专利名称：一种治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液的制备方法
技术领域：
本发明属于兽医生物制品技术领域，具体涉及一种治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液的制备方法。
背景技术：
猪博卡病毒(Porcine Bocavirus,PBoV)是一种无包膜的单链DNA病毒,归属于细小病毒科博卡病毒属。2005年，Allander首次从患呼吸道感染的婴幼儿中分离得到人的博卡病毒。自此以后，世界各地纷纷在呼吸道，血液，粪便，尿液等处发现博卡病毒。有呼吸道病症的患者感染博卡病毒的几率明显比正常人高。 2009年，在瑞典猪群中偶然发现猪群中存在PBoV，2010年我国猪群中也检测到PBoV。在临床上博卡病毒主要导致人、牛、猪等动物的下呼吸道感染和腹湾。而猪Kobu病毒(Porcine Kokuvirus)为小RNA病毒科成员，不同种属动物体内检测的Kobu病毒存在着差异，这类病毒是胃肠炎疾病的主要病原之一，弓丨起幼龄动物(猪、牛、人少数)高发病率和高死亡率，成年动物死亡率较低，但感染率同样很高，主要症状和传胃流腹极为相似。自2010年4月至今，韩国、泰国；我国的广东、福建、广西、江西、湖北、河北和山东规模化猪场的仔猪陆续发生严重腹泻哺乳仔猪多在出生后2-3天发生呕吐，随后发生剧烈腹泻，死亡率较高，有的地区出现腹泻后死亡率达到100%。而母猪和育肥猪无明显症状。按照流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒感染时的处理措施，基本无显著效果。临床解剖主要症状为胃肠道的严重出血。对严重腹泻仔猪采集的样本分析发现，流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒检测阳性率较低，阳性率不足5%,而猪博卡病毒(porcine bocavirus,PBoV)和Kobu病毒检测阳性率达到86. 6%。由此可见，PBoV和Kobu病毒是这次仔猪腹泻的罪魁祸首。但到目前为止，由于对该两种病毒的认识还不够深入，尚无有效的疫苗和防治措施，因此研制抗PBoV和Kobu病毒药物迫在眉睫。目前，卵黄抗体已经广泛运用于鸡、鸭、鹅、犊牛、仔猪和羔羊等动物疾病的紧急治疗和预防中，如鸡传染性法氏囊、鸡新城疫、鸡白痢、鸭病毒性肝炎、小鹅瘟、猪轮状病毒、犬瘟热、犬细小病毒病、羔羊轮状病毒腹泻、仔猪轮状病毒腹泻等。卵黄抗体是一种高产、优质的多克隆抗体，制备简单，容易提取，可以高效特异的对病毒性/细菌性疾病进行治疗；而且鸡大规模工业化饲养成本低，经济方便。同时使用卵黄抗体进行疾病治疗可以减少抗生素的使用，减少耐药株的出现，从而降低疫病控制成本。因此，卵黄抗体在生物制品的开发和疾病的防治方面具有广阔的前景。且迄今为止，运用卵黄抗体治疗猪呼吸道综合症的研究尚未有报到。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液及其制备方法，用于防治仔猪腹泻，在降低防疫成本和耐药性菌株产生的前提下，有效的提高动物的生产性能和疫病防治效果，且不会对人产生食源性污染和药物残留。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现一种治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液，以实验分离当前流行的毒株为基础，将分离的猪博卡病毒和猪Kobu病毒灭活后制备成二联灭活疫苗免疫非免疫母鸡，免疫后收集免疫母鸡所产鸡蛋，从蛋黄中提取出卵黄抗体将其制备成安全、高效的卵黄抗体注射液。上述的治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液的制备方法，包括以下步骤I)分离当前流行的PBoV和Kobu病毒，分别用猪肾原代细胞分离培养PBoV，用Vero细胞培养Kobu病毒，测定病毒滴度后制备成二联灭活疫苗，制备的疫苗中PBoV和Kobu病毒的TCID5tl不低于107/ml ；2)利用制备的二联灭活疫苗免疫非免产蛋母鸡，免疫程序如下与产蛋前30天首次免疫，免疫剂量为2ml/羽，首次免疫后2、4分别进行两次加强免疫,免疫剂量为3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫剂量为2ml/羽，以诱导母鸡持续性的产生抗PBoV和 Kobu病毒的抗体；3)第三次免疫后14天收集鸡蛋，运用75%乙醇消毒蛋壳，在无菌条件下收集卵黄，运用等量磷酸盐缓冲液(O. IM PBS, PH7. 2)后置组织匀浆器中，5000转/分匀浆I分钟，加入乳酸至PH为4. 0，2 8°C搅拌过夜，置-80°C冷冻后解冻，并重复冷冻一次，然后8000转/分离心10分钟，收集上清，按照I : I的比例加入饱和硫酸铵，2 8°C搅拌2消失，后2 8°C静置过夜，8000转/分离心10分钟收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸铵；4)运用微量中和实验测定PBoV和Kobu病毒的中和抗体效价；5)将效价测定好的卵黄抗体进行无菌检验,合格后无菌分装,使PBoV和Kobu病毒抗体效价不低于I : 64。本发明的有益效果为本发明中制备的卵黄抗体注射液为免疫球蛋白制剂，能够特异性的中和PBoV和Kobu病毒，可用于治疗临床上由PBoV和Kobu病毒单独感染或混合感染导致的仔猪腹泻；使用本发明中制备的注射液不仅可以治愈易感染上述病原的猪，同时对同群未感染上述病原的猪使用可以使其获得被动免疫；临床实验表明，使用本发明制备的产品后可以显著提高猪群生产性能；本发明制备成本低，见效快，本制品无毒副作用，使用后无药物残留，生产使用过程中对人畜无危害，同时使用本发明中制备的产品不会导致耐药菌毒株的出现，对食品安全无潜在的危害，适宜大规模推广。
具体实施例方式实施例I :PboV和Kobu病毒流行毒株的分离鉴定以及病毒TCID5tl测定I、PboV流行毒株的分离鉴定I)采集疑似PboV发病猪粪便，按照I : I的比例加入生理盐水稀释混匀后以500g的离心力低速离心10分钟，取离心上清分别按照1000IU/ml的比例加入青霉素、链霉素和卡那霉素，37°C放置I小时后接种猪肾原代细胞；37°C，5% CO2吸附2小时，期间每隔15分钟摇匀一次，吸附完成后除去病毒液，加入含2%胎牛血清的细胞培养液，37°C，5% CO2培养。每天观察细胞病变情况，如培养至5天后无细胞病变出现则将细胞培养物置_40°C反复冻融三次，12000转/分离心10分钟，取上清接种猪肾原代细胞细胞继续传代。以此类推连续进行传代。该分离毒株传代至第5代时在接种72小时后出现细胞病变。2)根据文献报到的方法，合成一对特异性引物P1、P2。其中Pl :GGGCGAGAACATTGAAGAGGT, P2 :TTGTGAGTATGGGTATTGGTG，扩增片段大小为 496bp。将出现细胞病变的病毒液上清提取DNA，运用PCR进行进行鉴定。如扩增出特异性的片段则判定为PBoV阳性。2、PBoV分离毒株的TCID5tl测定将生长良好的猪肾原代细胞运用胰酶消化后调整细胞浓度为5X105/ml，传代到96孔板中，每孔O. 1ml，然后置37°C，5% CO2培养。96孔板中细胞长满单层后，将培养液吸出，加入病毒稀释液，每个梯度8孔，每孔O. Iml。病毒液稀释按照10倍倍比稀释，选取IO1 IO9等9个稀释度进行病毒接种。加入病毒液后置37°C，5% CO2吸附2小时，然后去除病毒液，加入细胞维持液继续培养。培养4天后观察并记录细胞病变孔数，运用Reed-Muench氏法计算TCID5tlt5经计算该病毒的TCID5tl为106 25/ml。3、Kobu病毒流行毒株的分离鉴定以及病毒TCID5tl测定I)采集疑似Kobu病毒发病猪粪便，按照I : I的比例加入生理盐水稀释混匀后·以500g的离心力低速离心10分钟，取离心上清分别按照1000IU/ml的比例加入青霉素、链霉素和卡那霉素，37°C放置I小时后接种Vero细胞；37°C，5% CO2吸附2小时，期间每隔15分钟摇匀一次，吸附完成后除去病毒液，加入含2%胎牛血清的细胞培养液，370C ,5% CO2培养。每天观察细胞病变情况，如培养至5天后无细胞病变出现则将细胞培养物置_40°C反复冻融三次，12000转/分离心10分钟，取上清接种Vero细胞细胞继续传代。以此类推连续进行传代。该分离毒株传代至第3代时在接种72小时后出现细胞病变。2)根据文献报到的方法，合成一对特异性引物P3、P4。其中P3 TGGACGACCAGCTCTTCCTTAAACAC,P4 AGTGCAAGTGCAAGTCTGGGTTGCAGCCAACA,扩增片段大小为495bp。将出现细胞病变的病毒液上清提取RNA，运用RT-PCR进行进行鉴定。如扩增出特异性的片段则判定为Kobu病毒阳性。4、Kobu病毒分离毒株的TCID5tl测定将生长良好的Vero细胞运用胰酶消化后按照I : 4的比例传代到96孔板中，每孔O. 1ml，然后置37°C，5% CO2培养。96孔板中细胞长满单层后，将培养液吸出，加入病毒稀释液，每个梯度8孔，每孔O. Iml。病毒液稀释按照10倍倍比稀释，选取IO1 IO9等9个稀释度进行病毒接种。加入病毒液后置37°C，5% CO2吸附2小时，然后去除病毒液，加入细胞维持液继续培养。培养4天后观察并记录细胞病变孔数,运用Reed-Muench氏法计算TCID50 0经计算该病毒的TCID5tl为IO7 2Vml实施例2灭活疫苗的制备及免疫I、菌毒灭活分别将测定好菌毒滴度的菌毒液混合，混合后制备的疫苗中PBoV和Kobu病毒的TCID50不低于107/ml，混合后加入O. 2%的甲醛37°C灭活24小时，灭活检验合格后备用。2、灭活疫苗制备油相制备由注射用白油94体积份，加司本_80°C 6体积份，混合后,然后加硬脂酸铝(每100毫升混合液加入2克硬脂酸铝)，逐渐搅拌至透明为止，高压灭菌备用。水相制备取灭菌吐温_80°C 4体积份，加入灭活病毒液96体积份，充分振摇，使吐温-80°C完全溶解。
乳化取油相I体积份放于乳化缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入水相I体积份，加完后再以10000r/min搅拌2 5分钟，在终止搅拌前加入I %硫柳汞水溶液，使其终浓度为O. 01%，得到制备卵黄抗体用灭活疫苗。3、疫苗免疫非免疫母鸡产蛋前30天首次免疫,免疫剂量为2ml/羽，首次免疫后2、4分别进行两次加强免疫，免疫剂量为3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫剂量为2ml/羽，以诱导母鸡持续性的产生抗PBoV和Kobu病毒的抗体。实施例3卵黄抗体的制备和效价测定I、卵黄抗体的制备第三次免疫后14天收集鸡蛋，运用75%乙醇消毒蛋壳，在无菌条件下收集卵黄，·运用等量磷酸盐缓冲液(O. IM PBS, PH7. 2)后置组织匀浆器中，5000转/分匀浆I分钟，力口入乳酸至PH为4.0，2 8°C搅拌过夜，置-80°C冷冻后解冻，并重复冷冻一次，然后8000转/分离心10分钟，收集上清，按照I : I的比例加入饱和硫酸铵,2 8°C搅拌2消失，后2 8°C静置过夜，8000转/分离心10分钟收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸铵。2、PBoV和Kobu病毒抗体的效价测定I)细胞制备分别取猪原代肾细胞和Vero，运用胰酶消化调整细胞浓度为5 X IO5/ml,然后传代至96孔板中，每孔0. Iml,加入至96孔板后轻微前后左右摇晃,混匀细胞使其能够均匀贴壁。2)体外中和实验分别将PBoV病毒液和Kobu病毒进行稀释，稀释至2000TCID5(I/ml。取制备的卵黄抗体进行2倍倍比稀释，取21 21°等10个稀释度。每个稀释度取0. 4ml卵黄抗体稀释液分别加入等量的稀释病毒液，37°C水浴I小时使卵黄抗体与PBoV或Kobu病毒进行中和反应。3)细胞接种以及中和效价测定中和反应完毕后，将96孔板中细胞培养液去除，力口入中和反应后的混合液，其中PBoV中和后加入到猪原代肾细胞中，Kobu病毒中和后加入到Vero细胞中，每孔O. lml，37°C吸附I小时，然后去除吸附混合液，加入细胞维持液继续培养。培养4天后观察细胞病变孔数并记录,然后按照Reed-Muench氏法计算中和抗体效价。3、将效价测定好的卵黄抗体进行无菌检验,合格后无菌分装,使PBoV和Kobu病毒的抗体效价不低于I : 64。实施例42011年3月天津某猪场10日龄仔猪489头，出现腹泻症状，主要表现为食欲减退、并出现严重腹泻，个别猪出现呕吐等症状。发病率高达60 %，死亡病猪解剖主要症状为胃肠道严重出血。采集病猪肠道和排泄物进行PCR检测，检测结果为Kobu病毒阳性。随后对所有腹泻仔猪注射本发明制备的卵黄抗体进行治疗，每头猪注射3ml，每天I次连续3天，同时对未发病仔猪注射等剂量卵黄抗体进行预防。同时加强饲养管理，对严重腹泻猪进行补液，腹腔注射5%的葡萄糖氯化钠溶液，每头猪40ml，每天一次，另外与加强消毒等其它措施相结合。用卵黄抗体治疗后新发病例迅速减少，轻度腹泻猪只迅速好转，用药后3天无仔猪因腹泻死亡。
权利要求
1.一种治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液，其特征在于在于其包括从以PBoV和Kobu病毒二联灭活疫苗免疫非免疫产蛋母鸡后收集的免疫产蛋母鸡鸡蛋的卵黄中提取的卵黄抗体。
2.权利要求I所述的治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)分离当前流行的PBoV和Kobu病毒，分别用猪肾原代细胞分离培养PBoV，用VeiO细胞培养Kobu病毒，测定病毒滴度后制备成二联灭活疫苗； 2)利用制备的二联灭活疫苗免疫非免产蛋母鸡； 3)第三次免疫后14天收集鸡蛋，运用75%乙醇消毒蛋壳，在无菌条件下收集卵黄，运用等量磷酸盐缓冲液(O. IM PBS, PH7. 2)后置组织匀浆器中，5000转/分匀浆I分钟，加入乳酸至PH为4. 0，2 8°C搅拌过夜，置-80°C冷冻后解冻，并重复冷冻一次，然后8000转/分离心10分钟，收集上清，按照I : I的比例加入饱和硫酸铵,2 8°C搅拌2消失，后2 8°C静置过夜，8000转/分离心10分钟收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸铵； 4)运用微量中和实验测定PBoV和Kobu病毒的中和抗体效价； 5)将效价测定好的卵黄抗体进行无菌检验，合格后无菌分装，使PBoV和Kobu病毒抗体效价不低于I : 64。
3.权利要求2所述的治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液的制备方法，其特征在于，步骤I)中制备的疫苗中PBoV和Kobu病毒的TCID5tl不低于107/ml。
4.权利要求2或3所述的治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液的制备方法，其特征在于，步骤2)中，免疫程序如下与产蛋前30天首次免疫,免疫剂量为2ml/羽，首次免疫后2月、4月分别进行两次加强免疫，免疫剂量为3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫剂量为2ml/羽，以诱导母鸡持续性的产生抗PBoV和Kobu病毒的抗体。
全文摘要
本发明涉及一种治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液的制备方法，所述的卵黄抗体注射液以实验分离当前流行的毒株为基础，将分离的猪博卡病毒和猪Kobu病毒灭活后制备成二联灭活疫苗免疫非免疫母鸡，免疫后收集免疫母鸡所产鸡蛋，从蛋黄中提取出卵黄抗体将其制备成安全、高效的卵黄抗体注射液。本发明的有益效果为制备的卵黄抗体注射液能有针对性的对猪博卡病毒和猪Kobu病毒单独感染或混合感染病猪进行有效的治疗，同时可运用该注射液对同舍未感染仔猪注射进行预防；该注射液制备工艺简单可规模化生产并运用于临床。
文档编号A61K39/395GK102908620SQ20111022329
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者李帅伟, 廖荣斌 申请人:广州格拉姆生物科技有限公司