专利名称：载紫杉醇纳米微泡及其制备方法
技术领域：
本发明属于医疗药物领域，具体的说，涉及一种载紫杉醇纳米微泡及其制备方法。
背景技术：
先天性或后天性血管血管狭窄病变经介入手术治疗后，常发生再狭窄。其主要病理基础是血管平滑肌细胞增生迁移所引起的新生内膜增生。微管抑制剂紫杉醇具有微管动力学稳定作用，抑制纺锤体的正常形成，且抑制与细胞分裂有关的跨膜信号转导和基因表达，因此其阻断细胞有丝分裂和增生的效果确切。实验表明紫杉醇可抑制VSMCs的分裂和增殖，在再狭窄模型中能明显减轻新生内膜增生。紫杉醇为白色或类白色粉末，脂溶性高，在水中的溶解度< 0. 004g ·Ι^。口服几乎不吸收。现临床应用的紫杉醇注射液由乳浮EUcremoophor EL，含聚氧乙烯蓖麻油)/无水乙醇(50 50，ν/ν)制成的无色粘稠状浓溶液，使用时用5%右旋糖酐或生理盐水稀释成 0. 3-1. 2g · L—1溶液后静脉滴注3-24h，输注剂量为135_175mg · πΓ2，最大耐受剂量(MTD)为 3h内输注225-240mg ·πΓ2。虽然解决了紫杉醇的溶解问题，但由于毒副作用大，患者难以耐受。故开发新的剂型，尤其是供注射的靶向新剂型是目前的研究热点。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种无毒副作用，稳定性好的载紫杉醇纳米微泡及其制备方法。本发明目的之一是这样实现的一种载紫杉醇纳米微泡，其关键在于所述微泡由类脂质双分子层构成膜，内含N2,所述类脂质双分子层包含亲水基团与疏水基团，所述亲水基团链接紫杉醇，将紫杉醇载入类脂质双分子层构成的膜中，所述类脂质双分子层由卵磷脂、胆固醇、PEG-4000、葡聚糖、司班-80、甲醇、乙醚、3% 6% HSA(人血白蛋白)、紫杉醇标准品、PBS液体的复合构成。本发明目的之二是这样实现的一种载紫杉醇纳米微泡的制备方法，其关键在于按如下步骤进行(1)将0. 1 0. 15g卵磷脂，0.04 0.06g胆固醇放入旋转蒸发仪的反应瓶中，力口入乙醚溶解卵磷脂和胆固醇；40°C水浴，旋转蒸发仪工作，见反应瓶底部形成一层干燥薄膜结束反应，将乙醚回收入一个瓶子中，妥当保存；(2)配置 0. 01M, PH = 7. 4 的 PBS 缓冲液；(3)在步骤(1)反应瓶中加入PBS液，45°C水浴，磁力搅拌器勻速搅拌，同时加入0.4 0. 6gPEG-4000,0. 07g 0. 105g葡聚糖，0. 1 0. 15ml司班，均质振荡仪振荡 6. OXlOVmin 5min，超声空化5min ；45°C水浴条件下磁力搅拌器搅拌，同时通入N25min ；(4)将(3)中所得粗混悬液依次通过微膜过滤得到多室纳米微泡混悬液；(5)将Img紫杉醇标准品溶于Iml甲醇，超声振荡lmin，微型漩涡混合器振荡 5min，得到lmg/ml的紫杉醇标准品；
(6)取步骤(3)制备的纳米微泡混悬液lml，加入0. 125ml 3% 6% HSA(人血白蛋白)与步骤(5)得到的5mg/ml的紫杉醇标准品0. 125ml混合振荡lOmin，得到最终的载紫杉醇纳米微泡。上述步骤(2)中缓冲液，由8. Og Nacl ；0. 20g Kcl ；3. 6g Na2HPO4 · 12H20 ；0. 25g KH2PO4加入约800ml-900ml三蒸水在磁力搅拌器搅拌约20min，最终定容到1000ml，后通过 LanGe-Pump蠕动泵0. 22 μ m滤膜过滤，15磅20min高压灭菌制得。上述步骤(4)粗混悬液依次由0.45μπι微孔滤膜过滤2次，0.22μπι微孔滤膜过滤 2次得到多室纳米微泡混悬液。本发明所得的载紫杉醇纳米微泡进行检测1.光学显微镜观察取适量载紫杉醇纳米微泡混悬液，用PBS液体稀释5倍，血细胞计数板计数，计数四个大格，压线的只计左侧和上方的。微泡数/ml = 4大格总数/4*104计数结果为8*109个/ml载紫杉醇纳米微泡在光学显微镜下观察形态呈圆球形，规则，大小均勻一致。(见图2)2.荧光显微镜观察载紫杉醇纳米微泡的荧光图片一(见图3)3.粒径检测马尔文激光粒径测量仪测定微泡的粒径分布载紫杉醇纳米微泡粒径位于700nm 800nm之间。(见图4、5)4. HPLC检测载紫杉醇脂质体药物含量稳定性研究4. 1色谱条件色谱柱=Venusil MP C18 ；流动相甲醇水(70 30)；柱温室温； 流速为1. 4mL · miiT1 ；紫外检测波长为227nm ；进样量20 μ 1。色谱图(见图6)4. 2干扰试验。取纯甲醇溶液，按“4.1”色谱条件进样，得出色谱图；再取溶度为5μ g/ml的紫杉醇标准液按“4. 1”色谱条件进样，得出色谱图。(见图7)结果表明，溶剂甲醇和紫杉醇出现的峰时间相距很大，溶剂甲醇对紫杉醇的测定无干扰。4. 3线性关系考察取0. 5 μ g/ml ；Ι.Ομ g/ml ；2. 5 μ g/ml ；5. O μ g/ml ；7. 5 μ g/ml 紫杉醇标准品溶液分别进样，以峰面积A(mAU*s)为纵坐标，紫杉醇质量浓度C(yg/mL)为横坐标进行线性回归，得线性回归方程A = 28. 734C+4. 3239 (R2 = 0. 9982)(见图 8)4. 4不同溶度HSA载紫杉醇纳米微泡中的载药量及包封率制备不同溶度HSA的载紫杉醇纳米微泡(未加HSA ;1 % HSA-PLM ；3% HSA-PLM ； 6% HSA-PLM ；10% HSA-PLM)高速离心法取制备好的不同溶度的HSA的载紫杉纳米微泡混悬液0. 5ml，加入3. 5ml的甲醇，振荡5min, 15000rpm离心25min。取上清液20 μ 1进样。得出不同浓度HSA载紫杉醇纳米微泡游离紫杉醇的HPLC的曲线，得出峰面积。根据“4. 3”得出的线性回归方程，计算出游离药物量(W游)。包封率=(1-W游/W总)Χ100%。 得出未加HSA ;1 % HSA ；3% HSA ；6% HSA ； 10% HSA载紫杉醇纳米微泡的包封率分别为 81. 78% ；83. 75% ；93. 51% ；89. 08% ；84. 88% ·结果表明，与未加入HAS相比，加入HSA能提高载紫杉醇纳米微泡的包封率，且存在统计学意义(P < 0. 05)。在各浓度组HSA中，3% HSA, 6% HSA的包封率高于其他各组， 且存在统计学意义(P<0.05)。结果表明，加入3% 6%HSA能明显提高载紫杉醇纳米微泡的包封率。(见图9)，5.载紫杉醇纳米微泡大鼠体内毒副实验5. 1.材料和方法5. 1. 1实验材料健康雄性SD大鼠，体重180 250g〔购于重庆医科大学动物中心〕；自制载紫杉醇纳米微泡，0.9%氯化钠注射液〔购于太极西南药业股份有限公司〕5. 1. 2实验方法30只雄性SD大鼠分为对照组，治疗组。对照组给予lml/kg的 0. 9%氯化钠〔NS〕注射液尾静脉注射；治疗组给予lml/kg的载紫杉醇纳米微泡〔PLM〕悬液尾静脉注射。在注射24h，48h，72h后分批处死SD大鼠，心脏穿刺抽静脉血，3500rpm, 5min 离心，取上清液。全自动生化仪检测肝功〔TP、AS/AL、ALT、AST、ALP，肾功〔BUN、Crea〕。5. 2实验结果表1.全身毒副实验中大鼠体重变化结果〔χ士s，η = 8〕
权利要求
1.一种载紫杉醇纳米微泡，其特征在于所述微泡由类脂质双分子层构成膜，内含N2, 所述类脂质双分子层包含亲水基团与疏水基团，所述亲水基团链接紫杉醇，将紫杉醇载入类脂质双分子层构成的膜中，所述类脂质双分子层由卵磷脂、胆固醇、PEG-4000、葡聚糖、司班-80、甲醇、乙醚、3% 6% HSA、紫杉醇标准品、PBS液体的复合构成。
2.—种权利要求1所述载紫杉醇纳米微泡的制备方法，其特征在于按如下步骤进行(1)将0.1 0. 15g卵磷脂，0. 04 0. 06g胆固醇放入旋转蒸发仪的反应瓶中，加入乙醚溶解卵磷脂和胆固醇；40°C水浴，旋转蒸发仪工作，见反应瓶底部形成一层干燥薄膜结束反应，将乙醚回收入一个瓶子中，妥当保存；(2)配置0. 01M, PH = 7. 4 的 PBS 缓冲液； (3)在步骤⑴反应瓶中加入PBS液，45°C水浴，磁力搅拌器勻速搅拌，同时加入0.4 0. 6gPEG-4000,0. 07g 0. 105g葡聚糖，0. 1 0. 15ml 司班，均质振荡仪振荡 6. 0 X 103r/min 5min，超声空化5min ；45°C水浴条件下磁力搅拌器搅拌，同时通入N25min ；(4)将(3)中所得粗混悬液依次通过微膜过滤得到多室纳米微泡混悬液；(5)将Img紫杉醇标准品溶于Iml甲醇，超声振荡lmin，微型漩涡混合器振荡5min，得到lmg/ml的紫杉醇标准品；(6)取步骤(3)制备的纳米微泡混悬液1ml，加入0.125ml 3% 6% HSA与步骤(5) 得到的lmg/ml的紫杉醇标准品0. 125ml混合振荡lOmin，得到最终的载紫杉醇纳米微泡。
3.根据权利要求2所述载紫杉醇纳米微泡的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中缓冲液，由 8. Og Nacl ；0. 20g Kcl ；3. 6g Na2HPO4 · 12H20 ；0. 25g KH2PO4 加入约 800ml_900ml 三蒸水在磁力搅拌器搅拌约20min，最终定容到1000ml，后通过LanGe-Pump蠕动泵0. 22 μ m 滤膜过滤，15磅20min高压灭菌制得。
4.根据权利要求2所述载紫杉醇纳米微泡的制备方法，其特征在于所述步骤(4)粗混悬液依次由0. 45 μ m微孔滤膜过滤2次，0. 22μπι微孔滤膜过滤2次得到多室纳米微泡混悬液。
全文摘要
本发明公开了一种载紫杉醇纳米微泡及其制备方法，所述微泡由类脂质双分子层构成膜，内含N2，所述类脂质双分子层包含亲水基团与疏水基团，所述亲水基团链接紫杉醇，将紫杉醇载入类脂质双分子层构成的膜中，所述类脂质双分子层由卵磷脂、胆固醇、PEG-4000、葡聚糖、司班-80、甲醇、乙醚、3％HSA、紫杉醇标准品、PBS液体的复合构成。本发明载紫杉醇纳米微泡无毒性，无副作用；能外周静脉注射；能通过肺及全身毛细血管床(直径通常＜5um)，经静脉注射后可随血循环到达全身组织；稳定性好，在血循环中持续时间较长；不影响全身或某一系统的血流动力。
文档编号A61P35/00GK102357071SQ201110330808
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者唐静, 杨汝铃, 计晓娟 申请人:重庆医科大学附属儿童医院