质属于肿瘤坏死因子受体/肿瘤坏死因子超家族，并刺激获得性和固有免疫。它表达于几种细胞和组织(包括T和自然杀伤(NK)细胞)中，并由其配体GITRL(主要表达于抗原呈递细胞和内皮细胞上)激活。GITR/GITRL系统参与自身免疫/炎症反应的进展，并通过包括NK-细胞-共激活的机制加强对感染和肿瘤的反应。CD30。跨膜受体CD30 (TNFRSF8)及其配体CD30L (CD153，TNFSF8)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员，并显示在激活的免疫细胞亚群中的限制表达。⑶30是一种TNF受体超家族的I型跨膜糖蛋白。⑶30的配体是⑶30L (⑶153)。⑶30对⑶30L的结合介导多效性作用，包括细胞增殖、激活、分化和凋亡的细胞死亡。可诱导的共刺激分子(ICOS)。ICOS是⑶28家族的成员。ICOS表达可能是可容易检测到是静止的，但激活后上调。ICOS和ICOS-L似乎是单配的一对。ICOS共刺激增强效应物功能。“可诱导的共刺激分子激动剂”包括如上所述的天然配体、适配体、特异于激活受体的可诱导的共刺激分子的抗体、以及选择性结合可诱导的共刺激分子的抗体的衍生物、变体和生物活性片段。“变体”多肽是指如下定义的具有与天然序列多肽100%以下序列一致性的一种生物活性多肽。该变体包括其中在天然序列的N-或C-端或在天然序列中添加有一个或多个氨基酸残基的多肽；删除约I至40个氨基酸残基、以及任选被一个或多个氨基酸残基取代的多肽；以及上述多肽的衍生物，其中氨基酸残基被共价修饰从而获得的产物具有非天然存在的氨基酸。通常，生物活性变体将具有与天然序列多肽至少约90 %，优选至少约95%，更优选至少约99%氨基酸序列一致性的氨基酸序列。变体多肽可被天然地或非天然地糖基化，即多肽具有不同于在相应天然存在的蛋白质中发现的糖基化模式的糖基化模式。受关注的是特异于可诱导的共刺激分子的配体或抗体的片段，尤其是生物活性片段和/或对应着功能域的片段。受关注片段通常长度上至少约IOaa至至少约15aa，通常在长度至少约50aa，但通常长度将不会超过200aa，其中片段将具有与其所源自的多肽一致的连续氨基酸延伸。“长度上至少20aa”的 片段例如意图包括来自例如⑶137特异性抗体或来自TNFSF9的20个或更多连续的氨基酸。在本文中，“约”包括特定引用的值、或者多或少几个(5、4、3、2或I)氨基酸的值。本文所述的蛋白质变体由本发明范围内的多核苷酸编码。遗传密码可用于选择适当的密码子来构建相应的变体。通过已知的方法，多核苷酸可用于生产多肽，且这些多肽可用于生产抗体。“融合”多肽是一种包括融合至或结合至异源多肽的多肽或其部分(例如，一个或多个域)的多肽。在一些实施方式中，可诱导的共刺激分子激动剂是一种抗体。术语“抗体”或“抗体部分(moiety) ”意图包括含有具有适合和识别表位的特定形状的含任何多肽链的分子结构，其中一个或多个非共价结合相互作用稳定分子结构和表位间的复合物。本发明利用的抗体可能是多克隆抗体，但优选单克隆抗体，因为它们可通过细胞培养或重组地进行复制，并可经过修饰来降低它们的抗原性。通过标准操作，通过用抗原组合物注射生产动物可产生多克隆抗体。见例如Harlow 和 Lane, Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988。当利用整个蛋白质、或蛋白质的较大段时，通过用蛋白质和合适的佐剂(如，弗氏、弗氏完全的、水包油乳液等)免疫生产动物可产生抗体。当利用较小的肽时，用较大的分子缀合肽来制备免疫刺激缀合物是有利的。用于这种目的的商业上可获得的常用缀合蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)和锁孔戚血蓝蛋白(KLH)。为了产生针对特定表位的抗体，可利用源自全序列的肽。或者，为了产生针对蛋白质靶的相对短的肽部分的抗体，如果多肽结合到载体蛋白质(比如卵清蛋白、BSA或者KLH)上可引起优异的免疫应答。或者，对于单克隆抗体,通过分离刺激的免疫细胞(比如来自接种动物脾的那些)可形成杂交瘤。这些细胞然后融合至永生细胞，如在细胞培养中能够无限复制的骨髓瘤细胞或转化细胞，从而产生永生的、分泌免疫球蛋白的细胞系。此外，通过遗传工程可产生抗体或抗原结合片段。当向人类施用时产生较少免疫应答的人源化、嵌合或异种人类抗体优选用于本发明。除了整个免疫球蛋白(或它们的重组对应物)以外,包括表位结合位点的免疫球蛋白片段(如，Fab'、F(ab' )2、或其它片段)可用作本发明的抗体部分。该抗体片段可通过蓖麻毒蛋白、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、或其它蛋白酶切割产生自整个的免疫球蛋白。可利用重组免疫球蛋白技术设计“片段”或最小的免疫球蛋白。例如，可通过将可变轻链区经过肽接头(如，不形成a螺旋或P片层基序的聚甘氨酸或其它序列)连接至可变重链区产生用于本发明的“ Fv ”免疫球蛋白。“增强效率”是指，与用单一剂(如特异于肿瘤细胞的单克隆抗体)所观察到的凋亡水平相比，ADCC介导的肿瘤细胞凋亡的增加。协同的，是指剂的组合提供比单一剂高的效果，这种效果可以高于所组合的各剂的添加的效果。针对肿瘤的抗体。一些抗体目前正在临床中用于癌症治疗，而其它的正处于临床开发的不同阶段。本发明方法的受关注抗体通过ADCC发挥作用，并典型地对肿瘤细胞有选择性，尽管如此本领域技术人员将认识到一些临床上有用的抗体实际上作用于非肿瘤细胞如 CD20。有许多抗原和相应的单 克隆抗体用于治疗B细胞恶性肿瘤。一种流行的靶抗原是CD20，其发现在B细胞恶性肿瘤上。利妥昔单抗是一种针对CD20抗原的嵌合的未缀合的单克隆抗体。CD20在B细胞激活、增殖和分化中有重要功能作用。单克隆抗体阿仑单抗靶向⑶52抗原，阿仑单抗表明对慢性淋巴细胞白血病的治疗。⑶22为一些抗体所靶向并且最近已证实与毒素组合在化疗耐受性毛细胞白血病中的疗效。两个新的靶向CD20的单克隆抗体，托西莫单抗和替伊莫单抗，已提交给食品和药品监督管理局(FDA)。这些抗体与放射性同位素缀合。本发明方法中有用的单克隆抗体包括但不限于依决洛单抗和曲妥珠单抗(赫赛汀)，已用于实体瘤。依决洛单抗靶向见于结肠癌和直肠癌的17-1A抗原，并已在欧洲批准用于这些适应症。其抗肿瘤作用是通过ADCC、CDC和抗独特型网络的诱导所介导的。曲妥珠单抗祀向HER-2/neu抗原。该抗原见于25%至35%的乳癌。曲妥珠单抗被认为以各种方式发挥作用下调ffiR-2受体表达、抑制过度表达HER-2蛋白质的人肿瘤细胞的增殖、增强免疫更新(immune recruitment)和抗过度表达HER-2蛋白质的肿瘤细胞的ADCC、以及下调血管生成因子。阿仑单抗(Campath)用于治疗慢性淋巴细胞白血病；结肠癌和肺癌；发现吉妥单抗(Mylotarg)用于治疗急性骨髓性白血病；发现替伊莫单抗(Zevalin)用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤；发现帕尼单抗(Vectibix)用于治疗结肠癌。在本发明方法中使用西妥昔单抗(Erbitux)也是受关注的。抗体结合至EGF受体(EGFR)，并已用于治疗实体瘤，包括结肠癌和头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)。术语“生物样本”包括多种获自生物体的样本类型，并且可用于诊断或监测试验。该术语包括生物来源的血液和其它液体样本、固体组织样本，如活检标本或组织培养物或由此衍生的细胞及其后代。该术语包括获取之后以任何方式操作过的样本，比如用试剂处理、溶解或某些成分的富集。该术语包括临床样本，还包括细胞培养中的细胞、细胞上清、细胞裂解物、血清、血浆、生物体液和组织样本。术语“癌症”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”本文互换使用是指这样的细胞，其表现相对自主的生长细胞，从而它们表现出一种异常的生长表型，特征在于细胞增殖控制的显著丧失。在一般情况下，本申请中检测或治疗的受关注的细胞包括癌前的(例如，良性)、恶性的、转移前的、转移的和非转移的细胞。特别受关注的是癌细胞的检测。如“正常细胞”的情况中所用的术语“正常”是指未转化表型的细胞或表现出被检查组织类型的非转化细胞形态的细胞。“癌症表型” 一般是指癌细胞特有的任何各种生物现象，这些现象可以随着癌症类型而不同。癌症表型通常通过例如在细胞生长或增殖(如，不受控制的生长或增殖)、细胞周期的调节、细胞运动、细胞-细胞相互作用、或转移等方面的异常来确定。受关注癌症包括但不限于包括白血病的造血性癌症、淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)、骨髓瘤和骨髓增生性疾病；肉瘤；黑色素瘤、腺瘤、实体组织癌、口腔、咽喉、喉和肺的鳞状细胞癌、肝癌、泌尿生殖系统癌症如子宫颈癌、膀胱癌和肾细胞癌、头颈癌、胃肠道癌和神经系统癌症、良性病变如乳头状瘤等。短语“实体瘤”如本文所用是指通常不包含囊肿或液体区域的组织的异常团块。实体瘤可能是良性或恶性的。不同类型的实体瘤根据形成它们的细胞类型而命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌、淋巴瘤等。针对特定的癌症表位或表位组合的单克隆抗体允许靶向和/或耗尽表达标志物的癌细胞群。使用单克隆抗体的各种技术可用于筛选表达标志物的细胞群，并包括使用抗体包被的磁珠的磁分离、用附着到固体基质(即板)上的抗体“筛选”和流式细胞术(见，例如，美国专利5, 985, 660 ;Morrison等人，Cell, 96 :737-49 (1999))。这些技术允许在活检样本的免疫组织化学中；在检测从癌细胞脱落入 血液和其它生物体液中的标志物的存在中等用于筛选特定的细胞群。本文所用术语“治疗”、“治”、“处理”等通常是指获得希望的药物和/或生理作用。该作用在完全或部分防止疾病或其症状方面可以是预防性的，和/或在部分或完全稳定或治愈疾病和/或可由疾病引起的不利作用方面可以是治疗性的。如本文所用“治疗”覆盖哺乳动物中(尤其是人)任何疾病的治疗，并包括(a)在对疾病或症状易感的但是尚未诊断患有疾病或症状的对象中，防上上疾病或症状的发生；(b)抑制疾病的症状，即停滞其发展；或(C)减轻疾病的症状，即引起疾病或症状的消退。术语“受体”、“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”本文互换使用，并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物对象，特别是人类。“治疗靶”是指由肿瘤细胞和/或非肿瘤(免疫)细胞表达的分子，其可以被靶向来诱导或增强抗肿瘤活性。方法提供增强由针对肿瘤细胞的抗体的施用所诱导的细胞杀伤效率的方法。向患者施用有效剂量的针对肿瘤的第一抗体，其诱导可诱导的共刺激分子如⑶137、0X40、GITR、⑶30或ICOS在NK细胞上的上调，NK细胞是对于ADCC关键的固有免疫效应细胞。随后，向所述个体施用有效剂量的抗这些分子之一的第二激动抗体，这些分子包括但不限于⑶137、0X40、GITR、⑶30或IC0S，其中第二抗体足以增强第一抗体所靶向的肿瘤细胞的ADCC杀伤。因为第二抗体靶向已通过针对肿瘤的抗体在NK细胞上可诱导表达的共刺激分子，该方法允许特异性刺激ADCC介导的肿瘤细胞杀伤中涉及的NK细胞，而省去其它NK细胞，从而限制了潜在的非特异性副作用。在一些实施方式中，在患者样本(通常患者的血液样本或其细胞部分)中确定由针对肿瘤的抗体诱导的共刺激分子(包括但不限于⑶137、0X40、GITR、⑶30、或ICO)的水平。作为基线，可以在施用针对肿瘤的抗体之前，确定样本中共刺激分子的水平，和可以在施用针对肿瘤的抗体之后确定表达的提闻。在本发明的一些实施方式中，向患者施用有效剂量的肿瘤选择性抗体，随后经过足够的时间使得CD137在免疫系统细胞(尤其是NK细胞)上的表达上调。该足够的时间通常是至少约12小时，更通常至少约18小时，通常至少约24小时，并可能至少约2天，至少约3天，并且不超过约5天，通常不超过约4天。⑶137上调之后，向所述个体施用有效剂量的CD137激动剂，其中激动剂足以增强由第一抗体所靶向的肿瘤细胞的ADCC杀伤。在一些实施方案中，在患者样本(通常患者的血液样本或其细胞部分)中确定⑶137的水平。作为基线，可以在施用肿瘤选择性抗体之前，确定样本品中CD137的水平，和可以在施用肿瘤选择性抗体之后确定表达的提高。⑶137在NK细胞上的表达希望的增加是至少约I. 5倍，至少约2倍或更高。当在整体血细胞中測量吋，由于污染的非反应细胞的数量，表达增加可能较低。“降低癌细胞的生长”包括但不仅限于，減少癌细胞的増殖和提高肿瘤细胞的凋亡。利用任何已知的试验，包括但不限于掺加[3H]-胸苷；计数一段时间的细胞数目；检测和/或测量与相关癌症有关的标志物等，可以容易地确定是否已实现癌细胞生长的减少。利用任何已知的癌症诊断试验，包括但 不限于活体检查、对比射线照相研究、CAT扫描和在个体血液中检测与癌症相关的肿瘤标志物，可以评价一种物质或特定量的该物质在治疗癌症中是否有效。可以全身或局部，通常是全身施用物质。制剂通过将具有所需纯度程度的抗体与任选的生理可接受载体、赋形剂或稳定剂混合，为了保存可作为冻干制剂或水溶液的形式来制备包括用于本发明方法中的ー种或多种抗体的治疗制剂(Remington, s Pharmaceutical Sciences第 16版，Osol,A. Ed. (1980))。以与良好医疗操作一致的方式配制、制剂和施用抗体组合物。在这方面考虑的因素包括正在接受治疗的特定癌症、个体患者的临床状況、剂的递送位点、施用方法、施用计划和医疗操作者已知的其他因素。待施用的抗体“治疗有效量”将受到这种考虑的控制。治疗剂量可能是至少约O. 01μ g/kg体重，至少约O. 05 μ g/kg体重；至少约O. I μ g/kg体重,至少约O. 5 μ g/kg体重,至少约I μ g/kg体重,至少约2. 5 μ g/kg体重,至少约5 μ g/kg体重,并且不超过约100 μ g/kg体重。本领域技术人员将理解，这些准则将根据如在使用抗体片段中，或在使用抗体缀合物中活性剂的分子量进行调整。剂量还可能根据施用途径变化。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度时对于受体是无毒的，并包括缓冲剂比如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸等；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸 ，防腐剂(比如氯化十八烷基ニ甲基苄基铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基苯甲酸酯类比如甲基或丙基苯甲酸酯；邻苯ニ酚；间苯ニ酚；环己醇；3_戊醇；间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物比如聚こ烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、ニ糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂比如EDTA ;糖比如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的反离子比如钠；金属复合物(如，锌蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN. TM. ,PLUR0NICS. TM.或聚こニ醇(PEG)。待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这很容易通过穿过无菌过滤膜的过滤实现。在本发明的另ー个实施方式中，提供了含有用于治疗上述疾病的材料的制造的物品。制造的物品包括容器和标签。合适的容器包括，例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。容器盛放对治疗病症有用的组合物，并且可具有无菌入口(例如，容器可能是静脉溶液袋或具有皮下注射针可穿刺的塞的小瓶)。组合物中的活性剂是ー种或多种上述抗体。容器上的或结合的标签表明组合物用于治疗所选择的条件。制造的物品可还包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液比如磷酸盐缓冲盐水、林格氏液和右旋糖溶液。它可还包括其它材料，从商业和用户的角度来看所需的其它缓冲剂、稀释齐IJ、过滤器、针、注射器和带有使用说明的包装内册。适用于本发明方法的抗体和激动剂可作为试剂盒的形式提供，例如存在于含有一个或多个含有活性成分的单位剂型的包装或分装装置中。该包装或装置可例如包括金属或塑料箔，比如吸塑包装。包装或分装装置可附有施用说明。也可制备包括可以配制于兼容的药物载体中的用于本发明方法的剂的组合物，将其置于适当的容器中以及贴上用于治疗指示的病症的标签。标签上指示的适用条件可包括癌症的治疗。试剂盒还包括适于测量NK细胞上可诱导的共刺激分子的表达的单元，如包括特异性结合可诱导的共刺激分子的可检测的带标记的试剂，和表达參照物以 及本领域已知的等。实验十年前治疗癌症的范例限于常规细胞毒性的化疗，假设迅速増殖的肿瘤细胞对剂(比如细胞周期抑制剂或DNA损伤剂)的敏感性増加。随着食品和药物管理局对利妥昔单抗的批准，这种范例在1997年改变了，利妥昔单抗是首个治疗性单克隆抗体并靶向表面标志物CD20用于非霍奇金淋巴瘤的治疗。单克隆抗体比常规细胞毒性的化疗具有独特的优势，即良好的耐受性，且较小的系统性毒性，对肿瘤的选择性和最小的脱靶效应，以及靶向未经历频繁有丝分裂的缓慢増殖的细胞的能力。利妥昔单抗的批准之后，在1998年批准了曲妥珠单抗用于HER2+乳癌，它是ー种抗HER2(人类表皮生长因子受体2)的人源化IgGl抗体。在2004年批准了西妥昔单抗用于结直肠癌，它是ー种靶向EGFR(表皮生长因子受体)的嵌合的IgGl抗体。在2006年，西妥昔单抗还被批准用于治疗头颈癌。正如最近HER2+胃癌和食管癌的鉴定所证明的，癌症疗法现在的重点是发现新的或当前的抗体可以靶向的新型的和已知的靶。与常规化疗相比，单克隆抗体证明最小的直接的细胞毒性。尽管证据支持多种抗体功能的机制，抗肿瘤活性的主要机制是通过抗体依赖性细胞细介导的细胞毒性(ADCC)。通过ADCC发生的细胞毒性是由带有Fe受体的自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞/单核细胞介导的，Fe受体结合抗体靶向的肿瘤细胞。结合至抗体的NK细胞Fe受体激活NK细胞，导致释放触发抗体靶向的肿瘤细胞凋亡的细胞因子和细胞毒性颗粒。提高的NK细胞的功能加强了 ADCC并产生改进的抗肿瘤活性。识别抗体包被的肿瘤细胞后，本发明鉴定在NK细胞上可诱导表达的共刺激分子，NK细胞是对于ADCC关键的固有效应细胞。被针对肿瘤的抗体上调之后，这些共刺激分子(包括但不限于⑶137、0X40、GITR、⑶30、或IC0S)可以随后用激动抗体靶向来增强这些效应细胞介导的ADCC。鉴于越来越多的针对肿瘤的靶特异性抗体，这对于单克隆抗体所直接靶向的任何癌症类型都具有治疗意义。增强NK细胞功能的激动抗体的临床益处仅受到肿瘤细胞所表达的靶和靶特异性抗体的数目的限制。鉴于利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗在过去十年的影响，发现靶和抗体的努力似乎仍然是活跃的研究領域。尽管激动性NK细胞抗体的应用将扩展到非霍奇金淋巴瘤、乳癌、结直肠癌和头颈癌以外，这四种仍然证明了临床益处的大小。抗体包被的肿瘤细胞触发NK细胞的激活，NK细胞的杀伤活性然后可以通过抗CD 137的第二激活抗体被刺激。激动性抗CD137抗体的加入是增强任何抗肿瘤抗体的治疗作用的通用方法。
实施例INK细胞暴露于利妥昔单抗包被的⑶20+淋巴瘤后，发生增强的⑶137的NK细胞表达。用激动抗体靶向CD137来增强抗肿瘤的ADCC依赖于其在暴露于抗体包被的肿瘤细胞之后在NK细胞上増加的表面表达。因为第二抗体靶向通过针对肿瘤的抗体(利妥昔单杭、曲妥珠单抗)在NK细胞上可诱导表达的共刺激分子(CD137)，该方法允许特异性刺激ADCC介导的肿瘤细胞(淋巴瘤、乳癌)杀伤中涉及的NK细胞，而省去其它NK细胞，从而限制了潜在的非特异性副作用。我们从由于慢性淋巴细胞白血病(CLL)、边缘区淋巴瘤(MZL)和⑶20+急性淋巴细胞白血病(ALL)而具有循环CD20+肿瘤细 胞的患者中分离了外周血单核细胞(PBMC)。用曲妥珠单抗或利妥昔单抗培养之后，通过流式细胞术分析PBMC。用利妥昔单抗培养之后，⑶137+NK细胞百分比从基线处的1-2%增加至22-43%，同时⑶16(Fc受体)下调。这似乎是抗体依赖性的，因为用曲妥珠单抗培养后没有发生激活。如图1A-1C所示，用CD20阳性肿瘤B细胞孵育之后，利妥昔单抗诱导CD137在人NK细胞上的上调。用淋巴瘤细胞系和曲妥珠单抗或利妥昔单抗培养24小时后，分析来自三个健康供体的外周血的CD137在CD3_CD56+NK细胞上的表达。抗CD137激动mAb增加利妥昔单抗介导的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，如图2A-2F所示。用下列五种条件培养24小时之后仅培养基fD20-阳性淋巴瘤细胞系(Raji、Ramos或DHL-4);肿瘤和利妥昔单抗；肿瘤和抗CD137抗体；或肿瘤、利妥昔单抗和抗CD137激动抗体，分析从健康供体外周血中分离并纯化的NK细胞的通过CD 107a动员的脱颗粒。如图3A-3D中所示，也有抗⑶137激动mAb的抗淋巴瘤活性的增强。如图4A-4B所示，抗⑶20和抗⑶137mAb组合活性需要适当的mAb施用顺序，并依赖于NK细胞和巨噬细胞。图5A- 中显示，对来自肿瘤接种后4天的生淋巴瘤的C57BL/6小鼠的外周血细胞亚群的CD137在CD3-NK1. I+NK细胞(NK)、F4/80+巨噬细胞(Mcp)、CD3+CD8+T细胞(⑶8)和⑶3+⑶4+T细胞(⑶4)上的表达进行分析，其中小鼠在第3天用IgG对照或抗CD20抗体进行治疗；对来自肿瘤接种后7天的生淋巴瘤的C57BL/6小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞的⑶137在⑶3 Κ1. I+NK细胞(NK)、F4/80+巨噬细胞(Μφ )、⑶3+⑶8+T细胞(⑶8)和⑶3+CD4+T细胞(⑶4)上的表达进行分析，其中小鼠在第3天用IgG对照或抗⑶20抗体进行治疗。通过用利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗在异种移植无胸腺的裸鼠模型中测试⑶137Ab的活性，验证了在同系小鼠模型中观察到的抗⑶20Ab和抗⑶137Ab疗法的协同作用是有效的。这种模型之前用于利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗的临床前测试。在淋巴瘤模型中，Balb/c裸nu/nu小鼠在第O天接种3X IO6转染有萤火虫荧光素酶的Raji细胞，并在第3天用利妥昔单抗治疗(10 μ g/g体重，IP)，随后在第4天用150 μ g大鼠抗小鼠抗⑶137Ab IP治疗。在第3天利妥昔单抗治疗前收集血液、在第4天抗⑶137Ab IP治疗前收集血液、以及在第5天收集血液，分析⑶137、⑶69和⑶16的NK细胞的表达。在第3天Ab疗法之前，IP荧光素注射(200 μ L)后进行生物发光成像，每周重复。用利妥昔单抗的⑶137的效果显示于播散性人类淋巴瘤异种移植模型中，如图6A-6C所示。利妥昔单抗包被的自体淋巴瘤细胞诱导⑶137在来自患有B细胞恶性肿瘤的人类患者的NK细胞上的上调，如图7A-7C中所示。仅用培养基、曲妥珠单抗或利妥昔单抗培养24小时后，分析来自患有B细胞恶性肿瘤的人类患者的外周血和循环肿瘤细胞(CTC)的⑶137在⑶3-⑶56+NK细胞上的表达。图8A-8C中预激活后分析NK细胞上⑶137的诱导和时序表达的动力学。用抗⑶20Ab或抗⑶137Ab单ー疗法降低约50%的肿瘤生长。然而，所有用抗⑶20Ab治疗的小鼠在60天之前死亡，而仅50%用抗⑶137Ab治疗的小鼠肿瘤接种后生存100天。在第3天用抗⑶20Ab治疗随后在第4天用抗⑶137Ab治疗导致肿瘤完全消退并且90%的小鼠存活100天。为了确定所观察到的协同作用是否依赖于NK细胞功能，在第-1、O天和此后每5天直至第20 天用抗-脱唾液酸基-GMl耗尽NK细胞，在这一点上观察到清晰的治疗组的分离。用抗-脱唾液酸基-GMl耗尽NK细胞取消了组合疗法的好处。抗CD137激动mAb増加细胞因子的释放和利妥昔单抗介导的预激活NK细胞的细胞毒性，如图9A-9B所示。为了评价NK细胞干扰素Y分泌，从健康PBMC中分离纯化的NK细胞，并与利妥昔单抗(10μ g/mL)和辐照的(5000拉德)淋巴瘤肿瘤细胞(Raji)以I : I的比例共同培养24小吋。24小时后，NK细胞经分离并用于纯度评估。预激活的纯化的NK细胞然后仅在培养基中、或単独用抗CD137mAb、単独用利妥昔单抗或利妥昔单抗加上抗CD137mAb培养4小吋，收获上清并通过ELISA分析干扰素-Y。NK细胞对Raji肿瘤细胞的细胞毒性在铬释放试验中进行分析，在有或没有在先的NK细胞预激活的情况下。抗CD137激动mAb还增加利妥昔单抗介导的NK细胞脱颗粒，显示于图10中。实施例2NK细胞暴露于曲妥珠单抗包被的HER2+乳癌后，发生增加的⑶137的NK细胞表达。然后，我们确定它们在暴露于曲妥珠单抗包被的乳癌之后，是否⑶137在NK细胞上的表达同样地増加。我们从健康供体的血液中分离NK细胞并将它们连同曲妥珠单抗或利妥昔单抗一起加入到乳癌细胞系中保持24小时，所述乳癌细胞系包括MCF7(非表达HER2的乳癌细胞系)和SKBR3 (过度表达HER2的乳癌细胞系)。然后通过流式细胞术分析NK细胞的⑶137表达，如图11所示。用如上所述针对乳癌细胞系的西妥昔单抗(10 μ g/mL)、利妥昔单抗(10 μ g/mL)或曲妥珠单抗(lOyg/mL)包被的适当肿瘤细胞系共培养之后确定CD137的NK细胞表达。进行⑶3和⑶56的流式细胞术来评价NK细胞分离物的纯度。包括⑶69、⑶107和CD16的其它激活标志物包括在流式细胞术的面板中。结肠癌细胞系包括HCT-8 (EGFR+)和SW620 (EGFR)，以及鳞状的头颈癌细胞系包括TE3 (EGFR+HER20和TE4 (EGFITHER2+)。如图12A-12C所示，如通过细胞活力测定的，抗⑶137激动mAb增加曲妥珠单抗介导的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。预激活的NK细胞在用MCF7、BT474M1和HER18孵育18小时之前进行纯化，并评价凋亡。还通过铬释放试验确定激活的NK细胞经抗体和肿瘤细胞刺激之后的功能能力。为了研究抗HER2+乳癌的活性，从正常血液中分离的NK细胞通过与SKBR3 (HER2+)和曲妥珠单抗共培养而激活。通过流式细胞术测试这些暴露的NK细胞的CD137和CD69的表达以评价其激活。激活的NK细胞按照12. 5 1、25 1、50 I和100 I的比例连同曲妥珠单抗(10μ g/mL)、抗 CD137Ab(10y g/mL)、或曲妥珠单抗 + 抗 CD137Ab (均为 10 μ g/mL) —起加入到铬标记的SKBR3靶细胞中。用HCT-8 (EGFR+)细胞系和西妥昔单抗进行相似的激活和杀伤试验来研究抗EGFR+结肠癌的体外功能活性、用TE3 (EGFR+HER2_)细胞系和西妥昔单抗进来研究EGFR+头颈癌的体外功能活性。如图13中所示，如通过铬释放測定的，抗CD137激动mAb增加曲妥珠单抗介导的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。在同系小鼠淋巴瘤模型中已经提供了支持性的证据，抗⑶137激动mAb增强曲妥珠单抗的体内抗乳癌活性。如图14A-14B所示，皮下注射O. 72mg/60天释放的β雌ニ醇丸之后I天，用5Χ106ΒΤ474Μ1乳房肿瘤细胞对nu/nu裸鼠皮下接种至腹部上。肿瘤接种后，小鼠然后或者在第3天接受大鼠IgG对照、在第3天接受曲妥珠单抗抗体，在第4天接受抗CD 137抗体、或在第3天接受曲妥珠单抗且在第4天接受抗CD137抗体，每周重复各治疗，共三周。然后监测小鼠的肿瘤生长和 总存活率。如图15A-15C所示，抗⑶137激动mAb增强曲妥珠单抗的体内抗乳癌活性，同时保留了 HER2特异性。皮下注射O. 72mg/60天释放的β雌ニ醇丸之后I天，用5Χ 106MCF7乳房肿瘤细胞对nu/nu裸鼠在左侧腹皮下接种，以及用5X 106HER18乳房肿瘤细胞在右侧腹皮下接种。肿瘤接种后，小鼠然后或者在第3天接受曲妥珠单抗，或在第3天接受曲妥珠单抗和在第4天接受抗CD137抗体，每周重复各治疗，共三周。然后监测代表性的小鼠的肿瘤生长。如图16所示，抗⑶137激动mAb增强曲妥珠单抗体内抗HER2+原发性乳房肿瘤的抗乳癌活性。200cGy全身辐射(TBI)后24小时，用I X 106HER2+原发性乳房肿瘤细胞通过乳房内注射来接种SCID小鼠。在第40天，将小鼠随机编入四组中的ー组，包括在第40天治疗的IgG对照、在第40天曲妥珠单抗治疗、在第41天抗CD137mAb治疗、或在第40天曲妥珠单抗且在第41天抗⑶137mAb治疗。在各组中每周重复治疗，共三次治疗。然后监测小鼠的肿瘤生长。实施例3如图17A-17B所示，用EGFR-阳性肿瘤细胞孵育之后，西妥昔单抗诱导⑶137在人类NK细胞上的上调。用头颈癌细胞系和仅培养基、利妥昔单抗或西妥昔单抗培养24小时后，分析来自三名健康供体的外周血的⑶137在⑶3てD56+NK细胞上的表达，和显示已增加的表达。如图18A-18C所示，如通过细胞活力测定的，抗⑶137激动mAb增加西妥昔单抗介导的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。预激活的NK细胞在用SCC6、PCl和SCC4孵育24小时之前进行纯化。用仅肿瘤、或肿瘤和NK细胞和培养基、西妥昔单抗、抗CD137、西妥昔单抗和抗CD137抗体培养之后，通过膜联蛋白和7AAD活力染色确定凋亡靶细胞的百分比。如通过铬释放测定的，抗CD137激动mAb增加西妥昔单抗介导的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。NK细胞对SCC6肿瘤细胞的细胞毒性在铬释放试验中进行測定。新鲜的且预激活的NK细胞在用铬标记的SCC6细胞孵育5小时之前进行纯化。图19中显示的是通过铬释放在不同的效应物(新鲜的NK细胞)祀(SCC6)细胞比率下靶细胞的裂解百分比。抗CD137激动mAb增强西妥昔单抗的体内抗头颈癌活性。如图20所示，用3X IO6SCCe头颈肿瘤细胞对nu/nu裸鼠皮下接种至腹部上。肿瘤接种后，小鼠或者在第21天接受大鼠IgG对照、在第21天接受西妥昔单抗、在第22天接受抗CD137抗体、或在第21天接受西妥昔单抗且在第22天接受抗⑶137抗体，每周重复各治疗，共三次治疗。然后监测小鼠的肿瘤生长。此外还显示，对患有头颈癌的患者输注西妥昔之后，循环NK细胞上调⑶137 (图21A-21B)。分析来自患有头颈癌的患者的新鲜外周血的⑶137在⑶3てD56+NK细胞上的表达，和显示所述表达被上调。当NK细胞暴露于抗体包被的肿瘤细胞之后激活出现在NK细胞上的特异性靶(⑶137)、以及针对这些宿主细胞上的⑶137靶的第二抗体在多种肿瘤模型中具有协同抗肿瘤活性，这种表现是创新的且对于患者护理有高度的影响。激动性抗CD137抗体(例如BMS-663513)目前在多个大型制药公司正处于早期阶段的临床试验中以及临床前开发中。在I期和II期临床试验中，约300名患者已经用BMS抗体进行了治疗。已观察到可忽略的单剂活性，反应率低于10%。基于我们的体外数据，没有共存的针对肿瘤的抗体(比如利妥昔单杭)时，没有观察到显着的NK细胞功能的増加。然而，当两种抗体 组合时NK细胞的功能显著增加。尽管在实体瘤中最小的单剂活性，因为有机会证明抗CD137组合抗体疗法的临床价值，所以本发明具有高度的重要性。以通过免疫调节的协同作用为基础的疗法是创新的，且成为转变改善患有很多类型癌症的患者生存的方法的范例。更广泛地，除了⑶137以外，我们已经观察到ー些当暴露于抗体包被的肿瘤细胞后在NK细胞上被上调的其它共刺激分子，如0X40和GITR。和CD137相似，预期用激动抗体靶向这些可诱导的共刺激分子来刺激并增强NK细胞功能，从而导致増加的ADCC。
权利要求
1.一种治疗癌症的方法，该方法包括 向个体施用癌细胞抗原选择性的第一抗体，经过一段足以诱导或上调可诱导的共刺激分子在NK细胞上的表达的时间后； 以有效增强Nk细胞抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的剂量向所述个体施用所述可诱导的共刺激分子的激动剂； 其中所述患者的肿瘤细胞群减少。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述可诱导的共刺激分子是⑶137、0X40、GITR、⑶30和ICOS中的一种或多种。
3.如权利要求I所述的方法，其中所述激动剂是单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的方法，其中第一抗体特异于⑶20、⑶19、⑶22、⑶52、Her2和表皮生长因子受体(ERFR)中的至少一种。
5.如权利要求I所述的方法，其中方法在减少肿瘤细胞群方面提供协同作用。
6.如权利要求I所述的方法，还包括在施用所述第一抗体之前以及施用所述激动剂之前，测量所述患者中所述可诱导的共刺激分子在NK细胞上的表达的步骤，其中所述激动剂在所述可诱导的共刺激分子在NK细胞上的表达增加之后施用。
7.如权利要求I所述的方法，其中所述癌症是淋巴瘤。
8.如权利要求I所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述实体瘤是乳癌。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述实体瘤是结肠癌。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述实体瘤是头颈癌。
12.如权利要求I所述的方法，其中癌细胞抗原选择性抗体特异于CD20。
13.如权利要求I所述的方法，其中癌细胞抗原选择性抗体特异于her-2。
14.如权利要求I所述的方法，其中癌细胞抗原选择性抗体特异于表皮生长因子受体(ERFR)。
15.如权利要求I所述的方法，其中癌细胞抗原选择性抗体特异于CD52。
16.如权利要求I所述的方法，其中癌细胞抗原选择性抗体特异于CD19。
17.如权利要求I所述的方法，其中癌细胞抗原选择性抗体特异于CD22。
全文摘要
公开了一种增强用于针对杀伤肿瘤细胞的疗法抗体导向的细胞的细胞毒性(ADCC)效率的方法。癌症特异性细胞表面抗原被单克隆抗体结合，从而刺激细胞毒性T细胞反应，其特征在于共刺激分子在T细胞上上调的细胞表面表达。通过随后施用第二抗体来加强ADCC反应，第二抗体是共刺激分子的激动剂。
文档编号A61K39/395GK102753195SQ201080063243
公开日2012年10月24日 申请日期2010年12月7日 优先权日2009年12月7日
发明者罗奇·乌奥, 罗纳德·莱维, 詹姆斯·托尔基亚, 阿拉什·阿什·阿里扎德, 霍尔布鲁克·科尔特, 马修·J·戈尔茨坦 申请人:小利兰·斯坦福大学托管委员会