专利名称：通过抑制胰腺发育基因的天然反义转录物而治疗胰腺发育基因相关疾病的制作方法
技术领域：
本申请要求于2010年I月6日提交的美国临时专利申请61/292508 ;于2010年I月12日提交的美国临时专利申请No. 61/294129 ;于2010年I月25日提交的美国临时专利申请No. 61/297847、于2010年I月25日提交的美国临时专利申请No. 61/297863 ;于2010年4月12日提交的美国临时专利申请No. 61/323027的优先权，并且所述专利申请通过引用整体并入本文。本发明的实施方案包括调节胰腺发育基因和相关分子的表达和/或功能的寡核苷酸。背景
DNA-RNA和RNA-RNA杂交对于核酸功能的许多方面是重要的，包括DNA复制、转录和翻译。杂交对于检测特定核酸或改变其表达的多种技术也是关键的。反义核苷酸，例如通过与靶RNA杂交从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制来破坏基因表达。反义DNA具有额外的特性，即DNA-RNA杂交物作被核糖核酸酶H消化的底物，这是在大多数细胞类型中存在的活性。反义分子可被递送到细胞中，如寡脱氧核苷酸(ODN)的情形，或反义分子可从内源基因表达为RNA分子。FDA最近批准了一种反义药物VITRAVENETM(用于治疗巨细胞病毒视网膜炎)，反映了反义药物具有治疗效用。概述在一个实施方案中，本发明提供通过利用靶向天然反义转录物任何区域的反义寡核苷酸而导致相应有义基因的上调来抑制天然反义转录物作用的方法。本文还预期，天然反义转录物的抑制可由siRNA、核酶和小分子实现，认为这些在本发明的范围中。—个实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与包括SEQ ID SEQ ID NO:6的核苷酸I至1235、SEQ ID NO:7的核苷酸 I 至 17，964,SEQ ID SEQ ID NO:8 的 I 至 50，003,SEQ ID NO:9 的核苷酸 I 至 486、SEQ ID NO: 10 的核苷酸 I 至 494、SEQ ID NO: 11 的核苷酸 I 至 1992 或 SEQ ID NO: 12 的核苷酸I至1767中的5至30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一性，从而体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达。在另一个实施方案中，寡核苷酸靶向胰腺发育基因多核苷酸的天然反义序列，例如，SEQ ID N0:6至12所列的核苷酸及其任何变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段及其互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO: 13至45所列。另一实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与胰腺发育基因多核苷酸的反义的反向互补序列具有至少50%序列同一性；从而体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达。
另一实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与胰腺发育基因反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%序列同一性；从而体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达。在一个实施方案中，组合物包括一种或多种结合有义和/或反义胰腺发育基因多核苷酸的反义寡核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸包括一种或多种修饰或取代的核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸包括一种或多种修饰的键。在又一实施方案中，修饰的核苷酸包括包含硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、 2’ -0-甲基、氟-或碳、亚甲基或其它锁核酸(LNA)分子的修饰的碱基。优选地，修饰的核苷酸是锁核酸分子，包括a-L-LNA。在另一个实施方案中，将寡核苷酸皮下、肌内、静脉内或腹膜内施用给患者。在另一个实施方案中，寡核苷酸以药物组合物施用。治疗方案包括向患者施用反义化合物至少一次；然而，可修改该治疗以包括经一段时间的多个剂量。该治疗可与一种或多种其它类型的治疗联合。在另一个实施方案中，将寡核苷酸封装在脂质体中或连接于载体分子(例如，胆固醇、TAT肽)。其它方面在以下描述。附图
简述图I是实时PCR结果的图，显示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理H印G2细胞后与对照相比NEURODlmRNA的倍数变化+标准差。实时PCR结果显示，用针对NEUR0D1反义Steedo. aApr07设计的寡核苷酸之一处理后48h，HepG2细胞中NEURODlmRNA 的水平显著增加。标为 CUR-1373、CUR-1374、CUR_1375 和 CUR-1376 的条柱分别对应用SEQ ID NO: 13至16处理的样品。图2是实时PCR结果的图，显示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理518A2细胞后与对照相比HNF4A mRNA的倍数变化+标准差。标为⑶R-1194、CUR-1195, CUR-1193、CUR-1192、CUR-119U CUR-1190, CUR-1188, CUR-1189, CUR-1187,CUR-1186、CUR-1182、CUR-1183、CUR-1185、CUR-1184、CUR-1181 的条柱分别对应用 SEQ IDN0S: 17至31处理的样品。图3是实时PCR结果的图，显示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理IfepG2细胞后与对照相比MAFA mRNA的倍数变化+标准差。实时PCR结果显示，用针对MAFA反义BMl27748设计的寡核苷酸之一处理后48h，HepG2细胞中MAFA mRNA的水平显著增加。标为CUR-1207、CUR-1209、CUR-1208、CUR-1210和CUR-1211的条柱分别对应用SEQ ID N0S: 32至36处理的样品。图4是实时PCR结果的图，显示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理H印G2细胞后与对照相比I3DXlmRNA的倍数变化+标准差。实时PCR结果显示，用针对I3DXl反义Hs. 416201设计的寡核苷酸中的两种处理后48h，HepG2细胞中TOXlmRNA的水平显著增加。标为CUR-1388、CUR-1389、CUR-1390、CUR-1391和CUR-1392的条柱分别对应用SEQ ID NOS :37至41处理的样品。图5是实时PCR结果的图，显示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理MCF-7细胞后与对照相比NKX6-lmRNA的倍数变化+标准差。标为⑶R-1501至CUR-1504的条柱分别对应用SEQ ID N0S:42至45处理的样品。序列表描述SEQ ID NO: I :智人神经源分化 I (NEUR0D1) ,mRNA(NCBI 登记号NM_002500)。SEQID NO:2 :智人肝细胞核因子4、a (HNF4A)、转录变体2、mRNA(NCBI登记号NM_000457)。SEQ ID N0:3 :智人v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A (鸟类)(MAFA)、mRNA(NCBI登记号NM_201589)。SEQ ID N0:4 :智人胰腺和十二直肠同源异型盒I (I3DXl)、mRNA(NCBI登记号NM_000209)。SEQ ID NO: 5 :智人 NK6 同源异型盒 I (NKX6-1)，mRNA. (NCBI 登记号NM_006168)。SEQ ID N0:6 至 12:SEQ ID NO:6:天然 NEUR0D1 反义序列(Steedo. aApr07)； SEQ ID NO:7:天然 HNF4A 反义序列(AF143870) ；SEQ ID NO:8:天然 HNF4A 反义序列(BC071794) ；SEQ ID NO:9:天然 HNF4A 反义序列(BX099913) ；SEQ ID NO: 10:天然 MAFA 反义序列(BM127748) ；SEQ ID NO: 11:天然 PDXl 反义序列(Hs. 416201)和 SEQ ID NO: 12:天然NKX6-1反义序列(torsnaby. aApr07_未剪接型)SEQ ID NO: 13至45 :反义寡核苷酸。*指示硫代磷酸酯键。详述下面参考用于示例的实例应用来描述本发明的多个方面。应理解的是，列出许多具体细节、关联和方法以提供对本发明的完全理解。然而，相关领域普通技术人员将容易认识到，可没有一种或多种具体细节地实践本发明或以其它方法实践本发明。本发明不限于行为或事件的顺序，因为一些行为可以不同顺序进行和/或与其它行为或事件同时进行。而且，并非所有列举的行为或事件都是实施根据本发明的方法所需的。本文公开的所有基因、基因名称和基因产物预期对应来自本文公开的组合物和方法可适用的任何物种的同系物。因此，这些术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。应理解的是，当公开来自具体物种的基因或基因产物时，这一公开仅旨在示例，不应解释为限制，除非在其存在的上下文清楚地指明。因此，例如，对于本文公开的基因，其在一些实施方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列，预期涵盖来自其它动物的同源和/或直系同源基因和基因产物，所述其它动物包括但不限于其它哺乳动物、鱼、两栖类、爬行动物和鸟类。在实施方案中，基因或核酸序列是人的。定义本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明。除非上下文另外清楚地指明，否则本文所用的单数形式"一个/ 一种(a)"、" 一个/ 一种(an)"和"该(the)"预期包括复数形式。而且，就详述和/或权利要求书中使用术语"包括(including)"、"包括(includes)"、"具有(having)"、"具有(has)"、"带有(with)"或其变化形式来说,这些术语预期以类似于术语"包含(comprising)"的方式被包括。术语"约"或"大约"是指在由本领域普通技术人员确定的特定数值的可接受误差范围内，其将部分地取决于如何测量或确定该数值，即，测量系统的限度。例如，按照本领域中的实践，"约"可表示在I个或多于I个标准差内。可选地，"约"可表示给定数值的达20%、优选地达10%、更优选地达5%、仍更优选地达1%的范围。可选地，尤其是有关生物系统或方法，术语可表示在数值的数量级内，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。当在本申请和权利要求书中描述特定数值时，除非另外指明，否则应假设术语"约"表示在特定数值可接受的误差范围内。本文所用的术语"mRNA"是指靶基因的目前已知的mRNA转录物和可能说明的任何进一步的转录物。"反义寡核苷酸"或"反义化合物"是指结合另一RNA或DNA (靶RNA、DNA)的RNA或DNA分子。例如，如果其是RNA寡核苷酸，其借助于RNA-RNA相互作用结合另一 RNA靶并且改变靶RNA的活性。反义寡核苷酸可上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。该定义意为包括从治疗、诊断或其它观点来说有用的任何外来RNA或DNA分子。这种分子包括，例如，反义RNA或DNA分子、干扰RNA(RNAi)、微RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治 疗性编辑RNA和激动剂与拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可选剪接体、引物、探针以及与靶核酸的至少一部分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些化合物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。在本发明的范畴中，术语"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物。术语"寡核苷酸"还包括天然和/或修饰的单体或键合的线性或环状寡聚物，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代形式和其a -异头形式、肽核酸(PM)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、膦酸甲酯和类似物。寡核苷酸能够经由规则方式的单体与单体间的相互作用，例如Watson-Crick型碱基配对、Ho6gsteen或逆Ho6gsteen型碱基配对或类似物特异性结合靶多核苷酸。寡核苷酸可以是"嵌合的"，即，包括不同区域。在本发明的范畴中，"嵌合"化合物是寡核苷酸，其包含两个或更多个化学区域，例如，DNA区域、RNA区域、PNA区域等等。每个化学区域由至少一个单体单位构成，在寡核苷酸化合物的情形中所述单体单位即为核苷酸。这些寡核苷酸通常包括至少一个区域，其中寡核苷酸经修饰以表现一种或多种期望特性。寡核苷酸的期望特性包括但不限于，例如，对核酸酶降解增加的耐受性、增加的细胞摄取和/或对靶核酸增加的结合亲和力。因此，寡核苷酸的不同区域可具有不同特性。如上所述，本发明的嵌合寡核苷酸可形成为两种或更多种寡核苷酸的混合结构、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸类似物。寡核苷酸可由可被"成行"地连接(即当单体被连续地连接时，如在天然DNA中)的区域或经由间隔物连接的区域构成。预期间隔物构成区域之间的共价"桥"，在情形中具有不超过约100个碳原子的长度。间隔物可携带不同功能性，例如，具有正电荷或负电荷，携带特殊的核酸结合特性(嵌入剂、槽沟结合物、毒素、荧光团等等)，为亲脂性的，诱导特殊的二级结构，如例如，诱导a -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的"胰腺发育基因"包括所有家族成员、突变体、等位基因、片段、种类(species)、编码和非编码序列、有义和反义多核苷酸链等等。本文所用的词语‘神经源分化I’、‘胰腺发育基因I’、NEUR0D1、BETA2、BHF-UbHLHa3、NeuroD, NEUROD, NeuroDl被认为在文献中是相同的，且在本申请中可交换地使用。本文所用的词语肝细胞核因子4，a ;肝细胞核因子4. a. ；HNF4. a. ;HNF4A、HNF-4 a、MODY、M0DY1、NR2A1、NR2A21、TCF、TCF14、转录因子-14、APF、LFBl 和 HPl 被认为在文献中是相同的，且在本申请中可交换地使用。本文所用的词语‘v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A’、MAFA> hMafA、v-maf >mafA、胰腺￠-细胞特异性转录激活因子、RIPE3bl、转录因子MafA、转录因子RIPE3bl、V-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A(鸟类)被认为在文献中是相同的，且在本申请中可交换地使用。本文所用的词语‘胰腺和十二直肠同源异型盒I’、PDX1、rox-i、葡萄糖-敏感因子、GSF、IDX-1、胰岛素启动因子I、胰岛素上游因子1、1 1、1 _1、胰岛/十二直肠同源异型盒-I、IUF1、IUF-1、M0DY4、胰腺/十二直肠同源异型盒蛋白I、生长抑素-反式激活因子I、STF-I被认为在文献中是相同的，且在本申请中可交换地使用。本文所用的词语NK6同源异型盒I、NKX6-1、同源异型盒蛋白NK-6同源物A、同源异型盒蛋白Nkx-6. l、Nkx6. 1、NKX6. I和NKX6A被认为在文 献中是相同的，且在本申请中可交换地使用。本文所用的术语"对…有特异性的寡核苷酸"或"靶向…的寡核苷酸"是指具有(i)能够与靶基因的一部分形成稳定复合体，或(ii)能够与靶基因的mRNA转录物的一部分形成稳定双链体的序列的寡核苷酸。复合体和双链体的稳定性可通过理论计算和/或体外测定来确定。用于确定杂交复合体和双链体的稳定性的示例性测定在以下实施例中描述。本文所用的术语"靶核酸"涵盖DNA、从这种DNA转录的RNA (包括前体mRNA和mRNA)、还有从这种RNA衍生的cDNA、编码序列、非编码序列、有义或反义多核苷酸。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰核酸的正常功能。特异性地与靶核酸杂交的化合物对靶核酸功能的这一调节通常称为"反义"。待干扰的DNA功能包括，例如复制和转录。待干扰的RNA功能包括所有重要功能，例如，RNA向蛋白翻译位置的移位，从RNA翻译为蛋白，剪接RNA以产生一种或多种mRNA种类以及可能由RNA参与或促进的催化活性。这种干扰靶核酸功能的总效果是调节编码的产物或寡核苷酸的表达。RNA干扰"RNAi"由对其"靶"核酸序列具有序列特异性的同源性的双链RNA(dsRNA)分子介导。在本发明的某些实施方案中，介导物是5-25个核苷酸的"小干扰"RNA双链体(siRNA)。siRNA来源于称为Dicer的RNA酶对dsRNA的加工。siRNA双链体产物被募集到称为RISC(RNA诱导沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中。不希望受任何特定理论束缚，认为随后RISC被引导至靶核酸(适当地为mRNA)，在那里siRNA双链体以序列特异性方式相互作用来以催化方式介导裂解。根据本发明可使用的小干扰RNA可根据本领域公知并且本领域普通技术人员熟悉的方案合成和使用。用于本发明方法的小干扰RNA适当地包括约I至约50个核苷酸(nt)。在非限制性实施方案的实例中，siRNA可包括约5至约40nt、约5至约30nt、约10至约30nt、约15至约25nt或约20-25个核苷酸。通过利用自动比对核酸序列并指明同一性或同源性的区域的计算机程序来便于选择适当的寡核苷酸。这种程序用来比较获得的核酸序列，例如通过搜寻数据库例如GenBank或通过对PCR产物测序。比较来自一系列物种的核酸序列允许选择在物种之间展示适当的同一性程度的核酸序列。在未被测序的基因的情形中，进行DNA印迹以允许确定靶物种与其它物种的基因之间的同一性程度。如本领域所熟知的，通过以不同的严格性程度进行DNA印迹，可能获得近似的同一性测量。这些方案允许选择展现与待控制的受治疗者中的靶核酸序列的高程度互补性和与其它物种中的相应核酸序列的较低程度互补性的寡核苷酸。本领域技术人员将认识到，在选择用于本发明的基因的适当区域方面存在相当大的自由。"酶促RNA"是指具有酶促活性的RNA分子。酶促核酸(核酶)通过首先结合靶RNA来作用。这种结合经由被保持在邻近用于裂解靶RNA的分子的酶促部分处的酶促核酸的靶结合部分来进行。因此，酶促核酸首先识别靶RNA然后经由碱基配对结合靶RNA，结合到正确位置时，酶促地作用以切割靶RNA。"诱饵RNA"是指模拟配体的天然结合结构域的RNA分子。因此，诱饵RNA与天然结合靶竞争结合特定配体。例如，已经显示HIV反式激活响应(TAR) RNA的过表达可作为"诱饵"起作用并有效地结合HIV tat蛋白，从而阻止其结合HIV RNA中编码的TAR序列。这表示一个特定的实例。本领域技术人员将认识到，这仅是一个实例，利用本领域通常已知的 技术可容易地产生其它实施方案。本文所用的术语"单体"通常是指由磷酸二酯键或其类似物连接以形成大小从数个单体单位例如约3-4个至约数百个单体单位范围的寡核苷酸的单体。磷酸二酯键合的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯和类似物，如以下更充分地描述。术语“核苷酸”涵盖天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本领域技术人员应清楚的是，此前被认为是"非天然存在的"各种核苷酸后来已在自然界中发现。因此，"核苷酸"不仅包括已知的含嘌呤和嘧啶杂环的分子，还包括其杂环类似物和互变异构体。其它类型的核苷酸的示例性实例是含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶、邮，邮-桥亚乙基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)_炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷的分子以及美国专利No. 5，432，272中描述的"非天然存在的"核苷酸。术语"核苷酸"预期涵盖这些实例的每一种和所有以及其类似物和互变异构体。尤其关注的核苷酸是包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的那些，它们被认为是与在人的治疗和诊断应用有关的天然存在的核苷酸。核苷酸包括天然2'-脱氧糖和2'-羟基糖，例如在 Kornberg 和 Baker, DNA Replication,第 2版.(Freeman, San Francisco, 1992)中描述的，以及它们的类似物。提及核苷酸的"类似物"包括具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成的核苷酸。这种类似物包括经设计以增强结合特性，例如，双链体或三链体稳定性、特异性或类似特性的合成的核苷酸。本文所用的"杂交"是指寡聚化合物的大致互补链的配对。配对的一种机制包括寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷酸)之间的氢键合，其可以是Watson-Crick、HoGgsteen或逆Ho6gsteeri氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是经由氢键形成而配对的互补核苷酸。杂交可在不同情况下发生。当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能以导致功能和/或活性的调节时，该化合物是"可特异性杂交的"，且在期望特异性结合的条件下(即，在体内测定或治疗性治疗的情形中的生理条件下和在体外测定的情形中进行测定的条件下)存在足够程度的互补性以避免反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。本文所用的短语"严格杂交条件"或"严格条件"是指本发明化合物将与其靶序列杂交，但与最小数目的其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的且在不同情况中将是不同的，并且在本发明范畴中，寡聚化合物与靶序列杂交的"严格条件"由寡聚化合物的性质和组成以及研究它们的测定决定。通常，严格杂交条件包括低浓度(〈O. 15M)的带有无机阳离子例如Na++或K++的盐(即，低离子强度)、高于20°C _25°C低于寡聚化合物靶序列复合体的Tm的温度、和存在变性剂例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜或去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)。例如，对于每种1%甲酰胺，杂交率降低I. 1%。高严格杂交条件的实例是在60°C下0. IX氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC)/0. l%(w/v) SDS进行30分钟。本文所用的"互补"是指一条或两条寡聚链上的两个核苷酸之间准确配对的能力。例如，如果在反义化合物某一位置的核碱基能够与在靶核酸某一位置的核碱基氢键结 合，所述靶核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子，则认为寡核苷酸与靶核酸之间的氢键结合位置是互补位置。当每个分子的足够数目的互补位置由可彼此成氢键的核苷酸占据时，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子是彼此互补的。因此，"可特异性杂交"和"互补"是用来表示经足够数目的核苷酸足够程度的准确配对或互补性，从而在寡聚化合物和靶核酸之间发生稳定和特异性结合的术语。本领域应理解的是，寡聚化合物的序列不必与待可特异性杂交的其靶核酸的序列100%互补。而且，寡核苷酸可经一个或多个区段杂交，从而其间的或相邻区段不牵涉在杂交事件中(例如，环结构、错配或发夹结构)。本发明的寡聚化合物包括与其所靶向的靶核酸序列中靶区域具有至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约99%序列互补性。例如，其中反义化合物的20个核苷酸中的18个与靶区域互补从而将特异性杂交的反义化合物将表示90%互补性。在这一实例中，其余非互补核苷酸可成串或散布于互补核苷酸，不必彼此连续或与互补核苷酸连续。因此，具有侧翼为与靶核酸具有完全互补性的两个区域的4(四)个非互补核苷酸的长度为18个核苷酸的反义化合物将与靶核酸具有77. 8%总互补性，因此属于本发明的范围中。反义化合物与靶核酸的区域的互补性百分比可常规地利用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序来确定。同源性、序列同一性或互补性的百分比可通过例如使用Smith 和 Waterman 的算法(Adv. Appl. Math. , (1981) 2, 482-489)的 Gap 程序(Wisconsin序列分析软件包，用于 Unix 的版本 8，Genetics Computer Group, UniversityResearchPark, Madison ffis.)确定，并使用默认设置。本文所用的术语"热熔点(Tm)"是指在指定的离子强度、pH和核酸浓度下，与靶序列互补的寡核苷酸的50%平衡地与靶序列杂交的温度。通常，严格条件将是其中盐浓度为至少约0. 01至I. OM Na离子浓度(或其它盐)、pH 7. 0至8. 3，且对于短寡核苷酸(例如，10至50个核苷酸)温度为至少约30°C的条件。严格条件还可通过加入去稳定剂例如甲酰胺来实现。本文所用的"调节"是指基因表达的增加(刺激)或减少(抑制)。术语"变体"当在多核苷酸序列的上下文中使用时，可涵盖与野生型基因相关的多核苷酸序列。这一定义还可包括，例如，"等位"、"剪接"、"物种"或"多态"变体。剪接变体可与参考分子具有显著的同一性，但由于在mRNA加工期间外显子的可选剪接通常将具有更大数目或更小数目的多核苷酸。相应的多肽可具有另外的功能结构域或缺少结构域。物种变体是在物种之间不同的多核苷酸序列。本发明中特别有用的是野生型基因产物的变体。变体可来源于核酸序列中至少一种突变，并可产生改变的mRNA或产生结构或功能可能改变或可能不改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可具有O种、一种或多种等位基因形式。产生变体的常见突变改变通常归因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。在给定序列中，这些类型改变的每一种可单独发生，或组合其它类型改变发生一次或多次。所得的多肽通常将具有相对于彼此显著的氨基酸同一性。多态变体是给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态变体还可涵盖"单核苷酸多态性"(SNP)或其中多核苷酸序列差异为一个碱基的单碱基突变。SNP的存在可指示，例如，具有疾病状态的倾向的某一群体，所述倾向相比于耐受性为易感性。衍生的多核苷酸包括经受化学修饰(例如以烷基、酰基或氨基代替氢)的核酸。衍生物例如，衍生物寡核苷酸，可包括非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间键合。其中示例的有硫代磷酸酯和本领域已知的其它含硫物质。衍生的核酸还可包含标记，包括放 射性核苷酸、酶、荧光剂、化学发光剂、显色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子和类似物。"衍生物"多肽或肽是例如通过糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、还原/烷基化、酰化、化学偶合或适度福尔马林处理修饰的多肽或肽。还可修饰衍生物以直接或间接包含可检测的标记，包括但不限于，放射性同位素、荧光和酶标记。本文所用的术语"动物"或"患者"意为包括，例如人、绵羊、麋鹿、鹿、长耳鹿、貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、犬、猫、大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蛛形纲动物。"哺乳动物"涵盖通常处于医疗护理下的温血哺乳动物(例如，人和驯养的动物)。实例包括猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物和人，以及仅仅人。"治疗(Treating)"或"治疗(treatment)"涵盖治疗哺乳动物的疾病状态,并包括(a)防止疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当所述哺乳动物倾向于疾病状态但还未被诊断为患有其的时候；(b)抑制疾病状态，例如阻止其发展；和/或(C)缓解疾病状态，例如导致疾病状态消退，直到达到期望端点。治疗还包括疾病症状的改善(例如，减轻疼痛或不适)，其中所述改善可或不可直接影响疾病(例如起因、传染、表达等等)。本文所用的"癌症"是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌症本身表现为"肿瘤"或包括癌症恶性细胞的组织。肿瘤的实例包括肉瘤和癌，例如但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。可用根据本发明公开的组合物治疗的其它癌症包括但不限于，例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰岛肿瘤、恶性类癌瘤、膀胱癌、恶变前皮肤损伤、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。"神经病学疾病或病症"是指神经系统和/或视觉系统的任何疾病或病症。"神经病学疾病或病症"包括牵涉中枢神经系统(脑、脑干和小脑)、外周神经系统(包括颅神经)和自主神经系统(其部分位于中枢神经系统和外周神经系统两者中)的疾病或病症。神经病学病症的实例包括但不限于，头痛、麻痹和昏迷、痴呆、癫痫、睡眠障碍、外伤、感染、赘生物、神经眼科学、运动障碍、脱髓鞘疾病、脊髓病症以及外周神经、肌肉和神经肌肉接头的病症。成瘾和精神疾病，包括但不限于双相性精神障碍和精神分裂症，也包括在神经病学病症的定义中。以下是可利用根据本发明的组合物和方法治疗的多种神经病学病症、症状、迹象和综合征的列表获得性癫痫样失语症；急性播散性脑脊髓炎；脑白质肾上腺萎缩症；年龄相关的黄斑变性；胼胝体发育不全；失认症；艾卡迪综合征；亚力山大病；阿尔佩斯病；交替性偏瘫；血管性痴呆；肌萎缩性侧索硬化；无脑；Angelman综合征；血管瘤病；缺氧症；失语症；失用症；蛛网膜囊肿；蛛网膜炎；阿-基氏脑畸形；动静脉畸形 ；阿斯佩各综合征；共济失调毛细血管扩张；注意力缺乏过动症；孤独症；自主神经失调；背痛；巴藤病；白塞病；贝耳麻痹；良性自发性睑痉挛；良性局灶性肌萎缩；良性颅内高压；宾斯旺格氏病；睑疫挛；Bloch Sulzberger综合征；臂丛损伤；脑脓肿；脑损伤；脑肿瘤(包括多形性胶质母细胞瘤)；脊髓肿瘤；布朗-塞卡尔综合征；卡纳万病；腕管综合症；灼痛；中枢性疼痛综合症；脑桥中部髓鞘溶解；头部障碍；脑动脉瘤；脑动脉硬化；脑萎缩；大脑性巨人症；大脑性麻痹；夏_马-图三氏病；化疗引起的神经病和神经性疼痛；基氏脑畸形；舞蹈症；慢性炎症性脱髓鞘多神经病；慢性痛；慢性局部疼痛综合征；科-勒二氏综合征；昏迷，包括持续性植物人状态；先天性面瘫；皮质基底节变性；颅动脉炎；颅缝早闭；克雅氏病；积累性损伤错乱；柯兴综合征；巨细胞包涵体病；巨细胞病毒感染；眼舞蹈-足舞蹈综合征；丹-沃二氏综合征；DaWSon病；德摩西埃氏综合征；下臂丛麻痹；痴呆；皮肌炎；糖尿病性神经病；弥漫性硬化症；家族性自主神经异常；书写困难；阅读困难；张力障碍；早期幼儿癫痫性脑病；空蝶鞍综合征；脑炎；脑膨出；脑三叉神经血管瘤病；癫痫；欧勃氏麻痹；特发性震颤；法布里氏病；法尔氏综合征；昏厥；家族性痉挛麻痹症；热性癫痫发作；菲希尔综合征；弗里德赖希氏共济失调；额颞痴呆和其它"tau病变"；高歇病；格斯特曼氏综合征；巨细胞性动脉炎；巨细胞性包涵体病；球样细胞脑白质营养不良；格_巴二氏综合征；HTLV-1相关的骨髓病；哈-斯二氏病；头部损伤；头痛；半面痉挛；遗传性痉挛性截瘫；多神经炎型遗传性共济失调；耳部带状疱疹；带状疱疹；Hirayama综合征；HIV相关的痴呆和神经病(也是AIDS的神经病学表现)；前脑无裂畸形；亨延顿氏舞蹈病和其它多谷氨酰胺重复序列病；积水性无脑畸形；脑积水；皮质醇过多症；低氧；免疫介导的脑脊髓炎；包涵体肌炎；色素失调症；婴儿植烷酸贮积病；婴儿雷夫叙姆病；婴儿痉挛；炎性肌病；颅内囊肿；颅内高压Joubert综合征；卡恩斯-塞尔综合征；Kennedy病；金斯布林纳综合征；克-费二氏综合征；克拉贝病；库_韦二氏病；库鲁病；拉福拉病；Lambert-Eaton肌无力综合征；Landau-Kleffner综合征；侧髓(瓦伦伯格氏)综合征；学习障碍；利氏病；Lenn0X-GUStaUt综合征；莱-萘_■氏综合征；脑白质病变；路易体痴呆；无脑回症；闭锁综合征；Lou Gehrig病(即，运动神经元病或肌萎缩性侧索硬化)；椎间盘退变；莱姆病-神经病学后遗症；Machado-Jos印h病；巨头；巨脑；梅-罗二氏综合征；美尼尔症；脑膜炎；门克斯病；异染性脑白质营养不良；头小畸形；偏头痛；Miller Fisher综合征；小中风；线粒体肌病；默比厄斯氏综合征；单肢肌萎缩；运动神经元病；Moyamoya病；粘多糖忙积症；多发梗塞性痴呆；多灶性运动神经病；多发性硬化和其它脱髓鞘病症；伴有体位性低血压的多系统萎缩症；肌肉萎缩症；重症肌无力；脑脱髓鞘弥散性硬化；婴儿肌阵挛性脑病；肌阵挛；肌病；先天性肌强直；嗜睡病；神经纤维瘤病；抗精神病药的恶性综合征；AIDS的神经病学表现；狼疮的神经病学后遗症；神经性肌强直；神经元蜡样脂褐质沉积症；神经元移行异常；尼-皮二氏病；0/ SulIivan-McLeod综合征；枕神经痛；隐性脊柱神经管闭合不全序列征；大田原综合征；橄榄体脑桥小脑萎缩；眼阵挛-肌阵挛；视神经炎；直立性低血压；过度使用综合征；感觉异常；神经变性疾病或病症(帕金森病、亨延顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、痴呆、多发性硬化和与神经元细胞死亡相关的其它疾病和病症)；先天性肌强直病；副肿瘤性疾病；突发性癫痫；帕-罗二氏综合征；佩-梅氏病；周期性麻痹；外周神经病；痛性神经病和神经性疼痛；持续性植物人状态；全身性发育迟缓；光喷嚏反射；植烷酸贮积病；皮克氏病；神经挟捏；垂体肿瘤；多肌炎；孔洞脑；小儿麻痹症后期综合症；带状疱疹后神经痛；感染后脑脊髓炎；体位性低血压；帕-魏二氏综合征；原发性脊髓侧索硬化；朊病毒病；进行性面偏侧萎缩症；进行性多灶性白质脑病；进行性硬化性灰质萎缩；进行性 核上性麻痹；假性脑瘤；Ramsay-Hunt综合征(I型和II型)；Rasmussen脑炎；反射性交感神经营养不良综合征；雷夫叙姆病；重复性运动损伤；重复性压力损伤；多动腿综合征；逆转录病毒相关的脊髓病；Rett综合征；雷依氏综合征；圣维特斯舞蹈病；桑德霍夫病；谢耳德氏病；脑裂；视隔发育不全；摇晃婴儿综合症；带状疱疹 ’希-德二氏综合征；斯耶格伦氏综合征；睡眠窒息；Soto综合征；僵直；脊柱裂；脊髓损伤；脊髓肿瘤；脊髓性肌萎缩；僵人综合征；中风；斯特奇-韦伯综合征；亚急性硬化全脑炎；动脉硬化性皮层下脑病；西德纳姆舞蹈；晕厥；脊髓空洞症；迟发性运动障碍；泰-萨二氏病；颞动脉炎；脊髓拴系综合征；肌强直性白内障；胸部出口综合征；三叉神经痛；托德氏麻痹；图雷特综合症；暂时性缺血性发作；传染性海绵状脑病；横贯性脊髓炎；外伤性脑损伤；震颤；三叉神经痛；热带痉挛性轻截瘫；结节性脑硬化；血管性痴呆(多发梗塞性痴呆)；血管炎(包括颞动脉炎)；希-林二氏病；瓦伦伯格氏综合征；韦-霍二氏病；韦斯特综合征；鞭抽式损伤(whiplash)；威廉斯综合征；Wildon病和泽韦格综合征。"炎症"是指系统性炎症疾患和局部地伴有单核细胞、粒细胞和/或中性白细胞的迁移和吸引的疾患。炎症的实例包括但不限于，病原生物体(包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、病毒、真菌和寄生虫例如原生动物和蠕虫)感染引起的炎症、移植排斥(包括排斥实体器官例如肾脏、肝脏、心脏、肺或角膜、以及排斥骨髓移植物包括移植物抗宿主病(GVHD))、或局部的慢性或急性自身免疫或变应性反应引起的移植排斥。自身免疫疾病包括急性肾小球性肾炎；类风湿性关节炎或反应性关节炎；慢性肾小球性肾炎；炎性肠病例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和坏死性小肠结肠炎；粒细胞输血相关的综合征；炎症性皮肤病例如接触性皮炎、特应性皮炎、银屑病；全身性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺炎、多发性硬化、和一些形式的糖尿病、或其中受治疗者自身免疫系统的攻击导致病理学组织破坏的任何其它自身免疫状态。变应性反应包括变应性哮喘、慢性支气管炎、急性和延迟的过敏症。系统性炎症疾病状态包括外伤、烧伤、缺血事件后再灌注(如，心脏、脑、肠或外周脉管系统中的血栓形成事件，包括心肌梗塞和中风)相关的炎症、败血症、ARDS或多器官功能障碍综合征。炎性细胞募集也发生在动脉粥样硬化斑块中。炎症包括但不限于，非霍奇金淋巴瘤、韦格纳氏肉芽肿、桥本氏甲状腺炎、肝细胞癌、胸腺萎缩、慢性胰腺炎、类风湿性关节炎、反应性淋巴样增生、骨关节炎、溃疡性结肠炎、乳头状癌、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、急性胆囊炎、慢性胆囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、内在性子宫内膜异位症、子宫内膜异位症、急性宫颈炎、慢性宫颈炎、淋巴样增生、多发性硬化、特发性血小板减少性紫癜继发性的肥大、原发性IgA肾病、全身性红斑狼疮、银屑病、肺气肿、慢性肾盂肾炎和慢性膀胱炎。心血管疾病或病症包括可导致缺血或由心脏再灌注引起的那些病症。实例包括但不限于，动脉粥样硬化、冠状动脉病、巨细胞性心肌炎、慢性心肌炎(非肉芽肿性)、原发性肥大型心肌病、外周动脉病(PAD)、中风、心绞痛、心肌梗塞、心搏停止造成的心血管组织损伤、心脏旁路造成的心血管组织损伤、心源性休克、和本领域技术人员已知的相关疾患或包括心脏或脉管系统的功能障碍或组织损伤的相关疾患，尤其是但不限于，胰腺发育基因激活相关的组织损伤。CVS疾病包括但不限于，动脉粥样硬化、肉芽肿性心肌炎、心肌梗塞、瓣 膜性心脏病继发性心肌纤维化、无梗塞的心肌纤维化、原发性肥大性心肌病和慢性心肌炎(非肉芽肿性)。"代谢疾病或病症"是指内分泌系统的各种疾病和病症，包括例如胰岛素抗性、糖尿病、肥胖症、葡萄糖耐量受损、高血胆固醇、高血糖症、高胰岛素血症、血脂障碍和高脂血症。多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子靶在一个实施方案中，靶包括胰腺发育基因的核酸序列，包括但不限于胰腺发育基因相关的有义和/或反义的非编码和/或编码序列。在一个实施方案中，靶包括NEUR0D1的核酸序列，包括但不限于NEUR0D1基因相关的有义和/或反义的非编码和/或编码序列。在一个实施方案中，靶包括HNF4A的核酸序列，包括但不限于HNF4A基因相关的有义和/或反义的非编码和/或编码序列。在一个实施方案中,祀包括MAFA的核酸序列,包括但不限于MAFA基因相关的有义和/或反义的非编码和/或编码序列。在一个实施方案中，靶包括roxi的核酸序列，包括但不限于roxi基因相关的有义和/或反义的非编码和/或编码序列。在一个实施方案中，靶包括NKX6的核酸序列，包括但不限于NKX6基因相关的有义和/或反义的非编码和/或编码序列。BETA2/NeuroDl是组织特异性碱性螺旋-环-螺旋转录因子，具有上调胰岛素基因表达的能力。NeuroDl/BETA2是在胰岛P细胞中胰岛形态发生和胰岛素激素基因转录的关键调节子。其被克隆为神经元分化所需的基因，称为NeuroD ;我们目前将该基因称为BETA2/NeuroDl。像很多在调节各种发育系统方面起重要作用的bHLH家族成员一样，BETA2/NeuroDI对胰腺和脑的发育是至关重要的。HNF4A编码在肝细胞和胰腺转录调节中具有重要作用的转录因子。孤儿核受体和肝激活因子、肝核因子-4 (HNF-4)是在肝和胰腺￠-细胞中转录网络的重要调节子。两个启动子Pl和P2位于染色体20q上间隔45. 5kb。尽管HNF4A在肝中的转录物主要是Pl来源，但是P2启动子引发胰腺中的表达，其在胰腺中调节参与胰岛素分泌和葡萄糖体内稳态的基因。MAFA是在胰岛素基因增强剂区域中与称为RIPE3bl的保守性顺式-调控元件结合并且作为胰岛素基因的重要反式作用子起作用的￠-细胞特异性核因子。MAFA是碱性-亮氨酸拉链(bLZ)转录因子，其通过称为RIPE3bl的顺式-调控元件控制胰岛素基因的￠-细胞特异性表达并且作为胰岛素基因的有效反式作用子起作用。MAFA与NEUR0D1和TOXl协同地合作。通过GSK3的磷酸化增加其转录活性并且对于其致癌活性是必需的。胰腺-十二指肠同源异型盒I(PDXl)是同源异型盒基因家族的转录因子，其在胰腺、十二指肠和窦的分化和发育中很重要。胰腺十二指肠同源异型盒i(rox-i)是在胰腺发育中具有重要作用的转录因子。PDX-I调节胰腺细胞增殖和分化，并且增加的该转录因子表达已描述于人胰腺腺癌和细胞系中。Pdxl对于￠-细胞成熟也是必需的发育￠-细胞 共表达Pdxl、Nkx6-l和胰岛素，一种导致MafB的沉默和MafA (在P -细胞成熟中必要的开关)的表达的过程。Pdxl似乎也在内分泌细胞的命运中起作用，编码胰岛素和生长抑素(两种胰腺内分泌产物)，同时抑制高血糖素。因此，Pdxl表达明显有助于产生胰岛素+ 0 -细胞以及生长抑素+A-细胞，而不是高血糖素+ a -细胞。Nkx6. I被公认为胰腺中大多数P -细胞特异性转录因子。Nkx6同源结构域转录因子在CNS和胰腺中具有重要的发育作用。Nkx6. I对适当的运动神经元和少突胶质细胞发育以及产胰岛素胰腺P细胞的发育和维持而言是必要的。Nkx-6. I在腹侧神经元祖细胞中并且随后在一半侧运动神经元列(LMCm)的中位中和在Shh表达细胞周围的间充质组织(腹侧脊膜、食道间充质和背侧气管间充质)中表达。Nkx6. I对于脊椎动物CNS中的腹侧区域图式形成和神经元命运确定是必需的。Nkx6. I控制运动神经元和腹侧中间神经元命运。Nkx6. I控制颅鳃运动神经元的迁移和轴突领航并且其对于体细胞运动神经元祖细胞在脊髓中的早期特化而言是必需的。鳃运动神经元(后脑)的早期特化不依赖于Nkx6. I功能，但其对于它们随后的发育而言是必需的。Nkx6. I对于有丝分裂期后运动神经元的发育和鳃运动神经元迁移的控制而言是必需的。Nkx6. I表达在某些运动神经元池中的状态调节肌肉神经形成以及个体肌肉的神经分布的图式。表I显示某些胰腺发育基因的列表。应理解，下表I中所示的基因表示该基因及其所有目前已知的变体，包括该基因及其变体可产生的不同mRNA转录物、可以阐释的任何其它基因变体以及反义序列。该列表还包括包括非编码RNA分子或多核苷酸的部分。然而，一般而言，此类变体将与下表中的任何多核苷酸的序列具有显著的序列同一性，例如变体将与下表I的序列具有至少约70百分比序列同一性，通常与下表I的序列具有至少约75、80、85、90、95、97、98或99百分比序列同一性。变体的序列同一性可通过任何数量的标准技术如BLAST程序(ncbi. nclm. nih.gov/blast/)来测定。
权利要求
1.一种体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括 将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与包括SEQ ID SEQ ID NO:6的核苷酸I至1235、SEQ ID NO:7的核苷酸I 至 17，964、SEQ ID SEQ ID NO: 8 的 I 至 50，003、SEQ ID NO: 9 的核苷酸 I 至 486、SEQ IDNO: 10的核苷酸I至494、SEQ ID NO: 11的核苷酸I至1992或SEQ ID NO: 12的核苷酸I至1767中的5至30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一丨丨生；从而体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达。
2.—种体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括 将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与胰腺发育基因多核苷酸的天然反义的反向互补序列具有至少50%序列同一性；从而体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达。
3.一种体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括 将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与胰腺发育基因多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%序列同一丨丨生；从而体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达。
4.一种体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括 将所述细胞或组织与靶向胰腺发育基因多核苷酸的天然反义寡核苷酸的区域的至少一种反义寡核苷酸接触；从而体内或体外调节患者细胞或组织中胰腺发育基因多核苷酸的功能和/或表达。
5.如权利要求4所述的方法，其中胰腺发育基因的功能和/或表达相对于对照体内或体外增加。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向胰腺发育基因多核苷酸的天然反义序列。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向包括胰腺发育基因多核苷酸的编码核酸序列和/或非编码核酸序列的核酸序列。
8.如权利要求4所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向胰腺发育基因多核苷酸的重叠序列和/或非重叠序列。
9.如权利要求4所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸包括选自以下的一种或多种修饰至少一种修饰的糖部分、至少一种修饰的核苷间键合、至少一种修饰的核苷酸及其组合。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的糖部分2’ -O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -0-烷基修饰的糖部分、二环的糖部分及其组合。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的核苷间键合硫代磷酸酯、2’ -O甲氧基乙基(MOE)、2’ -氟、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组
12.如权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的核苷酸肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯糖-核酸(FANA)、类似物、衍生物及其组
13.如权利要求I所述的方法，其中所述至少一种寡核苷酸包括如SEQID NO: 13至45所列的至少一种寡核苷酸序列。
14.一种体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中胰腺发育基因基因的功能和/或表达的方法，所述方法包括 将所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的至少一种短干扰RNA(SiRNA)寡核苷酸接触，所述至少一种SiRNA寡核苷酸对胰腺发育基因多核苷酸的反义多核苷酸有特异性，其中所述至少一种siRNA寡核苷酸与胰腺发育基因多核苷酸的反义核酸分子和/或有义核酸分子的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少50%序列同一性；以及体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中胰腺发育基因的功能和/或表达。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述寡核苷酸与胰腺发育基因多核苷酸的反义核酸分子和/或有义核酸分子互补的至少约五个连续核酸的序列具有至少80%序列同一性。
16.一种体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中胰腺发育基因的功能和/或表达的方法，所述方法包括 将所述细胞或组织与长度为约5至30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，所述至少一种反义寡核苷酸对胰腺发育基因多核苷酸的有义和/或天然反义链的非编码序列和/或编码序列有特异性，其中所述至少一种反义寡核苷酸与如SEQ ID NO: I至12所列的至少一种核酸序列具有至少50%序列同一性；以及体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中胰腺发育基因的功能和/或表达。
17.一种合成的、修饰的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自至少一种修饰的糖部分；至少一种修饰的核苷酸间键合；至少一种修饰的核苷酸及其组合；其中所述寡核苷酸是与胰腺发育基因基因杂交并与正常对照相比体内或体外调节其功能和/或表达的反义化合物。
18.如权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述至少一种修饰包括选自以下组成的组的核苷酸间键合硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。
19.如权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一种硫代磷酸酯核苷酸间键合。
20.如权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸间键合的主链。
21.如权利要求17所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包括至少一种修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自肽核酸、锁核酸(LNA)、类似物、衍生物及其组合。
22.如权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的修饰的核苷酸硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。
23.如权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的修饰的核苷酸肽核酸、锁核酸(LNA)、类似物、衍生物及其组合。
24.如权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括选自以下的至少一种修饰的糖部分2’ -O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -0-烷基修饰的糖部分、二环的糖部分及其组合。
25.如权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的修饰的糖部分2’ -0-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -0-烷基修饰的糖部分、二环的糖部分及其组合。
26.如权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为至少约5至30个核苷酸并与胰腺发育基因多核苷酸的反义和/或有义链杂交，其中所述寡核苷酸与胰腺发育基因多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约20%序列同一性。
27.如权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与胰腺发育基因多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约80%序列同一1丨生。
28.如权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与至少一种胰腺发育基因多核苷酸杂交并与正常对照相比体内或体外调节其表达和/或功能。
29.如权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO: 13至45所列的序列。
30.一种组合物，所述组合物包括对一种或多种胰腺发育基因多核苷酸有特异性的一种或多种寡核苷酸，所述多核苷酸包括反义序列、互补序列、等位基因、同系物、同种型、变体、衍生物、突变体、片段或其组合。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述寡核苷酸与如SEQID NO: 13至45所列的任一种核苷酸序列相比具有至少约40%序列同一性。
32.如权利要求30所述的组合物，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO: 13至45所列的核苷酸序列。
33.如权利要求32所述的组合物，其中如SEQID NO: 13至45所列的寡核苷酸包括一种或多种修饰或取代。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述一种或多种修饰选自硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、锁核酸(LNA)分子及其组合。
35.一种预防或治疗至少一种胰腺发育基因多核苷酸和/或至少一种其编码的产物相关的疾病的方法，所述方法包括 向患者施用治疗有效剂量的结合所述至少一种胰腺发育基因多核苷酸的天然反义序列并调节所述至少一种胰腺发育基因多核苷酸的表达的至少一种反义寡核苷酸；从而预防或治疗至少一种胰腺发育基因多核苷酸和/或至少一种其编码的产物相关的疾病。
36.如权利要求35所述的方法,其中与至少一种胰腺发育基因多核苷酸相关的疾病选自与胰腺发育基因的异常功能和/或表达相关的疾病或病症、与表I中所列出的基因中的任一基因的异常功能和/或表达相关的疾病或病症、心血管疾病或病症(例如，充血性心力衰竭、心肌梗塞、缺血性疾病、房性或室性心律失常、高血压血管疾病、外周血管疾病和动脉粥样硬化等)、炎症、胃肠道疾病或病症(例如，食道病症、失弛缓症、强力型失弛缓症、吞咽困难、环咽共济失调、食道前吞咽困难、扩散性食道痉挛、球状感觉、Barrett组织转化、胃食管反流等)、胃和/或十二直肠的疾病或病症(例如，功能性消化不良、胃粘膜炎症、胃炎、应激性胃炎、慢性糜烂性胃炎、胃腺萎缩、胃组织的组织转化、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃赘生物)、胰腺疾病或病症(例如，急性或慢性胰腺炎、胰腺的外分泌或内分泌组织的机能不全如脂肪痢、糖尿病等)、外分泌或内分泌胰腺的赘生物(例如，多发性内分泌瘤形成综合征、导管胰腺、囊腺癌、胰岛细胞肿瘤、胰岛素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、胰高血糖素瘤、佐林格-埃利森综合征、血管活性肠肽瘤综合征、吸收障碍综合征等)、肠疾病或病症(例如，慢性肠炎性疾病、克罗恩氏病、肠梗阻、腹泻和便秘、结肠无力、巨结肠、吸收不良综合征、溃疡性结肠炎、功能性肠紊乱、肠应激综合征等)、肠赘生物(例如，家族性肠息肉病、腺癌、原发性恶性淋巴瘤、类癌瘤、卡波西氏肉瘤、息肉、结肠和直肠的癌)；肝脏疾病或病症(例如，胆红素代谢病症、黄疸、吉尔伯特综合征、克-纳二氏综合征、杜宾-约翰逊综合征和罗托综合征；肝内胆汁淤积、肝肿大、门静脉高血压、腹水、巴德-吉亚利综合征、门体性脑病、脂肪肝、脂肪变性、莱耶综合征、由于酒精引起的肝脏疾病、酒精性肝炎或肝硬化、纤维化、肝硬化等)、由于先天性代谢缺陷或外源性物质引起的肝纤维化和/或肝硬化、贮积疾病或病症、Gaucher综合征、泽韦格综合征、威尔逊氏病综合征、急性或慢性肝炎、病毒性肝炎及其变型；由于病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫引起的肝脏炎性疾患；药物诱导的肝脏疾病或疾病、慢性肝病如原发性硬化性胆管炎、a i_抗胰蛋白酶缺陷、原发性胆汁性肝硬化、术后肝脏病症如术后肝内胆汁淤积、肝肉芽肿、与全身性疾病相关的血管肝脏疾病或病症、肝的良性或恶性赘生物、新生儿或早产儿的肝代谢紊乱、肌骨骼疾病(例如，骨质疏松症、绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、特发性青少年骨质疏松症、畸形性骨炎、骨软骨瘤、骨软骨性外生骨疣等)、骨肿瘤(例如，良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤、骨巨细胞瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤(成骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏瘤(尤因氏肉瘤)、骨的恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤、骨的转移性肿瘤)、骨关节炎和痛风与假痛风；关节和结缔组织病症(例如，类风湿性关节炎、银屑病关节炎、盘状红斑狼疮、全身性红斑狼疮、硬皮病(全身性硬化)、舍格伦综合征、结缔组织疾病、多肌炎和皮肌炎、复发性多软骨炎、血管炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、颞动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病、莱特尔综合征、白塞综合征、强直性脊柱炎或夏科氏关节(神经性关节病)等)；骨和关节感染(例如，骨髓炎和感染性关节炎)；肌肉、囊和/或腱的疾病或病症(例如，痉挛性斜颈、纤维肌痛综合征(肌筋膜痛综合症、纤维肌炎)、粘液囊炎、腱炎和腱鞘炎)、足部问题(例如，足踝扭伤、脚骨伤、脚后跟骨刺、塞佛氏病、后跟腱粘液囊炎、前跟腱粘液囊炎、胫后神经痛、跖球疼痛(由脚趾之间的神经或脚趾与脚之间的关节的损伤引起的)、甲癣或甲变色)、癌症、炎性疾病或病症例如I_IV型超敏反应(例如，肺超敏感性疾 病(包括哮喘、特应性疾病、过敏性鼻炎或结膜炎)、眼脸血管性水肿、遗传性血管性水肿、抗受体超敏反应和自身免疫性疾病、桥本氏甲状腺炎、全身性红斑狼疮、古德帕斯丘综合征、天疱疮、重症肌无力、格雷夫斯病和雷诺氏病、B型胰岛素抗性糖尿病、类风湿性关节炎、银屑病、克罗恩氏病、硬皮病、混合性结缔组织病、多发性肌炎、类肉状瘤病、肾小球肾炎、急性或慢性宿主抗移植物反应)；肺部疾病或病症例如慢性阻塞性肺病(COPD);泌尿系统病症例如构成女性和男性泌尿生殖系统的器官的恶性病症、肾脏疾病或病症如急性或慢性肾衰竭、免疫学介导的肾脏疾病如肾移植排斥、狼疮性肾炎、免疫复合物肾脏疾病、肾小球病、肾炎、中毒性肾病、阻塞性尿路病变如良性前列腺增生(BPH)、神经原性膀胱综合征、尿失禁如急迫性尿失禁、应激性尿失禁或溢流性尿失禁、骨盆痛、和勃起机能障碍、与缺陷型内分泌胰腺发育相关的疾病或病症(例如，2型糖尿病)；与缺陷性神经发生相关的疾病或病症；神经退行性疾病或病症(例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化等)；前庭和/或听觉系统的缺陷性发育相关的疾病或病症、与光感受器细胞损伤相关的疾病或病症(例如，视觉丧失、年龄相关性黄斑退变等)、肥胖症、与肝机能缺陷相关的疾病或病症(例如，肝衰竭)、粉状白内障、蔚蓝色内障、非-综合征性先天性白内障、先天性白内障-小角膜综合征、胰腺疾病或病症(例如，糖尿病、MODY综合征、局部性胰腺发育不全、慢性高血糖、胰腺3细胞衰竭、葡萄糖毒性、葡萄糖耐受、代谢综合征X等)、克罗恩氏病、心肌梗塞、高胆红素血症、颅内动脉粥样硬化、脑梗塞、疱疹病毒感染、与脂质代谢受损相关的疾病或病症、与胰岛素产生相关的疾病或病症、与血清素产生相关的疾病或病症(例如抑郁和肥胖症)、神经学疾病或病症(包括与神经缺陷相关的病症(例如，运动神经元、产血清素神经元、多巴胺神经元的缺陷和前脑、中脑、后脑和脊髓的发育缺陷)等)、生殖系统疾病和代谢疾病 或病症例如糖尿病(例如，2型糖尿病；非-胰岛素依赖性糖尿病)。
37.一种鉴定和选择用于体内施用的至少一种寡核苷酸的方法，所述方法包括选择与疾病状态相关的靶多核苷酸；鉴定包括与所选靶多核苷酸或与所选靶多核苷酸的反义多核苷酸互补的至少五个连续核苷酸的至少一种寡核苷酸；测量反义寡核苷酸和所述靶多核苷酸或与所选靶多核苷酸反义的多核苷酸在严格杂交条件下的杂合体的热熔点；和基于所获得的信息选择用于体内施用的至少一种寡核苷酸。
全文摘要
本发明涉及调节胰腺发育基因的表达和/或功能的反义寡核苷酸，尤其是通过靶向胰腺发育基因的天然反义多核苷酸。本发明还涉及这些反义寡核苷酸的鉴定和它们在治疗胰腺发育基因表达相关的疾病和病症中的用途。
文档编号A61K48/00GK102822342SQ201180006328
公开日2012年12月12日 申请日期2011年1月6日 优先权日2010年1月6日
发明者J·克拉德, O·霍克瓦舍曼 申请人:库尔纳公司