专利名称：抗人Tim-3的中和性单克隆抗体L3D及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体，具体而言涉及抗人Tim-3中和性单克隆抗体L3D，还涉及该单克隆抗体在制备Tim-3检测试剂，及诊断和治疗Tim-3高表达所导致疾病中的应用。
背景技术：
Tim-3在结构上属于T细胞免疫球蛋白及粘蛋白(T cell Immunoglobulin domain and Mucin domain protein，Tim)家族成员。由于Tim家族广泛参与了机体的免疫调节过程，其功能正日益受到人们的重视。Tim-3特异性表达于活化的Thl、Thl7效应细胞表面，而不表达于Th2细胞。现已知半乳糖结合蛋白-9(Galectin-9，Gal-9)为Tim_3的天然配体，该分子广泛表达于外周免疫系统，Gal-9与Thl、Thl7细胞上的Tim_3分子特异性结合，可引发后者的调亡，下调免疫反应，诱导免疫耐受。目前，研究证实Tim-3分子主要通过调节不同CD4+T细胞亚群的功能广泛参与了自身免疫病、移植排斥、抗感染等免疫应答过禾呈[Anderson DE. TIM_3as a therapeutic target in human inflammatory diseases. Expert Opin Ther Targets. 2007 ； 11 (8) :1005-9. Anderson AC, Anderson DE. TIM-3 in autoimmunity. Curr Opin Immunol. 2006 ； 18 (6) :665-9. Degauque N，Mariat C，Kenny J， et al. Regulation of T—cell immunity by T—cell immunoglobulin and mucin domain proteins.Transplantation 2007；84 :S12_16· Zhu C，Anderson AC，Schubart A，et al.The Tim_31igand galectin-9negatively regulates T helper type 1 immunity. Nat Immunol 2005;6:1245-1252·]。
目前的研究证实Tim-3表达的异常与许多疾病有密切的关系，如研究发现HIV， HCV感染的患者以及一些肿瘤患者，其T细胞上Tim-3表达升高，由于Tim-3能介导T效应细胞的调亡，传递负性调节信号，可导致机体的免疫功能瘫痪。任何阻断Tim-3/(ial-9 结合的因素均可以使 ι 、Thl7细胞避幵死亡，增强T效应细胞的活性，恢复免疫功能 [Kassu A，Marcus RA, Df Souza MB，et al. Regulation of Virus-Specific CD4+T Cell Function by Multiple Costimulatory Receptors during Chronic HIV Infection. Immunol. 2010 ； 185 (5) :3007-18. Huang X, et al. Lymphoma endothelium preferentially expresses Tim-3 and facilitates the progression of lymphoma by mediating immune evasion. Exp Med. 2010 ；207 (3) :505. N. Castelblanco, V. Kuchroo, D. R. Gretch, and H. R. Rosen. 2009. Negative immune regulator Tim-3 is overexpressed on T cells in hepatitis C virus infection and its blockade rescues dysfunctional CD4+and CD8+T cells. Virol. 83 :9122-9130.]。
一方面，在一些自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘等疾病中，由于(ial-9 或Tim-3表达的升高，导致Thl细胞的功能受到抑制，进而打破体内的免疫平衡，引起病理性的Th2细胞的活性增强，导致疾病的发病。在这种情况下，任何阻断Tim-3/(ial-9结合的因素均能有利于体内免疫平衡的恢复，缓解疾病的进程。如给哮喘模型动物注射抗Tim-3抗体或重组Tim-3融合蛋白均能通过阻断Tim-3/(ial-9结合，增强Thl细胞活性， 纠正由Th2细胞介导的哮喘症状，恢复体内Thl/Th2细胞平衡[Hu WK, Lu XX，Yang S et al. Expression of the Thl-specific cell-surface protein Tim-3 increases in a murine model of atopic asthma. Asthma. 2009 ；46(9) :872. Pan HF, Zhang N, Li WX, Tao JH, Ye DQ. TIM-3 as a new therapeutic target in systemic lupus erythematosus. Mol Biol Rep. 2010 ；37(1) :395-8. Wang Y, Meng J, Wang X, Expression of human TIM-I and TIM-3 on lymphocytes from systemic lupus erythematosus patients. Scand Immunol. 2008 ；67(1) :63-70. Kearley J, McMillan SJ, Lloyd CM. Th2-driven, allergen—induced airway inflammation is reduced after treatment with anti-Tim-3 antibody in vivo. Exp Med 2007 ；204 :1289 ；Fukushima A, Sumi Τ, Fukuda K, Kumagai N, et al. Antibodies to T-cell Ig and mucin domain-containing proteins(Tim)-1 and-3 suppress the induction and progression of murine allergic conjunctivitis. Biochem Biophys Res Commun. 2007 ；353(1) :211.]。另一方面，在一些自身免疫病如炎性肠病以及I型糖尿病模型中，研究发现阻断Tim-3的活性增强了体内Thl效应细胞的功能，进一步加重了自身免疫损伤，该结果再次证明Tim-3在体内免疫平衡的维持中发挥重要作用[Sanchez-Fueyo A, Tian J, Picarella D, et al. Tim_3inhibits T helper type 1-mediated auto-and alloimmune responses and promotes immunological tolerance. Nat Immunol 2003 ;4 :1093-1101. Li X，et al. Clinical Immunol. 2010，134 :169—177.]。上述研究资料表明，Tim-3通路具有重要的免疫调节功能，其表达的异常与多种疾病的发生、发展有密切关系。尽管研究表明Tim-3的中和抗体也在一些疾病模型中发挥了很好的干预作用，但目前国内外尚没有上市的Tim-3抗体，因此建立和发展具有自主知识产权的以抗体为基础的检测和诊治用品，对于多种相关性疾病的干预具有重要的现实意义。
发明内容
本发明公开了一种抗人Tim-3的单克隆抗体L3D，所述单克隆抗体包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4所示。本发明还公开了抗人Tim-3中和性单克隆抗体L3D的用途，包括在制备Tim_3检测试剂，及诊断和治疗Tim-3高表达所导致的疾病中的应用。本发明所述的Tim-3高表达所导致的疾病包括HIV与HCV病毒感染、肿瘤、自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘等。本发明所述的单克隆抗体的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、 CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7所示。所述单克隆抗体的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR4、CDR5、CDR6的氨基酸序列分别如序列表中 SEQ ID NO 8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10 所示。本发明还公开了上述单克隆抗体L3D的制备方法，主要包括如下1.抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建首先，原核表达人Tim-3蛋白，免疫Balb/c小鼠，用常规方法进行细胞融合。用间接ELISA法筛选阳性细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100% 阳性。对杂交瘤细胞L3D进行了染色体核型分析，杂交瘤细胞L3D染色体平均数目为106 条，用双相琼脂扩散实验证明L3D杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgGh。图1显示单克隆抗体L3D能特异性结合人Tim-3分子。
2.抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选和鉴定
用FACS方法，就人Tim-3抗体对人U937细胞上的Tim_3分子进行结合实验。结果显示L3D能结合U937上的Tim-3分子，且表现出与小鼠Tim_3结合的交叉反应性(图2)。 同时用淋巴细胞凋亡实验验证Tim-3抗体的中和活性。结果显示L3D明显抑制Gal_9诱导的人THPl细胞的凋亡(图3)
3.单克隆抗体L3D对自身免疫损伤性疾病模型的体内干预作用
亲和柱纯化Balb/c小鼠杂交瘤细胞腹水，在紫外分光光度计进行测量，计算蛋白质含量。用C57BL/6小鼠建立脓毒血症模型，以及自身免疫性炎性肠病动物模型。给小鼠注射L3D抗体或同型对照抗体后，观察小鼠体重或生存率的变化，分析单克隆抗体L3D在体内的生物学活性。结果显示L3D抗体显著改变了脓毒血症小鼠的生存率(图4)，影响了炎性肠病小鼠的炎症程度(图5)，上述结果提示抗人Tim-3单克隆抗体L3D在体内具有良好的中和活性。
4.杂交瘤细胞L3D轻、重链基因的钓取
提取中和性单克隆抗体L3D细胞RNA，经RT-PCR，用两对特异性引物钓取抗体的轻重链基因。常规法连接入载体，转化感受态细菌，培养后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定后进行DNA测序分析。
通过上述步骤，构建了含有人Tim-3中和抗体L3D轻、重链基因的载体，经序列分析、比对，编码序列为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因，其氨基酸序列分别为SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :2。
5.单克隆抗体L3D轻、重链可变区基因序列和氨基酸序列的确定
用www. expasy. org在线软件将编码人Tim_3中和性单克隆抗体L3D的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，单克隆抗体L3D的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2所示。根据Kabat数据库确定轻链可变区序列中的互补决定区⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示。重链可变区序列中的互补决定区⑶R4、⑶R5和⑶R6的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10所示。
本发明应用一套设计的引物成功地从培养的人Tim-3中和性单克隆抗体L3D交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因。所得轻链和重链可变区基因可编码正确的小鼠抗体可变区。图6显示抗人Tim-3抗体的分子量。本发明的单克隆抗体基于上述已克隆到的人Tim-3中和性单克隆抗体L3D轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、Fab抗体、抗体融合蛋白等；基于上述基因所编码的多肽或蛋白质，可以交联上多种生物活性分子，制备用于Tim-3表达水平检测、诊断和治疗 Tim-3高表达所导致疾病的诊断或治疗药物。
图IELISA方法筛选、鉴定人Tim-3中和性单克隆抗体L3D与抗原的特异性结合活性。对照抗原为硫氧环蛋白(Trx)。图2流式细胞仪(FACS)检测单克隆抗体L3D与人U937细胞上Tim_3的结合活性， 以及与小鼠7细胞上Tim-3的交叉结合活性。A 单克隆抗体L3D与人U937细胞上 Tim-3的结合活性；B 单克隆抗体L3D与小鼠7细胞上Tim_3的交叉结合活性。图3单克隆抗体L3D的体外中和活性分析。Gal_9蛋白可通过细胞上的Tim_3诱导THPl的调亡，该图分别采用PI和Armexcin-V做凋亡细胞染色实验，观察Tim_3抗体对 Gal-9诱导调亡的中和阻断效果。图4单克隆抗体L3D对脓毒血症病程的影响。在C57BL/6小鼠建立脓毒血症模型， 同时给与L3D或同型对照抗体，然后观察动物的生存率(A)，并分别用ELISA方法分析抗体干预后炎症介质IL-6 (B)，IL-Ibeta(C)的表达变化。图5单克隆抗体L3D对小鼠炎性肠病病程的影响。在C57BL/6小鼠建立炎性肠病模型，同时给与L3D或同型对照抗体，然后观察小鼠的体重变化以及细胞因子IL-17、IFN-g 的变化。A 小鼠的体重随时间的变化情况；B 细胞因子IL-17A的变化情况；C 细胞因子 IFN-g的变化情况。图6单克隆抗体L3D的蛋白电泳图谱。各泳道分别是A 非还原电泳，B 还原电泳 (分别显示重链及轻链)，以及C 分子量Marker。
具体实施例方式通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。实施例一抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建1.材料福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂，显色试剂TMB =Sigma公司产品；20%胎牛血清 北京元亨圣马生物技术研究所产品；无血清RPMI 1640 =Gibco公司产品；SP2/0细胞ATCC 引进，军事医学科学院基础医学研究所保存；Balb/c以及C57BL/6小鼠军事医学科学院实验动物中心提供；其余试剂均为市购。2.方法和结果(1) Balb/c小鼠免疫。选用4 6周龄的雌性Balb/c小鼠6只，用IOOyg ricin 于腹股沟皮下免疫，第一针加福氏完全佐剂，第二针加福氏不完全佐剂，每3周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后尾静脉采血，用间接ELISA检测抗体产生情况，在融合前3天，以 100 μ g ricin腹腔加强免疫一次，第3天融合。(2)细胞融合。将免疫的小鼠摘眼球后脱颈处死，无菌摘取小鼠脾细胞，按常规方法进行细胞融合。具体方法为①将免疫的小鼠摘眼球放血后脱颈处死，75%酒精浸泡 3min，无菌取出脾脏，用200目钢网研磨单个细胞悬液，无血清RPMI 1640洗两次并记数；② 收集对数生长期的SP2/0细胞，用无血清RPMI1640洗两次并记数；③按SP2/0细胞脾细胞=1 5的比例混合两种细胞，用RPMI 1640洗1次，弃尽上清，轻轻将细胞打散；④在 Imin时间里缓慢加入lml50% PEG(Mw为1500)溶液，置37°C水浴Imin ；⑤在lmin、2min、 5min时间内加无血清RPMI1640lml、5ml、10ml、IOml ；⑥800r/min离心7min，弃上清，尽可能轻地将细胞悬起；⑦加含20% FCS的HAT(Sigma)-RPMI 1640培养液，调整细胞浓度为 2 XlO6Ail，混勻后滴加在铺有滋养细胞(IX IO4细胞/孔)96孔培养板(Gibco)中，100 μ 1/ 孔，置于37°C的5% CO2孵箱中培养。
C3)用间接ELISA筛选抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞。用10yg/ml重组人Tim-3 (rhTim-3)包被ELISA板，于4°C过夜并封闭。依次加入待测细胞培养上清液 (370C lh, PBST 洗板 4 次)，以及 1 500 稀释的 50 μ 1 HRP-GAM(37°C 45min, PBST 洗板 4 次)。以TMB底物显色后，于450nm波长测定OD值。
(4)杂交瘤细胞克隆化。用间接ELISA法筛选阳性的细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100%阳性。杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法①在克隆化的当天或前1天制备滋养细胞脱颈处死昆明小鼠，75%酒精浸泡消毒皮肤，无菌剥离腹部皮肤，注射器抽取5ml 1640培养液注入小鼠腹腔，反复冲洗后吸出腹腔洗液，用加 20%胎牛血清的1640培养液稀释后滴入96孔板，每孔约0. Iml0②取少许待作克隆化的杂交瘤细胞移至另一无菌试管中，并准确计数。③有限稀释法进行亚克隆。④将培养板置于 37°C的5% CO2孵箱中培养，约5天后在显微镜下可观察到细胞克隆。适时换液，检测，取阳性单克隆细胞株进行扩大培养，及时冻存细胞株。
(5)杂交瘤细胞免疫球蛋白亚型的确定。用羊抗鼠IgGl、IgGh、IgG2b和IgG3，就杂交瘤细胞浓缩后的培养上清作双相琼脂扩散实验，结果表明杂交瘤细胞培养上清只能与羊抗鼠IgGh抗体形成结合条带，证明L3D杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgGh。
通过上述步骤，筛选到人Tim-3单克隆抗体L3D。
实施例二具有人Tim-3中和性单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选和鉴定
1.材料
同实施例一。
2.方法和结果
(1)用ELISA方法筛选、鉴定人Tim-3中和性单克隆抗体L3D与抗原的特异性结合活性分别包被重组人Tim-3蛋白，以及硫氧环蛋白(Trx)对照蛋白，加入不同稀释度的抗人Tim-3抗体，以及HRP标记的抗小鼠IgG抗体，用间接ELISA的方法检测L3D的抗原结合活性及特异性。结果显示，L3D能特异性结合人Tim-3分子，且滴度较高。
(2)流氏细胞术(FACS)检测单克隆抗体L3D与人U937细胞上Tim_3的结合以及与小鼠RAW264. 7细胞上Tim-3的交叉结合活性。实验按常规FACS方法进行。结果显示， L3D能特异性结合人Tim-3分子，与小鼠Tim_3分子也有一定的交叉结合活性。
(3)为单克隆抗体L3D的中和活性分析。将重组Gal_9加到人THPl细胞培养，诱导后者的调亡，分别在上述体系中加入不同浓度的L3D抗体，培养M-48小时后，用流式细胞仪检测THPl细胞的调亡比例。结果显示feil-9能诱导人THPl细胞凋亡(Armexcin-V+ΡΓ细胞)，而在上述体系中加入L3D后Gal-9诱导的凋亡率显著下降，提示单克隆抗体L3D在体外有较好的中和活性。
通过上述步骤，获得了命名为L3D的人Tim-3半乳糖结合位点中和性单克隆抗体交瘤细胞，在体外实验中，L3D可中和GAL-9/Tim-3诱导的凋亡作用，中和性单克隆抗体L3D 还可与小鼠的Tim-3有一定的交叉反应性。
实施例三人Tim-3中和性单克隆抗体杂交瘤细胞L3D轻、重链基因的钓取
1.材料引物PHsl，见序列表中SEQ ID NO :11 ;PHs2，见序列表中 SEQ ID NO 12 ；PHal, 见序列表中SEQ ID NO 13 ；PLsl见序列表中SEQ ID NO :14，PLs2见序列表中SEQ ID NO 15 ；PLal，见序列表中SEQ ID NO 16 ；。DNA片段纯化试剂盒0MEGA生物科技公司产品； T4DNA连接酶New England Biolabs产品；载体PGEM Teasy :Promega公司产品；感受态细菌JM109 购自！Iomega公司。其余同实施例二。2.方法结果(1)取对数生长期的中和性单克隆抗体L3D细胞5X (IO6 IO7)个，离心去除上清，将细胞均勻弹起。加Iml TRIzol(Invitrogen)反复吹打使细胞充分裂解，振荡5分钟后，加入0. 2ml氯仿，振荡15秒，室温放置2 3min，2°C 8°C 12000r/min，离心15分钟， 取上清于另一新管中，加500 μ 1异丙醇混勻后室温放置10分钟，2°C 8°C 12000r/min离心lOmin。75%乙醇洗涤沉淀，干燥后，用20 μ 1无RNA酶的去离子水溶解沉淀。(2)取含 IygS RNA 的溶液，依次加入 AMV5X 缓冲液 4 μ 1，Oligo (dT) (500ng/ μ 1)0. 5 μ 1,2. 5mmol/L dNTP 2 μ 1，Rnasin (50U/μ 1) 0· 5 μ 1，补去离子水至 20 μ 1、反转录酶2 5U，42°C延伸1小时。95°C变性5min，置冰浴中，产物为cDNA第一链。用两对特异性引物PHsUPHal和PLsl、PLal，在20 μ 1 PCR反应体系中，分别加入反转录产物2 μ 1，Taq 酶 IOXbuffer 2 μ 1，上下游引物各 1 μ 1，2. 5mmol/L dNTP 1 μ 1，加 Taq 酶 1 2U，补去离子水至20 μ 1。95°C变性2分钟，循环参数为94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，共30个循环，72°C后延伸IOmin0(3)用分离出欲回收的DNA片段，在长波紫外光下切下含目的DNA片段的胶块，放入离心管中，加入三倍胶体积的化胶液，55°C水浴完全溶解胶块。用DNA片段纯化试剂盒回收DNA片段并将纯化的DNA片段在水溶液里，将回收的PCR产物在T4DNA连接酶缓冲液中按2 1的比例(摩尔比)和载体PGEMTeasy混合后，加入0. 5U的T4DNA连接酶于16°C连接过夜，连接反应的总体积为10 μ L。(4)取连接液10 μ 1，加于200 μ 1感受态细菌JM109中并轻柔混勻，冰浴30min， 42°C水浴热休克90秒，迅速转入冰浴2min，加800 μ 1 LB培养基，转入37°C恒温摇床， 以150r/min的速度摇动45min，4000r/min离心lmin，弃去800 μ 1上清，取沉淀涂布于含 Amp (终浓度为100 μ g/ml)的固体LB平板，将平板倒置于37°C孵箱12 18h。(5)在上述平板中挑取单个克隆，接种于含氨卞青霉素(100 μ g/ml)的LB培养基中。37°C恒温摇床170rpm，震荡培养过夜。取3ml菌液加入1. 5mlEppendorf管中，IOOOOr/ min离心lmin，弃上清。将沉淀菌体重悬于100 μ L溶液I中，加新鲜配制的溶液II 200 μ L， 轻缓地上下颠倒数次，至液体变清澈为止。随后，再加入150 μ L溶液III，轻柔地上下颠倒数次使液体混勻，此时出现大量白色絮状沉淀。4°C，12000r/min离心5min，取上清加至另一 Eppendorf管中，加入等体积的Tris-HCl饱和酚，剧烈震荡后，12000rpm离心5min，将上层水相移至一新管中。再加入500 μ L氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上层水相，移至一新管中，加2倍体积的无水乙醇混勻，于_20°C放置池。4°C，12000rpm离心lOmin，弃上清，用70 %乙醇洗沉淀2次，室温干燥20min，以40 μ L无菌双蒸水溶解，进行PCR鉴定及 DNA测序分析。通过上述步骤构建了含有人Tim-3中和抗体L3D轻、重链基因的载体，经测序分析、序列比对为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因，其对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2。
实施例四单克隆抗体L3D的ftOtein A纯化及对脓毒血症、炎性肠病动物模型的干预实验
1.材料
Protein A Sepharose CL 4B柱蛋白柱北京本元正阳生物技术有限公司产品；其余同实施例二。
2.方法和结果
(1)将含有人Tim-3中和抗体L3D轻、重链基因的载体转入哺乳动物细胞中，进行表达。收集表达上清，加入ImL pH8. 0,0. ImoL/L磷酸缓冲液并用pH 9. 0, ImoL/L TRIS-HCL 调整PH至9. 0。把抗体表达上清加入已经用0. ImoL/L磷酸缓冲液pH 8. 0平衡好的ftOtein A Sepharose CL 4B蛋白柱中，用上述缓冲液洗柱子，直到流出液中检测不到杂蛋白为止。 用PH 3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用ImoL/L pH 8. 5TRIS-HCL缓冲液中和，用pH 7. 2,0. OlM PBS透析72h。取样在紫外分光光度计上测0D26(1、OD28tl，计算蛋白质含量，冻干后于_20°C保存(图6抗体蛋白电泳图)。
(2)参考文献方法(Xu.R，et al. Eur. Immunol. 2010. 40 1079 ；Li X，et al. Clinical Immunol. 2010,134 :169).在C57BL/6小鼠建立脓毒血症及炎性肠病模型。具体方法1)脓毒血症模型首先配置麻醉剂，将速眠新和氯胺酮2 1.5混合均勻，再用生理盐水稀释一倍，向每只C57小鼠腹腔注射60μ 1，约1-2分钟即可麻醉。待小鼠完全麻醉后，将其固定仰卧于手术台上，用棉球蘸取75%酒精在腹部消毒。在剑突下一指处沿腹白线由上至下剪开2cm长的切口，小心剪开此处腹膜，暴露腹部，用镊子小心掀开腹膜，在腹腔切口的右下方寻到盲肠，一般其颜色稍浅且膨大，将其膨大盲端的轻轻拽出，在盲肠上距离盲端三分之二处结扎，结扎不要太紧(防止肠坏死影响实验结果)约2/3宽度。用8号针头在结扎的外侧穿刺肠壁2次，小心挤出适量内容物，将盲肠及内容物放回腹腔中，尽量保持盲肠的生理位置不变。逐层关合腹膜和皮肤，分别用带针缝合线缝合结扎。模型建立成功的重要指标是小鼠一周生存率为20-30%。；2)炎性肠病模型6-8周龄的C57雄性小鼠，分为2组，每组10只。对照组正常饮水，实验组饮DSS配制的4% DSS溶液。每天观察小鼠体重变化。
对于脓毒血症模型，将小鼠分为实验组及对照组，每组10只，在建模前12小时分别给予L3D抗体(200ug/只，腹腔注射)或同量同型对照抗体，然后观察动物的病情包括生存率、体重的变化，并在第5-7天取实验组及对照组动物的脾脏细胞，用定量PCR的方法分析细胞因子IL-lbeta、IL_6、的表达情况。结果显示L3D显著增加了脓毒血症模型动物的死亡率，降低了模型动物的体重，细胞因子、IL-lbeta、IL-6的表达显著升高，提示L3D有良好的体内中和活性。
对于炎性肠病模型，将小鼠分为实验组及对照组，每组10只，在建模同时分别给予L3D抗体(200ug/只，腹腔注射)或同量同型对照抗体，然后观察动物的体重的变化，并在第5-7天取实验组及对照组动物的脾脏细胞，用定量PCR的方法分析细胞因子IL-17， IFN-g的表达情况。结果显示L3D显著降低了模型动物的体重，细胞因子IL-17，IFN_g的表达显著升高，提示L3D有良好的体内中和活性。
权利要求
1.一种抗人Tim-3中和性单克隆抗体或其片段，包括轻链⑶R1-3和重链⑶R4-6，其特征在于，所述轻链CDR1-3的氨基酸序列为CDRl 如序列表中SEQ ID NO 5所示； CDR2 如序列表中SEQ ID NO 6所示； CDR3 如序列表中SEQ ID NO 7所示； 所述重链⑶R4-6的氨基酸序列为 CDR4 如序列表中SEQ ID NO 8所示； CDR5 如序列表中SEQ ID NO 9所示； CDR6 如序列表中SEQ ID NO 10所示。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。
3.如权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的编码序列如序列表中SEQ ID NO :3的核甘酸序列所示，所述重链可变区的编码序列如序列表中SEQ ID NO 4的核甘酸序列所示。
4.一种含有权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段的Tim-3检测试剂盒。
5.一种药物组合物，其包含权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段。
6.权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备Tim-3诊断试剂盒中的应用。
7.权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备由Tim-3高表达所导致疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了抗人Tim-3中和性单克隆抗体L3D。本发明从制备的抗人Tim-3中和性单克隆抗体L3D杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因，所得轻链和重链可变区基因可编码单克隆抗体可变区。基于上述单克隆抗体的轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，基于上述基因所编码的多肽或蛋白质，可以交联上多种生物活性分子，制备Tim-3表达水平检测试剂、诊断和治疗Tim-3异常表达所导致的疾病。
文档编号A61P19/04GK102492038SQ201110407008
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者侯春梅, 冯健男, 时凤敏, 杨小梅, 沈倍奋, 肖鹤, 蒋兴伟, 郎小玲, 陈国江, 韩根成, 黎燕 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所