专利名称：一种广谱抗病毒的药物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中的创新药物，尤其涉及一种广谱抗病毒的药物及其制备方法和应用。
背景技术：
现今，引起人类病毒性疾病的病毒病原体越来越受关注，其中包括自然界新发突发病毒如禽流感病毒、SARS (冠状病毒)等，临床方面的病毒如肝炎病毒、HIV (艾滋病毒) 等，以及相关潜在的造成生物恐慌的病毒如天花、埃博拉病毒等。遗憾的是，对于上述病毒， 至今缺乏非常有效的预防性和治疗性措施，现主要的措施可以分为三大类1、干扰素和抗炎症因子虽然对部分病毒有效，但对其它类病毒缺乏特异性，由于自身是细胞类因子，如过量摄入，其与免疫系统等因子相互作用，会导致宿主细胞类因子水平失衡，产生较大副作用。2、特异性抑制因子对病毒复制转录等过程中所必需靶点起抑制作用的特异性抑制因子(如HIV蛋白酶抑制因子)，但其缺点是病毒发生突变，改变相应靶点时，能致使其有效的逃脱抑制因子的抑制作用，所以抑制因子不能迅速有效地应对新发突发的病毒病原体，药物使用后产生的副作用无法进行预测。3、疫苗由于针对不同病毒研制特异性疫苗的周期较长，对于新发突发病毒病原体的预防和治疗不是及时有效的，并且疫苗的研制困难也相当巨大，这主要体现在一、病毒种类繁多；二、同一种病毒其各种亚型复杂，例如疫苗只能特异性的针对一种病毒，对其他型别的病毒无交叉保护反应，宿主得不到很好的保护。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的上述缺点和不足，提供一种广谱抗病毒的药物及其制备方法和应用。本发明的目的是这样实现的技术思路设计一组基因重组蛋白质，其能特异性、快速、有效地引起受病毒感染细胞的凋亡，而不损害未受感染的宿主细胞。基因重组蛋白预防治疗与两个细胞天然机制相关联1、干扰素途径中的dsRNA (双链RNA)检测大部分病毒的基因组为双链RNA或单链RNA。病毒感染细胞在复制和转录期间产生dsRNA ；其余病毒基因组为DNA的病毒通过对称性转录同样能产生典型的dsRNA，相反未受感染的细胞通常不会产生，宿主细胞天然防御机制通过上述细胞是否产生dsRNA来进行检测、捕获和消灭受病毒感染的细胞。干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶由N末端包含的两个结构域dsRBMl和dsRBM2 (dsRNA结合基序1和2)和C末端的激酶结构域所组成，干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶与dsRNA相结合后，通过反向自磷酸化从而激活蛋白激酶，活化的蛋白激酶再磷酸化eIF_2a(转录因子)，因此能抑制病毒蛋白的翻译过程。2、细胞凋亡途径凋亡复合体包含胞内凋亡信号分子，比如凋亡蛋白酶活化因子1，FLICE(死亡受体)激活死亡结构域等。前体凋亡蛋白酶通过剪切活化进而激活下游的凋亡蛋白酶和一系列的细胞内蛋白质，从而杀死细胞。由于干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶激活进程和凋亡蛋白酶激活进程具有相似的途径以及各蛋白中各结构域都有良好的功能，所以上述的两条途径可以结合形成一条广谱抗病毒的新型途径。本基因重组蛋白质，其结构域包含dsRNA结合区、凋亡诱导区(凋亡蛋白酶原结合区)，如细胞内存在dsRNA，其将会检测到dsRNA并与之结合，进而诱导细胞的凋亡，相反如dsRNA不存在于细胞中，反应则不会发生。为了使其能在体内或体外细胞传递，在基因重组蛋白序列中加入转导标签序列，比如转录反式激活蛋白、蛋白转导结构域域-4、多聚精氨酸。这些转运标签蛋白能转运体内或者体外所有细胞类型中的蛋白分子，甚至能穿透血脑屏障。具体地说1、广谱抗病毒的药物广谱抗病毒的药物由蛋白转导标签、双链RNA检测结构域和细胞凋亡诱导结构域组成①蛋白转导标签蛋白转导标签为下列A、B或CA -M^iE^W^i^:^ (Trans-activator Transcription),氨基酸序列如SEQ NO. 1所示；B 蛋白转导结构域 4(Protein Transduction Domain 4)，氨基酸序列如SEQ N0. 2所示；C 多聚精氨酸(Polyarginine)，氨基酸序列如SEQ NO. 1所示。②双链RNA检测结构域双链RNA检测结构域为下列A、B或CA 干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶(Interferon-inducible RNA-dependent protein kinase),氨基酸序列如SEQ Ν0. 4所示；B :2-5A 依赖的核糖核酸酶(2-5A_d印endent ribonuclease)，氨基酸序列如SEQ N0. 5所示；C 牛痘病毒E3L蛋白(E3L)，氨基酸序列如SEQ N0. 6所示。③细胞凋亡诱导结构域细胞凋亡诱导结构域为下列A、B或CA 生长抑制基因 3 蛋白(Growth-inhibiting gene 3protein)，氨基酸序列如SEQ N0. 7所示；B ^JltS S BIiS^ "I (Apoptotic protease activating factor—I)，
氨基酸序列如SEQ NO. 8所示；C 鼠凋亡蛋白酶活化因子-1(murine Apoptotic protease activating factor-1),氨基酸序列如SEQ NO. 9所示。2、本广谱抗病毒药物的制备方法本广谱抗病毒药物的制备方法包括基因重组蛋白的构建、表达和纯化a、收集培养的细胞[如Hela细胞(来源于CCTCC)等]，利用Trizol法(来源于中国大连宝生物公司)提取细胞总RNA ；b、对提取的细胞总RNA，利用针对上述基因重组蛋白各区域设计的特异性引物 (注附带酶切位点)，进行一步PCR扩增，即先利用随机引物进行反转录，将RNA反转录成 cDNA，再利用特异性引物扩增得到相应的基因重组蛋白各区域序列；C、切胶回收目的片段，连接T载体测序验证所扩增序列正确性；d、分别对目的片段和pET32a(原核生物表达载体)进行双酶切和连接，构建基因重组蛋白克隆；e、将构建好的克隆转化大肠杆菌(BL21)，IPTG (异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导目的蛋白的表达(注转导标签位于N/C端或NC两端)；f、根据表达蛋白质His-Tag(组氨酸标签)，将重组蛋白过滤His融合蛋白纯化柱， 得到纯化的基因重组蛋白质。3、本广谱抗病毒药物的应用①细胞模型实验a、取培养好的细胞，如Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)，分A、B两组并作好标记；b、A组作对照组，B组接种病毒，如肠道病毒等；c、在A组细胞中(如7瓶)，同时分别对应加入(如7种)ddH20(双蒸水作对照组)、基因重组蛋白、基因重组蛋白突变体(dsRNA检测结构域干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶氨基酸序列F10E)、大肠杆菌提取物、基因重组蛋白各组分(缺失蛋白转导标签的基因重组蛋白A、缺失dsRNA检测结构域的基因重组蛋白B以及缺失细胞凋亡诱导结构域的基因重组蛋白质C)并作标记；d、在B组接种病毒细胞中，分别加入c步骤中的各成分并作标记；e、A、B组细胞添加上述各种成分后，置于CO2培养箱培养3 5天时间；f、3 5天后，将A、B组细胞置于显微镜下观察记录各组细胞的存活率；g、结果判断A组细胞中，即未接种病毒的细胞，对照组细胞生长正常，细胞存活率高，与对照组细胞相比，其余细胞，细胞存活率相近，接近100%，说明加入的其余六种物质，即基因重组蛋白、基因重组蛋白突变体、大肠杆菌提取物、基因重组蛋白各组分对细胞生长无毒副作用；B组细胞中，即接种病毒的细胞，对照组细胞全部死亡，与对照组细胞相比，加入的成分大肠杆菌提取物、基因重组蛋白各组分(共三个)，细胞存活率都接近为0 ；加入的成分基因重组蛋白突变体，细胞存活存活率接近为50%，而加入的成分基因重组蛋白细胞存活率接近为100%，由此说明基因重组蛋白在抗病毒治疗中发挥良好功效。
②动物模型实验a、取饲养小鼠，如BALB/c小鼠，分A、B两组并作标记；b、A组作对照组，B组小鼠鼻腔接种病毒；C、同时A组小鼠中，分别对小鼠的鼻腔注射IOOnM的基因重组蛋白以及注射缓冲液(作对照组)；d、B组小鼠中，依据c步骤依次注射作标记；e、继续饲养5 7天，过后记录小鼠存活情况并作记录；f、结果判断A组小鼠中，即未接种病毒的小鼠，对照组小鼠正常，与对照组相比，注射基因重组蛋白的小鼠存活，说明加入的基因重组蛋白对小鼠无毒副作用；B组小鼠中，即接种病毒的小鼠，对照组小鼠全部死亡，与对照组相比，注射基因重组蛋白，小鼠全部存活，说明基因重组蛋白在抗病毒治疗中发挥功效。③本广谱抗病毒药物的抗病毒范围本广谱抗病毒药物对在感染细胞期间产生dsRNA的DNA或RNA病毒起抗病毒作用；如流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒、鼻病毒、肠道病毒、风疹病毒、麻疹病毒、乙脑病毒、腮腺炎病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒、肝炎病毒和艾滋病毒等。本发明具有下列优点和积极效果①依据纯细胞抗病毒天然机制设计，可靠性高；②广谱抗病毒，特异性高；③无毒副作用，安全性高；④实验结果重复性好，易于推广；⑤研制生产简便，成本低廉。
图1是基因重组蛋白有效抵抗MDCK细胞中流感病毒Hmi的感染坐标图；其中横坐标是加入的各种组分；纵坐标是细胞的存活率。图2是基因重组蛋白有效抵抗BALB/c小鼠中流感病毒Hmi的感染坐标图；其中横坐标是加入的各种组分；纵坐标是小鼠的存活数。图3是基因重组蛋白有效抵抗RD细胞中肠道病毒71型的感染坐标图；其中横坐标是加入的各种组分；纵坐标是细胞的存活率。图4是基因重组蛋白有效抵抗BALB/c小鼠中肠道病毒71型的感染坐标图；其中横坐标是加入的各种组分；纵坐标是小鼠的存活数。
具体实施例方式下面结合附图和实施例详细说明一、实施例1取已培养好的MDCK细胞(狗肾细胞)、120pfu/Well的流感病毒Hmi标准品、 IOOnM的基因重组蛋白液(即广谱抗病毒药物)以及IOOnM的阴性参照物，如基因重组蛋白
6各组分、基因重组蛋白突变体以及大肠杆菌提取物。1、选取一种类型的广谱抗病毒的药物广谱抗病毒的药物由蛋白转导标签、双链RNA检测结构域和细胞凋亡诱导结构域组成①蛋白转导标签蛋白转导结构域 4 (Protein Transduction Domain 4)，氨基酸序列如SEQ NO. 2所示；②双链RNA检测结构域干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶(Interferon-inducible RNA-dependent prote in kinase),氨基酸序列如SEQ Ν0. 4所示；③细胞凋亡诱导结构域IJltS S BIiS^ "I (Apoptotic protease activating factor—I)，氨基酸序列如SEQ NO. 8所示；2、本广谱抗病毒药物的制备a、收集培养好的Hela细胞(来源于CCTCC)，利用Trizol法(来源于日本宝生物公司)提取细胞总RNA ；b、对提取的细胞总RNA，利用针对上述基因重组蛋白的三个区域设计特异性引物三对，进行一步PCR扩增，即先利用随机引物对提取的RNA进行反转录，然后将RNA反转录成cDNA，再利用特异性三对引物分别扩增得到相应的基因重组蛋白各区域序列；C、切胶回收三条目的片段，连接T载体测序验证所扩增序列正确性；d、对三条目的片段和pET32a (原核生物表达载体)进行双酶切和依次连接，构建好本基因重组蛋白克隆(注转导标签位于蛋白N/C端或NC两端)；e、将构建好的克隆转化大肠杆菌(BL21)，IPTG (异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导目的蛋白的表达；f、根据表达蛋白质HiS-Tag(组氨酸标签)，将基因重组蛋白过滤His融合蛋白纯化柱，得到纯化的基因重组蛋白质，稀释为终浓度IOOnM ；g、依据上面的方法，可分别构建缺陷的基因重组蛋白质组分，如缺失蛋白转导标签的基因重组蛋白、缺失dsRNA检测结构域的基因重组蛋白以及缺失细胞凋亡诱导结构域的基因重组蛋白质；同时利用PCR定位突变方法构建基因重组蛋白突变体。3、本广谱抗病毒药物的应用①细胞模型实验a、取培养好的MDCK细胞共14瓶，分A、B两组，每组7瓶并作好标记；b、A组作对照组，B组接种120pfu/well流感病毒Hmi标准品IOOul ；c、同时A组7瓶细胞中，分别加入ddH20(双蒸水作对照组)UOOnM基因重组蛋白、基因重组蛋白突变体(dsRNA检测结构域干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶氨基酸序列 F10E)、大肠杆菌提取物、基因重组蛋白各组分(缺失蛋白转导标签的基因重组蛋白A、缺失 dsRNA检测结构域的基因重组蛋白B以及缺失细胞凋亡诱导结构域的基因重组蛋白质C)各 IOOul并作标记；
d、B组7瓶接种流感病毒Hmi细胞中，分别加入c步骤中的各成分并作标记；e、A、B组细胞添加上述各种成分后，置于CO2培养箱培养3天时间；f、三天后，将A、B组细胞置于显微镜下观察记录各组细胞的存活率；g、结果判断A组细胞中，即未接种病毒的细胞，对照组细胞生长正常，细胞存活率高，与对照组细胞相比，其余6瓶细胞，细胞存活率相近，接近100%，见图1，说明加入的其余六种物质， 即基因重组蛋白、基因重组蛋白突变体、大肠杆菌提取物、基因重组蛋白各组分对细胞生长无毒副作用；B组细胞中，即接种病毒的细胞，对照组细胞全部死亡，与对照组细胞相比，加入的成分大肠杆菌提取物、基因重组蛋白各组分(共三个)，共4瓶细胞存活率都接近为0 ；加入的成分基因重组蛋白突变体，细胞存活存活率接近为50%，而加入的成分基因重组蛋白细胞存活率接近为100%，见图1，由此说明基因重组蛋白在抗病毒治疗中发挥良好功效。②动物模型实验a、取饲养7星期龄的BALB/c小鼠共12只，分A、B两组，每组6只并作标记；b、A组作对照组，B组小鼠鼻腔接种120pfu/well流感病毒HlNl标准品IOOul ；C、同时A组小鼠中，分别对3只小鼠的鼻腔注射IOOnM的基因重组蛋白以及另外 3只注射缓冲液(作对照组)各IOOul ；d、B组6只小鼠中，依据c步骤依次注射作标记；e、继续饲养5天，过后记录小鼠存活情况并作记录；f、结果判断A组小鼠中，即未接种病毒的小鼠，对照组小鼠正常，与对照组相比，注射IOOnM的基因重组蛋白的小鼠存活，见图2，说明加入的基因重组蛋白对小鼠无毒副作用；B组小鼠中，即接种病毒的小鼠，对照组小鼠全部死亡，与对照组相比，注射IOOnM 的基因重组蛋白，小鼠全部存活，见图2，说明基因重组蛋白在抗病毒治疗中发挥功效。二、实施例2取已培养好的RD细胞(人横纹肌肉瘤细胞)、120pfu/Well的肠道病毒71型标准品、IOOnM的基因重组蛋白液(即广谱抗病毒药物)以及IOOnM的阴性参照物，如基因重组蛋白各组分、基因重组蛋白突变体以及大肠杆菌提取物。1、选取一种类型的广谱抗病毒的药物广谱抗病毒的药物由蛋白转导标签、双链RNA检测结构域和细胞凋亡诱导结构域组成①蛋白转导标签蛋白转导结构域 4 (Protein Transduction Domain 4)，氨基酸序列如SEQ NO. 2所示；②双链RNA检测结构域干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶(Interferon-inducible RNA-dependent protein kinase),氨基酸序列如SEQ Ν0. 4所示；③细胞凋亡诱导结构域
IJlts S BIiS^ -1 (Apoptotic protease activating factor—I)，氨基酸序列如SEQ NO. 8所示；2、本广谱抗病毒药物的制备①基因重组蛋白的构建、表达和纯化a、收集培养好的Hela细胞(来源于CCTCC)，利用Trizol法(来源于日本宝生物公司)提取细胞总RNA ；b、对提取的细胞总RNA，利用针对上述基因重组蛋白的三个区域设计特异性引物三对，进行一步PCR扩增，即先利用随机引物对提取的RNA进行反转录，然后将RNA反转录成cDNA，再利用特异性三对引物分别扩增得到相应的基因重组蛋白各区域序列；C、切胶回收三条目的片段，连接T载体测序验证所扩增序列正确性；d、对三条目的片段和pET32a (原核生物表达载体)进行双酶切和依次连接，构建好本基因重组蛋白克隆(注转导标签位于蛋白N/C端或NC两端)；e、将构建好的克隆转化大肠杆菌(BL21)，IPTG (异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导目的蛋白的表达；f、根据表达蛋白质His-Tag(组氨酸标签)，将基因重组蛋白过滤His融合蛋白纯化柱，得到纯化的基因重组蛋白质，稀释为终浓度IOOnM ；g、依据上面的方法，可分别构建缺陷的基因重组蛋白质组分，如缺失蛋白转导标签的基因重组蛋白、缺失dsRNA检测结构域的基因重组蛋白以及缺失细胞凋亡诱导结构域的基因重组蛋白质；同时利用PCR定位突变方法构建基因重组蛋白突变体。3、本广谱抗病毒药物的应用①细胞模型实验a、取培养好的RD细胞共14瓶，分A、B两组，每组7瓶并作好标记；b、A组作对照组，B组接种120pfu/Well肠道病毒71型标准品IOOul ；c、同时A组7瓶细胞中，分别加入ddH20(双蒸水作对照组)UOOnM基因重组蛋白、基因重组蛋白突变体(dsRNA检测结构域干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶氨基酸序列 F10E)、大肠杆菌提取物、基因重组蛋白各组分(缺失蛋白转导标签的基因重组蛋白A、缺失 dsRNA检测结构域的基因重组蛋白B以及缺失细胞凋亡诱导结构域的基因重组蛋白质C)各 IOOul并作标记；d、B组7瓶接种肠道病毒71型细胞中，分别加入c步骤中的各成分并作标记；e、A、B组细胞添加上述各种成分后，置于CO2培养箱培养3天时间；f、三天后，将A、B组细胞置于显微镜下观察记录各组细胞的存活率；g、结果判断A组细胞中，即未接种病毒的细胞，对照组细胞生长正常，细胞存活率高，与对照组细胞相比，其余6瓶细胞，细胞存活率相近，接近100%，见图3，说明加入的其余六种物质， 即基因重组蛋白、基因重组蛋白突变体、大肠杆菌提取物、基因重组蛋白各组分对细胞生长无毒副作用；B组细胞中，即接种病毒的细胞，对照组细胞全部死亡，与对照组细胞相比，加入的成分大肠杆菌提取物、基因重组蛋白各组分(共三个)，共4瓶细胞存活率都接近为0 ；加入的成分基因重组蛋白突变体，细胞存活存活率接近为50%，而加入的成分基因重组蛋白细胞存活率接近为100%，见图3，由此说明基因重组蛋白在抗病毒治疗中发挥良好功效。②动物模型实验a、取饲养7星期龄的BALB/c小鼠共12只，分A、B两组，每组6只并作标记；b、A组作对照组，B组小鼠鼻腔接种120pfu/Well肠道病毒71型标准品IOOul ；C、同时A组小鼠中，分别对3只小鼠的鼻腔注射IOOnM的基因重组蛋白以及另外 3只注射缓冲液(作对照组)各IOOul ；d、B组6只小鼠中，依据c步骤依次注射作标记；e、继续饲养5天，过后记录小鼠存活情况并作记录；f、结果判断A组小鼠中，即未接种病毒的小鼠，对照组小鼠正常，与对照组相比，注射IOOnM的基因重组蛋白的小鼠存活，见图4，说明加入的基因重组蛋白对小鼠无毒副作用；B组小鼠中，即接种病毒的小鼠，对照组小鼠全部死亡，与对照组相比，注射IOOnM 的基因重组蛋白，小鼠全部存活，见图4，说明基因重组蛋白在抗病毒治疗中发挥功效。
权利要求
1.一种广谱抗病毒的药物，其特征在于广谱抗病毒的药物由蛋白转导标签、双链RNA检测结构域和细胞凋亡诱导结构域组成①蛋白转导标签为下列A、B或CA 转录反式激活蛋白，氨基酸序列如SEQ NO. 1所示； B 蛋白转导结构域4，氨基酸序列如SEQ NO. 2所示； C 多聚精氨酸，氨基酸序列如SEQ NO. 3所示；②双链RNA检测结构域为下列A、B或CA 干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶，氨基酸序列如SEQ NO. 4所示； B :2-5A依赖的核糖核酸酶，氨基酸序列如SEQ NO. 5所示； C 牛痘病毒E3L蛋白，氨基酸序列如SEQ NO. 6所示；③细胞凋亡诱导结构域为下列A、B或CA 生长抑制基因3蛋白，氨基酸序列如SEQ NO. 7所示； B 凋亡蛋白酶活化因子-1，氨基酸序列如SEQ NO. 8所示； C 鼠凋亡蛋白酶活化因子-1，氨基酸序列如SEQ NO. 9所示。
2.按权利要求1所述的一种广谱抗病毒的药物的制备方法，其特征在于 本广谱抗病毒药物的制备方法包括基因重组蛋白的构建、表达和纯化a、收集培养的细胞，利用Trizol法提取细胞总RNA；b、对提取的细胞总RNA，利用针对上述基因重组蛋白各区域设计的特异性引物，进行一步PCR扩增，即先利用随机引物进行反转录，将RNA反转录成cDNA，再利用特异性引物扩增得到相应的基因重组蛋白各区域序列；c、切胶回收目的片段，连接T载体测序验证所扩增序列正确性；d、分别对目的片段和pET32a进行双酶切和连接，构建基因重组蛋白克隆；e、将构建好的克隆转化大肠杆菌，IPTG诱导目的蛋白的表达；f、根据表达蛋白质His-Tag，将重组蛋白过滤His融合蛋白纯化柱，得到纯化的基因重组蛋白质。
3.按权利要求1所述的一种广谱抗病毒的药物的应用，其特征在于①细胞模型实验；②动物模型实验；③对在感染细胞期间产生dsRNA的DNA或RNA病毒起抗病毒作用。
全文摘要
本发明公开了一种广谱抗病毒的药物及其制备方法和应用，涉及生物技术领域中的创新药物。本药物由蛋白转导标签、双链RNA检测结构域和细胞凋亡诱导结构域组成。本制备方法包括基因重组蛋白的构建、表达和纯化。本应用包括细胞模型实验、动物模型实验和对在感染细胞期间产生dsRNA的DNA或RNA病毒起抗病毒作用。本发明依据纯细胞抗病毒天然机制设计，可靠性高；广谱抗病毒，特异性高；无毒副作用，安全性高；实验结果重复性好，易于推广；研制生产简便，成本低廉。
文档编号A61P31/20GK102349995SQ20111032489
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月24日 优先权日2011年10月24日
发明者石迎迎, 项荣 申请人:武汉大学