专利名称：整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物领域，具体涉及用于预防和治疗新生血管性眼病的整合素阻断剂多肽。
背景技术：
新生血管生成，在正常生理条件下，受到高度调节，在生殖、胚胎发育、组织修复和创伤愈合中是必不可少的过程。血管生成是响应于多种前血管生成刺激物而发生的，所述的刺激物例如生长因子、细胞因子和其它生理学分子以及其它因素例如缺氧和低PH。新血管发育的血管生成的级联需要多种分子的协作，这种作用调节必要的细胞过程，例如细胞外基质(ECM)重塑、侵袭、迁移、增殖、分化和小管形成等。前血管分子例如VEGF、PDGF以及其它分子通过刺激它们的细胞表面受体来活化内皮细胞。这些被活化的细胞经过细胞增殖过程，来提高细胞粘附分子的表达，增加蛋白水解酶的分泌，增加细胞迁移和侵袭。许多不同的分子参与了促进增殖和侵袭过程，包括用于粘附的整联蛋白、选择蛋白和免疫球蛋白基因超家族的成员以及蛋白水解酶类。最终，衍生子细胞表面受体生化信号的复杂级联与细胞外基质组分和可溶性因子相互作用，导致腔管形成并且分化成成熟的血管。但是，血管生成在多种病理条件下也会发生，所述病理条件包括肿瘤生长和转移；炎性障碍，例如类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、炎性肠病、克隆病、溃疡性结肠类以及其它炎性障碍；眼部新血管生成，如早产儿视网膜病变、局部缺血性视网膜病变、视网膜静脉或动脉闭塞、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新生血管形成、年龄相关性黄斑变性(AMD)、 角膜新生血管形成、新生血管性青光眼或角膜移植以及多种其它眼病中的新血管生成。抑制新生血管的形成是治疗这类疾病的关键，而内皮细胞的增殖和迁移是新生血管形成的关键步骤。血管生成抑制剂是近年在治疗新生血管性疾病中引起重视的一类药物，这方面的研究已经取得了一些进展，渴望在今后成为一类新的有希望的治疗新生血管性疾病的药物，因此阻断新生血管形成可能成为治疗由于眼中血管生成导致的患者眼病的新手段。在这些血管生成抑制剂中，尤其以血管抑素和内皮抑素最引人注目。尽管这些血管抑制剂呈现出非常诱人的前景，但其缺陷也非常明显迄今为止的抑制血管生成药物，如内皮抑素、血管抑素等作用靶点不明确，它们对血管的专一性和选择性还不够好，效果有限， 导致实验中用药量较大。因此，一个好的抗血管生成药物应该对新生血管的标记分子具有选择性，以达到对新生血管的导向性作用，从整体上提高药物对血管生成的抑制作用做到只使用低剂量的药物，就能达到高效的抑制血管生成的效果。Avastin目前已经成功用于眼部疾病的治疗，而我国尚缺乏自主研制的此类药物。与血管生成相关的重要血管内皮细胞标记之一是整合素家族的部分成员。整合素是多种细胞外基质成分的受体，广泛存在于细胞表面，是一个相当大的受体家族。这类受体由一条α链和一条β链组成，在与配体的结合中都起作用，不同的α链和β链的组合决定了配体的特异性。
整合素家族的一部分成员(α5β1、ανβ3等)有一个共同的特征，即能够识别含有RGD (Arg-Gly-Asp)序列的配体。因此，RGD序列可以作为一种载体，靶向运输到新生血管内皮，从而对新生血管性疾病达到更高效率的治疗。本发明中三个多肽均属于含有RGD序列的整合素阻断分子，研究发现其具有高效抑制新生血管生成的活性，特别是对眼部血管异常性疾病有很好的作用。
发明内容
发明目的本发明对以下三个多肽即多肽I Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ；多妝II Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cy s-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro 以及多肽III mPEG -SC20k-IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-As P做了大量实验研究，发现其对新生血管性眼部疾病具有很好预防和治疗作用。技术方案 整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用。所述的整合素阻断剂具体是指多肽 I Jle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ar g-Gly-Asp(IVRRADRAAVPGGGGRGD)；多肽 II =Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-V aI-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(ACDCRGDCFCGGGGIVRRADRAAVP)；多肽 III :mPEG-SC20k-IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-G Iy-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp0上述三种多肽由本实验室提供。所述的多肽III是多肽I的聚乙二醇修饰产物，具体是指用20kD分子量的PEG对多肽I的N端进行修饰的产物。所述新生血管性眼病包括虹膜新生血管性眼病、脉络膜新生血管性眼病、视网膜新生血管性眼病或角膜新生血管性眼病。角膜新生血管性眼病是指角膜接触镜所致角膜新生血管性疾病，以及碱及其他化学物质烧伤、角膜手术、细菌感染、衣原体感染、病毒感染或原虫感染引起的角膜新生血管性眼病。所述的病毒为单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、牛痘苗、腺病毒。所述原虫为利什曼原虫、阿米巴原虫、疟原虫、弓形虫。所述虹膜新生血管性眼病，包括新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病变或视网膜中央静脉栓塞引起的虹膜新生血管性眼病。所述脉络膜新生血管性眼病，包括年龄相关性黄斑变性、中心性渗出性视网膜脉络炎、眼组织胞浆菌病综合征或葡行性脉络膜病变脉络膜新生血管性眼病。
所述指视网膜新生血管性眼病，包括糖尿病、肿瘤、视网膜脱落、视网膜中央静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、全身性红斑狼疮、Eales病或Coat病相关的视网膜新生血管性眼病。有益结果研究发现，本发明中的多肽序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pr ο具有抑制血管生成的作用。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列是整合素的一个重要配体，含有RGD序列的多肽X-Arg-Gly-Asp (X可以是1个或多个非极性氨基酸)能够特异性的识别整合素。本发明的整合素阻断剂多肽是在具有抑制血管生成作用的序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或另外一端连接上与整合素家族具有亲和性和结合能力的含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的X-Arg-Gly-Asp序列，构建出了一系列与整合素有亲和性和结合能力的整合素阻断剂多肽。由于RGD序列的靶向性，多肽可以靶向到眼部病理性新生血管内皮，抑制新生血管形成，进而达到预防或治疗新生血管性眼病的效果。实验证明多肽I、多肽II、多肽III均能够抑制人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖，在一定范围内呈剂量依赖关系；在鸡胚尿囊绒膜(CAM)体内血管生成活性实验中三种整合素阻断剂多肽显现出了抑制鸡胚尿囊绒膜新生血管生成的活性。实验结果表明，本发明的整合素阻断剂能够抑制血管的新生，具有潜在的治疗新生血管性疾病的作用。通过整合素阻断剂多肽对小鼠角膜新生血管和兔虹膜新生血管的作用，表明多肽 I、多肽II、多肽III三种整合素阻断剂均能够抑制角膜和虹膜新生血管的生长，有潜力开发为治疗角膜新生血管性眼病和虹膜新生血管性眼病的药物。脉络膜位于眼球后部，实验证明整合素阻断剂多肽能够改善脉络膜血流，说明用药后，通过全身循环或巩膜-葡萄膜-视神经途径，能尽快到达脉络膜，对年龄相关性黄斑变性(AMD)的脉络膜新生血管形成有抑制作用，可望用于早期AMD以及其它脉络膜新生血管性疾病的预防或治疗。同时通过整合素阻断剂多肽对大鼠脉络膜新生血管的作用，表明三种整合素阻断剂多肽能够抑制大鼠脉络膜新生血管的生成，说明三种整合素阻断剂对包括年龄相关性黄斑变性在内脉络膜新生血管性眼病具有一定的治疗作用。对OIR小鼠模型施用多肽I、多肽II、多肽III后，三种多肽均能够改善视网膜病理性新生血管的形成，减少了视网膜中新生血管丛。说明本发明的整合素阻断剂能够抑制小鼠眼部视网膜的新生血管形成，在一定程度上能够预防或治疗视网膜新生血管性眼病。 整合素阻断剂多肽对早产儿视网膜病变大鼠模型新生血管和糖尿病视网膜病变大鼠模型新生血管的作用，表明多肽I、多肽II、多肽III均能够抑制视网膜病理性新生血管的生长， 从而有希望作为治疗视网膜新生血管性眼病的药物。
附图1多肽I对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用；附图2多肽II对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用；附图3多肽III对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用；附图4鸡胚尿囊绒膜(CAM)分析多肽I、多肽II和多肽III的体内抑制血管生成活性试验；
附图5整合素阻断剂多肽对小鼠角膜新生血管的作用MVD计数附图6各实验组给药后不同时间CNV的发生率附图7多肽I、多肽II和多肽III对0 小鼠血管的影响。附图8各实验组视网膜血管内皮细胞核计数的比较
具体实施例方式实施例1整合素阻断剂多肽对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用采用MTT法检测整合素阻断剂多肽抑制人视网膜血管内皮细胞增殖的活性。 HRCEC细胞在37°C、5% CO2的培养箱中培养至密度90%以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3. 0 X IO4个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100 μ L，并于37°C，5 % CO2培养箱中培养过夜。将多肽I、多肽II、多肽III、Avastin用培养液稀释到各个预定浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中，每孔100 μ L。以加入整合素阻断剂多肽作为给药组，Avastin作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为空白对照组，在37°C，5% CO2培养箱孵育48小时。向 96孔板中每孔加入20 μ L 5mg/mL的MTT，继续培养4小时。吸去培养基，每孔加入100 μ L DMSO溶解。用酶标仪在570nm下检测，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率 (proliferation inhibition, PI),公式如下PI(% ) =1-给药组/阴性组表1.多肽I对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用
权利要求
1.整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述的整合素阻断剂具体是指多肽 I Jle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gl y-Asp ；多月太 II Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-CyS-Gly-Gly-Gly-Gly-IIe-Val-A rg-Arg-Ala—Asp-Arg_A1a—A1a-Va1-Prο ；多肽 III :mPEG-SC20k-IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-G Iy-Gly-Arg-Gly-Asp。
3.根据权利要求2所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述的多肽III是多肽I的聚乙二醇修饰产物，具体是指用20kD分子量的PEG对多肽I的N端进行修饰的产物。
4.根据权利要求1所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述新生血管性眼病包括虹膜新生血管性眼病、脉络膜新生血管性眼病、视网膜新生血管性眼病或角膜新生血管性眼病。
5.根据权利要求4所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于角膜新生血管性眼病为角膜接触镜所致角膜新生血管性疾病，以及碱及其他化学物质烧伤、角膜手术、细菌感染、衣原体感染、病毒感染或原虫感染引起的角膜新生血管性眼病。
6.根据权利要求5所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述的病毒为单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、牛痘苗、腺病毒。
7.根据权利要求5所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述原虫为利什曼原虫、阿米巴原虫、疟原虫、弓形虫。
8.根据权利要求4所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述虹膜新生血管性眼病，包括新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病变或视网膜中央静脉栓塞引起的虹膜新生血管性眼病。
9.根据权利要求4所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用，其特征在于所述脉络膜新生血管性眼病，包括年龄相关性黄斑变性、中心性渗出性视网膜脉络炎、眼组织胞浆菌病综合征或葡行性脉络膜病变脉络膜新生血管性眼病。
10.根据权利要求4所述的整合素阻断剂在制备治疗新生血管性眼病药物中的应用， 其特征在于所述指视网膜新生血管性眼病，包括糖尿病、肿瘤、视网膜脱落、视网膜中央静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、全身性红斑狼疮、Eales病或Coat病相关的视网膜新生血管性眼病。
全文摘要
本发明涉及药物领域，具体涉及具有整合素亲和性和结合能力的整合素阻断剂，该整合素阻断剂包括三个多肽，可用于新生血管性眼病的预防和治疗。所述的整合素阻断剂多肽具体是指多太I Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；多肽II Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro以及聚乙二醇修饰的多肽III mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。该整合素阻断剂可用于治疗的新生血管性眼病包括角膜新生血管性眼病、虹膜新生血管性眼病、脉络膜新生血管性眼病、视网膜新生血管性眼病等。
文档编号A61P9/10GK102205110SQ20111012846
公开日2011年10月5日 申请日期2011年5月18日 优先权日2011年5月18日
发明者徐寒梅, 李永兵 申请人:中国药科大学