专利名称：一种纳米药物载体脑内递送方法
技术领域：
本发明涉及医药学领域，更具体地讲，涉及一种超声联合微泡介导的纳米药物载体脑内递送技术。
背景技术：
脑部疾病，包括脑肿瘤和神经退行性疾病(如老年性痴呆、帕金森病)等，是危害人类生命和健康的重大疾病，且发病率正呈逐年上升的趋势。然而，目前脑部疾病的有效药物诊疗尚面临几大核心难题，其中跨越血脑屏障(Blood Brain Barrier, BBB)给药是实现脑部疾病药物治疗必须克服的首要难题。BBB是存在于血液和脑组织之间的一层屏障系统，由极化的脑毛细血管内皮细胞通过复杂的细胞间紧密连接构成，它对维系脑内环境的相对稳定十分重要，但同时也是药物进入脑组织发挥预防、治疗和诊断作用的主要屏障。临床常规制剂给药后，98%的化学药物以及近乎100%的蛋白/多肽和基因药物均难以入脑，极大影响了对脑部疾病的诊疗效果。因此，设计构建高效跨越BBB的药物递送技术具有极重要的研究价值和应用前景。以往临床上为增加药物脑内递送，常采用颈动脉灌注高渗溶液开放血脑屏障，或通过颅骨钻孔，局部脑内药物注射。这些方法存在脑部损伤、出血和感染等风险。以非侵袭性给药途径提高药物脑内递送的研究是近年来国内外脑内靶向给药的研究重点和热点。其中受体、吸附介导的脑靶向纳米递药系统因具有良好的药物载带和递送能力，受到极大的关注。然而该类方法仍存在组织选择性较差、脑内递药效率不够理想、难以准确靶向递药至病灶等问题。主要原因在于①涉及的受体往往不仅存在于脑毛细血管，还广泛表达于其他外周器官，因此组织选择性较差；②受到受体表达量、亲和力、转运效率和内源性物质影响等因素的制约，该类制剂与非靶向制剂相比，脑内递药效率提高有限，难以实现从基础到临床的转化。随着现代声学技术的发展，超声技术已被广泛用于常规诊断，也正逐步被用于治疗领域，如肿瘤增敏、杀伤和增强生物膜通透性，促进药物转运、基因导入细胞等。近年来， 超声作为一种物理性短暂打开BBB的手段用于提高药物的脑部递送受到越来越多的关注。 1955年，Barnard等最早报道医用超声可提高BBB通透性，但之后的研究发现单纯超声打开 BBB需要较高的能量，在提高BBB通透性的同时往往引起脑血管或脑组织损伤。直至2001 年，Hynynen等应用超声联合微泡技术才使该问题得以解决。微泡是一种由生物相容性良好的白蛋白、糖类、非离子型表面活性剂、脂质或生物可降解高分子材料制备而成的内部包含气体的微米级气泡，其在超声场下的作用体现在①作为强大的声学反射体和散射体， 微泡可大大增强组织的回波能力，在温和的超声条件下即可提供高清晰度和对比度的超声图像，利于诊断；②在超声作用下，微泡因振动产生空化效应(cavatition)，可诱导血管内皮细胞转运小泡(vacuole)形成，增加胞吞转运，并介导部分细胞间紧密连接短暂开放， 由此选择性提高超声作用部位血管膜的通透性。微泡存在条件下，超声提高BBB通透性所需功率比单纯超声降低两个数量级以上，因此大大降低了对脑组织的损伤风险。与其他脑靶向递药技术相比，超声联合微泡介导的药物跨BBB转运具有组织选择性强、高效、无创和可逆等优点。因此，超声联合微泡介导的脑内递药技术是一种很有应用前景的新型脑靶向递药技术。美中不足的是对于一些本身具有不良性质如稳定性差、强亲水性的药物，超声联合微泡技术介导其入脑的效率仍不够理想。此外，该技术缺乏生物学上的靶向特性，尚无法进一步实现对脑内病灶部位的分子靶向。具有高效载药能力和可实现分子靶向功能的纳米药物载体(如纳米粒、脂质体、囊泡、胶束等)可在较大程度上弥补超声联合微泡技术的上述不足，并与其形成良好的互补。 纳米药物载体具有如下特性①通过包载药物，掩蔽其本身不利于透过血脑屏障的理化性质，如亲水性和P-糖蛋白外排特性等，发挥纳米尺度效应，增加药物的脑内导入；②保护药物免受酶和环境PH的降解，提高药物特别是生物大分子药物的生物利用度；③包载诊断药物，可增强信号强度，提高检测灵敏度，改善成像效果；④可以根据生物学原理对纳米药物载体进行靶向功能分子修饰，利用其主动寻靶功能，增加纳米药物载体对病灶的亲和性，实现药物在病灶部位的浓集。基于此，本发明提出一种新型的脑靶向递药策略结合现代声学技术和纳米递药技术，通过超声联合微泡技术介导载诊疗药物的纳米药物载体的高效脑内递送(图1)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用超声联合微泡介导载诊疗药物的纳米药物载体的高效脑内递送方法。本发明所要解决的第二个技术问题是，提供一种纳米药物组合物。为了解决上述第一个问题，本发明提供了一种纳米药物载体脑内递送方法，所述递送方法是指利用超声联合微泡介导载诊疗药物的纳米药物载体的脑内递送，所述纳米药物载体和微泡为分别给药、简单混合同时给药、非共价连接同时给药或者共价连接同时给药中的一种，所述超声联合微泡介导载诊疗药物的纳米药物载体的脑内递送作用方式是机体给予微泡后立即超声或者过一段时间超声。所述分别给药是指纳米药物载体在超声微泡处理之前或之后4小时内给药；优选在超声微泡处理之后2小时内给药。所述简单混合同时给药是指给药前微泡和纳米药物载体简单混合(无特殊相互作用)，而后同时给药。所述非共价连接同时给药是指纳米药物载体和微泡通过静电相互作用非共价结合；所述共价连接同时给药是指通过纳米药物载体表面功能化基团和微泡共价连接。所述通过静电相互作用非共价结合是指应用带正电荷的磷脂或其衍生物制备微泡，吸附表面带负电荷的纳米药物载体；所述通过纳米药物载体表面功能化基团和微泡共价连接是指通过应用带功能基团如SPDP的磷脂衍生物制备微泡与表面带氨基功能基团的纳米药物载体共价连接，或者应用带功能基团如马来酰亚氨基的磷脂衍生物制备微泡与表面带巯基功能基团的纳米药物载体共价连接。作为一个优选，所述机体给予微泡后过一段时间超声是指给予微泡后10分钟内超声。所述超声是指高频变化的压力波，超声频率范围为20 KHz - 10 MHz，优选0. 2MHz - 5 MHz ；机械指数范围为 0. 1 — 2. 0，优选 0. 6 — 1. 4。所述微泡是指以白蛋白、磷脂、磷脂类衍生物或高分子聚合物为材料，以全氟丙烷、全氟丁烷或六氟化硫为填充气，以交联法、探头超声法、冷冻干燥法、乳化法、机械振荡法、共轴直流电雾化法、流动聚焦法或微流控方法制备而得微米级气泡；所述白蛋白是指人血清白蛋白或牛血清白蛋白中的一种或多种，所述磷脂、磷脂类衍生物是指鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸及其衍生物中的一种或多种，所述高分子聚合物是指聚乳酸(PLA)或乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)中的一种或多种；所述微泡粒径范围为0. 1 — 20 Mm，优选为0. 5 — 10 Mm。所述纳米药物载体的粒径范围为1 一 1000 nm，优选为10 — 200 nm。为了解决本发明第二个问题，本发明提供了一种纳米药物组合物，含有纳米药物载体和药物，所述纳米药物组合物还含有微泡，所述微泡是指以白蛋白、磷脂、磷脂类衍生物或高分子聚合物为材料，以全氟丙烷、全氟丁烷或六氟化硫为填充气，以交联法、探头超声法、冷冻干燥法、乳化法、机械振荡法、共轴直流电雾化法、流动聚焦法或微流控方法制备而得微米级气泡；所述纳米药物载体是指按照常规方法制备获得的能够包载并输送药物的纳米尺度复合体；所述药物是指中枢疾病治疗和诊断药物，或是通过中枢作用发挥全身性治疗作用的药物，所述药物包载于纳米药物载体中，是小分子化学药物、诊断药物、多肽蛋白药物以及基因药物中的一种或者几种，所述纳米药物组合物按照所述脑内递送方法靶向递药。所述脑内递送方法是指利用超声联合微泡介导载诊疗药物的纳米药物载体的脑内递送，所述纳米药物载体和微泡为分别给药、简单混合同时给药、非共价连接同时给药、 共价连接同时给药中的一种，所述超声联合微泡介导载诊疗药物的纳米药物载体的脑内递送作用方式是机体给予微泡后立即超声或者过一段时间超声。所述分别给药是指纳米药物载体在超声微泡处理之前或之后4小时内给药；优选在超声微泡处理之后2小时内给药。所述简单混合同时给药是指给药前微泡和纳米药物载体简单混合(无特殊相互作用)，而后同时给药。所述非共价连接同时给药是指纳米药物载体和微泡通过静电相互作用非共价结合；所述共价连接同时给药是指通过纳米药物载体表面功能化基团和微泡共价连接。所述通过静电相互作用非共价结合是指应用带正电荷的磷脂或其衍生物制备微泡，吸附表面带负电荷的纳米药物载体；所述通过纳米药物载体表面功能化基团和微泡共价连接是指通过应用带功能基团如SPDP的磷脂衍生物制备微泡与表面带氨基功能基团的纳米药物载体共价连接，或者应用带功能基团如马来酰亚氨基的磷脂衍生物制备微泡与表面带巯基功能基团的纳米药物载体共价连接。作为一个优选，所述机体给予微泡后过一段时间超声是指给予微泡后10分钟内超声。所述超声是指高频变化的压力波，超声频率范围为20 KHz - 10 MHz，优选 0. 2MHz - 5 MHz ；机械指数范围为 0. 1 — 2. 0，优选 0. 6 — 1. 4。本发明所述的纳米药物载体是指按照常规方法制备获得的能够包载并输送药物的纳米尺度复合体，具体是指以药剂学手段制备的纳米粒、囊泡、脂质体、胶束或/和诊疗药物的复合体。所述的纳米粒选用高分子材料聚酯类生物降解性材料及其衍生物制备。优选聚乙二醇一聚乳酸嵌段共聚物(PEG-PLA)、聚乙二醇一乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物(PEG-PLGA) 和聚乙二醇一聚己内酯(PEG-PCL)。其中聚乙二醇部分为单甲氧基聚乙二醇或功能性聚乙二醇。功能性基团是马来酰亚胺基、巯基、酰胼基、羧基、叠氮基、醛基、生物素或亲和素中的一种。纳米粒表面可通过功能化基团连接靶向脑内病灶的配体，如靶向脑肿瘤血管的RGD 肽、靶向脑内Beta淀粉样斑块的D型多肽等。所述的囊泡材料选用聚乙二醇一聚乳酸嵌段共聚物(PEG-PLA)或/和功能性 PEG-PLA ；聚乙二醇一乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)或/和功能性PEG-PLGA ；聚乙二醇一聚己内酯嵌段共聚物(PEG-PCL)或/和功能性PEG-PCL。其中，功能性聚乙二醇部分的功能性基团是马来酰亚胺基、巯基、酰胼基、羧基、叠氮基、醛基、生物素或亲和素中的一种。囊泡表面可通过功能化基团连接靶向脑内病灶的配体，如靶向脑肿瘤血管的RGD肽、 靶向脑内Beta淀粉样斑块的D型多肽等。所述的脂质体材料选用鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸或胆固醇及其衍生物中的一种或多种。脂质体表面可通过功能化基团连接靶向脑内病灶的配体，如靶向脑肿瘤血管的R⑶肽、靶向脑内Beta淀粉样斑块的D型多肽等。所述的胶束选用两亲性聚合物材料制备。优选聚乙二醇嵌段共聚物，如聚乙二醇一聚乳酸嵌段共聚物(PEG-PLA)、聚乙二醇一聚乳酸乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物 (PEG-PLGA)和聚乙二醇一聚己内酯(PEG-PCL)、伯洛沙姆等。其中聚乙二醇部分为单甲氧基聚乙二醇或功能性聚乙二醇。功能性基团是马来酰亚胺基、巯基、酰胼基、羧基、叠氮基、 醛基、生物素或亲和素中的一种。胶束表面可通过功能化基团连接靶向脑内病灶的配体，如靶向脑肿瘤血管的RGD肽、靶向脑内Beta淀粉样斑块的D型多肽等。包载于纳米药物载体中的药物是小分子化学药物、诊断药物、多肽蛋白药物以及基因药物中的一种或者几种，主要是中枢疾病治疗和诊断药物，或是通过中枢作用发挥全身性治疗作用的药物。其中诊断药物是磁共振成像剂或核素成像剂，优选钆剂和狗304。本发明所述的微泡和纳米药物载体的给药方式是静脉注射或者肌肉注射。本发明的优点在于，与传统的超声联合微泡介导药物脑内递送相比，该技术可克服药物的不良体内性质(稳定性差、易被机体清除等)，增强诊断分子信号强度，提高检测灵敏度，可实现病灶靶向；而与现有的纳米药物载体脑内递药技术相比，该技术通过外加超声可实现更高效、更特异的脑内药物递送。
图1为超声联合微泡介导纳米药物载体的脑内递送示意图。图2为超声联合微泡介导纳米粒脑内递药，皮层、海马、基底核和血浆药时曲线图，并与纳米粒单独注射给药对照组比较。图3为超声联合微泡介导载香豆素6脂质体转运进入脑实质。A，脂质体单独注射给药；B，超声联合微泡处理后立即脂质体注射给药。1，脂质体信号；2，脂质体信号+血管信号；3，脂质体信号+血管信号+细胞核信号。
图4为超声联合微泡介导狗304纳米粒的脑血管内皮细胞和神经元细胞摄取，其中 *指I^e3O4纳米粒，短箭头代表内吞小泡，长箭头代表紧密连接。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
做详细说明。实施例1、超声联合微泡介导载香豆素6纳米粒的脑内递送
载香豆素6纳米粒的制备单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(MPEG-PLA)嵌段共聚物10 — 25 mg溶于1 ml 二氯甲烷溶液(含0.01 — 0.2 mg香豆素6)中，加入2 ml 1%的胆酸钠溶液，220 W连续超声30 s — 2 min得到初乳。初乳加入到8-25 ml 0. 5%的胆酸钠溶液中，搅拌5 min后旋转蒸发除去二氯甲烷，4 °C 14000 rpm离心45 min，去除上清，用0. 01 mol/ L pH7. 0 HEPES重新分散，过kpharose CL-4B凝胶柱除去未包封香豆素6，即得载香豆素 6纳米粒。采用临床诊断用超声装置，以SFDA批准在我国使用的SonoVue (粒径约2 Mm)为超声微泡。如表1考察超声模式、机械指数、时间、微泡剂量、纳米粒给药时机对载香豆素6 纳米粒脑内递送的影响。结果表明，超声联合微泡处理后立即给予纳米粒，入脑效果最好； B型造影模式促进纳米粒脑内递送效果优于快闪模式；微泡剂量对纳米粒入脑效果有一定影响，30 μ /只效果优于60 μ /只；机械指数是影响纳米粒脑内递送效果的关键因素机械指数为0. 6，纳米粒入脑量与纳米粒单独注射入脑量相似；机械指数0. 9，纳米粒入脑量为对照组的两倍；机械指数升高至1. 1、1. 4，纳米粒入脑量与机械指数为0. 9组无显著性差
已 表1.超声联合微泡处理试验参数(超声频率为0.2 — 5 MHz)。_
权利要求
1.一种纳米药物载体脑内递送方法，其特征在于，所述递送方法是指利用超声联合微泡介导载诊疗药物的纳米药物载体的脑内递送，所述纳米药物载体和微泡为分别给药、简单混合同时给药、非共价连接同时给药或者共价连接同时给药中的一种，所述超声联合微泡介导载诊疗药物的纳米药物载体的脑内递送作用方式是机体给予微泡后立即超声或者过一段时间超声。
2.根据权利要求1所述的纳米药物载体脑内递送方法，其特征在于，所述分别给药是指纳米药物载体在超声微泡处理之前或之后4小时内给药。
3.根据权利要求2所述的纳米药物载体脑内递送方法，其特征在于，所述分别给药是指纳米药物载体在超声微泡处理之后2小时内给药。
4.根据权利要求1所述的纳米药物载体脑内递送方法，其特征在于，所述简单混合同时给药是指在给药前微泡和纳米药物载体简单混合，而后同时给药。
5.根据权利要求1所述的纳米药物载体脑内递送方法，其特征在于，所述非共价连接同时给药是指纳米药物载体和微泡通过静电相互作用非共价结合；所述共价连接同时给药是指通过纳米药物载体表面功能化基团和微泡共价连接。
6.根据权利要求5所述的纳米药物载体脑内递送方法，其特征在于，所述通过静电相互作用非共价结合是指应用带正电荷的磷脂或其衍生物制备微泡，吸附表面带负电荷的纳米药物载体；所述通过纳米药物载体表面功能化基团和微泡共价连接是指通过应用带功能基团如SPDP的磷脂衍生物制备微泡与表面带氨基功能基团的纳米药物载体共价连接，或者应用带功能基团如马来酰亚氨基的磷脂衍生物制备微泡与表面带巯基功能基团的纳米药物载体共价连接。
7.根据权利要求1所述的纳米药物载体脑内递送方法，其特征在于，所述机体给予微泡后过一段时间超声是指给予微泡后10分钟内超声。
8.根据权利要求1所述的纳米药物载体脑内递送方法，其特征在于，所述超声是指高频变化的压力波，超声频率范围为20 KHz - 10 MHz，优选0. 2MHz — 5 MHz ；机械指数范围为 0. 1 — 2. 0，优选 0. 6 - 1. 4。
9.根据权利要求1所述的纳米药物载体脑内递送方法，其特征在于，所述微泡是指以白蛋白、磷脂、磷脂类衍生物或高分子聚合物为材料，以全氟丙烷、全氟丁烷或六氟化硫为填充气，以交联法、探头超声法、冷冻干燥法、乳化法、机械振荡法、共轴直流电雾化法、流动聚焦法或微流控方法制备而得微米级气泡；所述白蛋白是指人血清白蛋白或牛血清白蛋白中的一种或多种，所述磷脂、磷脂类衍生物是指鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸及其衍生物中的一种或多种，所述高分子聚合物是指聚乳酸或乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或多种；所述微泡粒径范围为0. 1 — .20 Mffl, 优选为0. 5 — 10 Mm。
10.根据权利要求1所述的纳米药物载体脑内递送方法，其特征在于，所述纳米药物载体的粒径范围为1 一 1000 nm，优选为10 — 200 nm。
11.一种纳米药物组合物，含有纳米药物载体和药物，其特征在于，所述纳米药物组合物还含有微泡，所述微泡是指以白蛋白、磷脂、磷脂类衍生物或高分子聚合物为材料，以全氟丙烷、全氟丁烷或六氟化硫为填充气，以交联法、探头超声法、冷冻干燥法、乳化法、机械振荡法、共轴直流电雾化法、流动聚焦法或微流控方法制备而得微米级气泡；所述纳米药物CN 102525935 A载体是指按照常规方法制备获得的能够包载并输送药物的纳米尺度复合体；所述药物是指中枢疾病治疗和诊断药物，或是通过中枢作用发挥全身性治疗作用的药物，所述药物包载于纳米药物载体中，是小分子化学药物、诊断药物、多肽蛋白药物以及基因药物中的一种或者几种，所述纳米药物组合物按照权利要求1—10任一所述脑内递送方法靶向递药。
全文摘要
本发明提供了一种纳米药物载体脑内递送方法，利用超声联合微泡介导载诊疗药物的纳米药物载体的脑内递送，所述纳米药物载体和微泡为分别给药、简单混合同时给药或者非共价、共价连接同时给药中的一种，所述超声联合微泡介导载诊疗药物的纳米药物载体的脑内递送作用方式是机体给予微泡后立即超声或者过一段时间超声。本发明的技术方案与传统的超声联合微泡介导药物脑内递送相比，可克服药物的不良体内性质(稳定性差、易被机体清除等)，增强诊断分子信号强度，提高检测灵敏度，可实现病灶靶向；而与现有的纳米药物载体脑内递药技术相比，该技术通过外加超声可实现更高效、更特异的脑内药物递送。
文档编号A61K51/04GK102525935SQ20121001493
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者姚磊, 宋清香, 胡兵, 陈红专, 高小玲 申请人:上海交通大学医学院