专利名称：一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法
技术领域：
本发明涉及到一种提取总黄酮方法的领域，尤其是一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法。
背景技术：
目前，提取植物总黄酮的方法有直接提取法热水提取法、碱液提取法、有机溶剂提取法、超临界流体萃取法；辅助提取法微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酶解辅助提取法等。植物的有效成分黄酮类化合物往往是包裹在细胞壁内，大多数黄酮元是微溶于水的，黄酮苷是溶于水的，植物细胞壁是由纤维素等构成的，要使细胞壁内的黄酮物质最大限度地被提取剂捕捉，就必须细胞壁破碎。辅助提取法就是针对细胞壁破壁而设计的，其中酶解辅助提取法是有效的手段之一。酶解辅助提取法就是利用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等或其复合酶液，破坏掉以纤维素为主的细胞壁结构及其细胞间相连的果胶物质，以利于有效成分最大限度溶出的提取方法。但实验用的果胶酶、纤维素酶、蛋白酶都是纯度较高的食品级酶，价格较昂贵，且用完后需连续购买，不利于工业化的低成本运营。由于微生物发酵可产生由多种酶组成的复合酶，其中包括纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等，而这些复合酶可用于酶解法辅助提取植物黄酮，所以将微生物发酵所产生的复合酶直接用于酶解法辅助提取植物黄酮，具有可行性，且微生物可以自行繁殖培养，运用发酵法制得富含多种酶的复合酶，冷藏备用，无须单独购买各种单一酶，既节约了成本又可提高提取率。目前尚未见到直接将微生物发酵制得的复合酶液应用于酶解法辅助提取芒萁黄酮的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供了一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，具有低成本，提取时间短，提取温度低，一次性提取率高， 不使用有机溶剂，操作环境友好等特点。为实现上述目的，本发明的技术方案的步骤如下1、一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于包括以下步骤(1)微生物繁殖培养菌种活化，扩大培养，接于察氏斜面培养基，培养数天；(2)微生物发酵用无菌水将斜面上的孢子洗下，转入装有玻璃珠的无菌水中，震荡，制备孢子悬液，接种于灭过菌的固体发酵培养基中固体发酵基础培养基，代谢产生复合酶；(3)制备混合酶液；
(4)在特定温度下烘干芒萁茎叶，粉碎，过筛；(5)酶解法辅助提取总黄酮往芒萁粉末的浸泡液中，添加复合酶，在特定的温度范围内，特定的PH值范围内，提取一段时间，离心抽滤，即得到芒萁总黄酮提取液，并测量其总黄酮含量。2、所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤(1)所述的微生物是黑曲霉、米曲霉其中的一种或是两者的混合菌种，培养天数为 3 5天。3、所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤(2)所述的固体发酵基础培养基条件是麸皮10 15g，水15 20ml，pH值6 8。4、所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤( 所述的发酵条件是温度是30 36°C，培养时间是72 96小时。5、所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤C3)所述的制备混合酶液方法之一是将固体发酵的菌及培养基加水直接提取混合酶，冷藏备用。6、所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤C3)所述的制备混合酶液方法之二是将固体发酵的菌及培养基于60°C下烘干，粉碎，制成粉状干菌储藏。在酶解前称取粉状干菌，加水提取混合酶，冷藏备用。7、所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤⑷所述的烘干温度为70 90°C，，过筛目数为60 80。8、所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤( 所述的酶用量与提取液体积的比值为(Iml 5ml) 100ml，温度为40°C 70°C，pH值为4 8，提取时间为0. 5h 釙。与现有技术相比，本发明的优点与有益效果是本发明采用微生物发酵产生的复合酶辅助提取芒萁总黄酮，具有酶源稳定，低成本，工艺简单，操作方便，设备投资少，提取时间短，提取温度低，一次性提取率高，不使用有机溶剂，操作环境友好等特点，适合工业化生产。
具体实施例方式下面结合具体实例对本发明做进一步地说明实施例1 取适量黑曲霉菌种活化，扩大培养，接于察氏斜面培养基，培养3天；用无菌水将斜面上的孢子洗下，转入装有玻璃珠的无菌水中，震荡，制备孢子悬液，接种于灭过菌的固体发酵培养基中固体发酵基础培养基(麸皮10g，水15ml，pH自然于250ml三角瓶中)，36°C 培养72小时，代谢产生复合酶。将固体发酵的菌及培养基加水提取复合酶液，备用。往含芒萁5g、无菌水IOOml的浸泡液中，添加复合酶2. 5ml，提取温度为80°C，pH值为5，提取时间为2h，离心抽滤，即得到芒萁总黄酮提取液。以芦丁标准品为参照，用分光光度法测得总黄酮的提取率为23. 67%，相比不加酶时的提取率15. 提高了 55. 31%。实施例2 取适量米曲霉菌种活化，扩大培养，接于察氏斜面培养基，培养3天；用无菌水将斜面上的孢子洗下，转入装有玻璃珠的无菌水中，震荡，制备孢子悬液，接种于灭过菌的固体发酵培养基中固体发酵基础培养基(麸皮10g，水15ml，pH自然于250ml三角瓶中)，36°C 培养72小时，代谢产生复合酶。将固体发酵的菌及培养基于60°C下烘干，粉碎，制成粉状干菌储藏。需要时临时制备酶液称取粉状干菌，加水提取复合酶液，在4°C条件下存放备用。 往含芒萁5g、无菌水IOOml的浸泡液中，添加复合酶3. 5ml，提取温度为80°C，pH值为5，提取时间为3h，离心抽滤，即得到芒萁总黄酮提取液。以芦丁标准品为参照，用分光光度法测得总黄酮的提取率为23. 83%，相比不加酶时的提取率15. 提高了 56. 36%。
权利要求
1.一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于包括以下步骤(1)微生物繁殖培养菌种活化，扩大培养，接于察氏斜面培养基，培养数天；(2)微生物发酵用无菌水将斜面上的孢子洗下，转入装有玻璃珠的无菌水中，震荡， 制备孢子悬液，接种于灭过菌的固体发酵培养基中固体发酵基础培养基，代谢产生复合酶；(3)制备混合酶液；(4)在特定温度下烘干芒萁茎叶，粉碎，过筛；(5)酶解法辅助提取总黄酮往芒萁粉末的浸泡液中，添加复合酶，在特定的温度范围内，特定的PH值范围内，提取一段时间，离心抽滤，即得到芒萁总黄酮提取液，并测量其总黄酮含量。
2.根据权利要求1所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤(1)所述的微生物是黑曲霉、米曲霉其中的一种或是两者的混合菌种， 培养天数为3 5天。
3.根据权利要求1所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤( 所述的固体发酵基础培养基条件是麸皮10 15g，水15 20ml， pH值6 8。
4.根据权利要求1所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤( 所述的发酵条件是温度是30 36°C，培养时间是72 96小时。
5.根据权利要求1所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤C3)所述的制备混合酶液方法之一是将固体发酵的菌及培养基加水直接提取混合酶，冷藏备用。
6.根据权利要求1所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤C3)所述的制备混合酶液方法之二是将固体发酵的菌及培养基于60°C 下烘干，粉碎，制成粉状干菌储藏。在酶解前称取粉状干菌，加水提取混合酶，冷藏备用。
7.根据权利要求1所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤⑷所述的烘干温度为70 90°C，，过筛目数为60 80。
8.根据权利要求1所述的一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，其特征在于步骤( 所述的酶用量与提取液体积的比值为(Iml 5ml) 100ml，温度为40°C 70°C，pH值为4 8，提取时间为0. 5h 釙。
全文摘要
一种采用微生物发酵自制混合酶辅助提取芒萁总黄酮的方法，属于总黄酮提取方法的领域。主要解决总黄酮提取率低的问题。其过程是微生物菌种活化，扩大培养，采用固体发酵法制备复合酶备用，在特定料液比的芒萁浸泡液中加入复合酶1ml～5ml、提取温度为40℃～70℃，pH值为4～8，提取时间为0.5h～5h，离心抽滤，即得到芒萁总黄酮提取液。本发明涉及的提取总黄酮方法成本低，提取时间短，提取温度低，不使用有机溶剂，操作环境友好，一次性提取率高，本方法适合于科研实验及工业化生产，值得推广。
文档编号A61K36/11GK102166231SQ20111002047
公开日2011年8月31日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者丁利君, 孙俊, 熊俊娟 申请人:广东工业大学