专利名称：一种快速构建复层细胞的方法
技术领域：
本发明属于组织工程领域，具体的说是涉及一种快速构建复层细胞的方法。
背景技术：
组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，用以对病变或受损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。对于多细胞结构的复杂组织器官来说，细胞结构基础决定着组织器官的功能，如何制备具有生命力的复层细胞结构，对于本领域的发展和临床的实际应用具有重要的作用。
常规的复层细胞构建方法为种植细胞逐层生长法，首先种植单层细胞，底层细胞可借助静电吸附或与细胞外基质的配体结合来粘附，经历足够时间后，单层细胞间可实现细胞融合，并进一步形成一定强度的细胞连接，继续给以一定的促生长或促分化培养条件，使其再逐层增殖或分化为复层细胞。其基本特点可概括为形成单层细胞一单层细胞间连接形成一形成复层细胞。这种最为常规的培养细胞复层的方法被广泛应用于心肌、气管、皮肤和角膜组织的复层细胞构建研究中，虽然可最终形成与天然类似的大体组织学结构，但却存在如下明显的限制性因素①构建复层细胞组织所需时间不具备临床应用的可行性单层细胞增殖到融合，细胞与细胞之间受体特性体连接的形成，单层细胞的2维生长向复层细胞3维生长的转变，均需较多的构建时间(数周)。对于需要组织工程产品替代的急性组织缺损来说，数周的体外构建时间，已经远远超出了临床诊治时所能提供的治疗时限。②生物学和物理学功能不完善目前的体外生物反应器还无法完全模拟体内条件下细胞生长所面对的真正微环境，其提供的营养和氧气供应方式以及代谢废物的去除方式，与体内条件差异仍然很大。因此，较长的构建时间通常会导致构建的细胞复层出现细胞过度分化和老化，各种细胞的黏附和增殖功能也会不断下降，同时细胞复层的各种物理学功能(细胞层的生物力学强度、电生理功能、组织极性等)也会相应下降。这些构建组织的各种功能学不足也严重制约了最终的临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建时间短，构建的复层细胞具备更好的生物力学强度和更好的细胞生物学功能的快速构建复层细胞的方法。本发明的快速构建复层细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤a)将种子细胞和液态的细胞外基质凝胶混悬得到液体混悬液；b)将液态混悬液置于构建载体上,使载体上的液态混悬液凝固成固态凝胶,直接形成复层细胞结构，然后加入培养液培养复层细胞至足够强度。所述的种子细胞指的是所需构建复层细胞组织的细胞,这些细胞可以经过体外培养扩增或是从组织块中新鲜分离，如角膜上皮细胞、表皮上皮细胞、成纤维上皮细胞或心肌细胞。所述的细胞外基质凝胶是指所需构建组织的细胞(种子细胞)相对应的细胞外基质成分的混合物或者单一成分所形成的凝胶，如角膜上皮细胞(种子细胞)对应角膜基质凝胶，人表皮上皮细胞和成纤维细胞(种子细胞)对应人皮肤基质凝胶，心肌细胞(种子细胞)对应心脏基质凝胶。可以为所需构建组织的细胞外基质蛋白质、多糖和糖蛋白的混合物或单一成份所形成的凝胶。本领域技术人员可以根据所需构建组织的细胞，按照本领域的常规知识获取其该细胞外基质凝胶。如利用各种变性蛋白质提取方法或非变性蛋白质提取方法，从天然动物组织中提取并纯化出各种细胞外基质蛋白的单一成分或者混合成分制备凝胶溶液。优选利用非变性蛋白质提取方法，提取所构建组织的细胞外基质蛋白质、多糖和糖蛋白的混合物或单一成分来制备基质凝胶。这种凝胶的突出优点在于提供了种子细胞本身的基质微环境，可有效的结合种子细胞表面的各种整合素受体，避免种子细胞凋亡。同时这种基质凝胶可以吸附各种生长因子，达到生理状态的缓释效果。一般可通过控制细胞外基质凝胶的温度和浓度使其呈液态，优选温度为20 37°C。所述的构建载体指的是利用天然组织脱细胞基质形成天然支架材料，或是利用合成材料构建的高分子支架材料，其主要起载体作用。利用合成材料构建的高分子支架材料可以从现有技术中购买，而利用天然组织脱细胞基质形成天然支架材料属于常规技术。所述的构建载体优选为利用脱细胞角膜基质、脱细胞皮肤基质或脱细胞心脏基质形成的天然支架材料。所述的将载体上的液态混悬液凝固成固态凝胶，其方法包括降低温度或使液态混悬液脱水以提高凝胶浓度或两者的结合来使液态混悬液凝固成固态凝胶。所述的降低温度是指降低液态混悬液的浓度从而使液态混悬液形成固态凝胶的温度，优选温度为4 200C。所述的使液态混悬液脱水以提高凝胶浓度优选利用载体的吸水性实现液态混悬液的脱水从而提高凝胶浓度使液态混悬液形成固态凝胶或利用负压蒸发的方式脱水浓缩液态混悬液形成固态凝胶。
所述的培养复层细胞是利用种子细胞的培养液进行培养，培养的方式包括静态培养、气液界面培养、连续灌注培养或者它们的组合。与现有的逐层培养复层细胞的技术相比，本发明的有益效果如下①更快的构建过程可满足临床诊治时所能提供的治疗时限。使用足量的种子细胞，借助天然细胞外基质凝胶所提供的临时载体，可直接实现复层细胞的3维构建，天然细胞外基质凝胶成分提供了大量的细胞粘附底物，使得待构建的种子细胞周边包裹了足够的细胞外基质，从而使得原本需要更长时间(2周以上)才能建立的细胞-细胞连接，转变为较易形成的细胞-基质-细胞连接(3天)。这种快速的构建过程，为最终的临床应用争取了治疗时间，也避免了由于体外构建时间过长带来的种子细胞生物功能的下降。②构建的复层细胞具备更好的细胞生物学功能。这种来源于天然细胞外基质凝胶包含大量的细胞膜结合配体，包括各种类型的胶原，蛋白多糖和糖蛋白成分，可以特异性的结合种子细胞表面的各种受体，发挥影响种子细胞生物学功能的作用。例如与细胞表面各种整合素的结合可有效减少种子细胞细胞凋亡；各种蛋白多糖成分可以抑制种子细胞在培养阶段的细胞分化或老化。因此使构建的复层细胞具备更好的细胞生物学功能。③构建的复层细胞具备更好的生物力学强度。大量细胞外基质凝胶的加入本身可显著增加细胞复层的强度，从而使得这种短期快速构建的复层细胞片获得足够的力学强度。
因此本发明可快速制备满足增殖活性和力学强度要求的各种含有复层细胞的组织器官，是组织工程构建技术的重大突破，同时本发明原理可靠，工艺简单灵活，产品重现性好，极易实现产业化。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。本发明的快速构建复层细胞的方法，其步骤详述如下(a)准备种子细胞。按照需构建复层细胞组织的结构特点，计算所需种子细胞的种类和总量，利用体外原代培养或传代培养的培养方法扩增所需细胞，或直接从组织块中新鲜分离出的足够的细胞作为种子细胞来源。离心去除培养液，种子细胞备用。 (b)在一定温度下，制备细胞外基质凝胶，使其呈液态。利用各种变性蛋白质提取方法或非变性蛋白质提取方法，从天然动物组织中提取并纯化出各种种子细胞外基质蛋白的单一成分或者混合成分制备凝胶溶液。优选利用非变性蛋白质提取方法，提取所构建组织的细胞外基质蛋白质、多糖和糖蛋白的混合物或单一成分来制备基质凝胶。这种凝胶的突出优点在于提供了种子细胞本身的基质微环境，可有效的结合种子细胞表面的各种整合素受体，避免种子细胞凋亡。同时这种基质凝胶可以吸附各种生长因子，达到生理状态的缓释效果。(C)将液态的细胞外基质凝胶与种子细胞混悬。将此时液体状细胞外基质凝胶的流动性可保证与种子细胞充分混匀。此时每个细胞都接触基质蛋白成分。其表面的整合素都被相应的配体成分结合，可有效避免种子细胞凋亡。(d)将液态混悬液置于构建载体上。根据构建目的，确定混悬液液膜的厚度。也就是最终构建组织的复层厚度。(e)将载体上的液态混悬液凝固成固态凝胶，直接形成复层细胞结构。由于这种细胞外基质凝胶的凝固性与浓度，温度有关，本发明就是调节影响凝固的这些因素，实现凝胶溶液液态-固态的转变，从而达到液态分散细胞，固态固定细胞的目的。本发明优选的液态混悬液凝固成固态凝胶的方法包括降低温度、液态混悬液脱水提高凝胶浓度、或其两者的组合。(f)加入培养液培养复层细胞至足够强度。由于此时加入的大量细胞可被固体凝胶直接固定，并且粘附于凝胶之上。此时复层细胞间形成过渡性的细胞-基质-细胞的连接，经过体外短期培养或体内植入后的重塑改建过程，最终形成天然的细胞-细胞连接结构。实施例I :利用脱细胞角膜基质凝胶和脱细胞角膜基质支架制备快速制备组织工程板层角膜。(a)准备种子细胞。取角膜缘颞上象限的2mm组织块4块，常规原代培养并传代至P3代，获取的3X IO6个角膜上皮细胞，置于离心管内，离心去除培养液，将此角膜上皮细胞作为种子细胞备用。(b)制备脱细胞角膜基质凝胶，控制浓度和温度，使其呈液态。按常规方法制备的脱细胞角膜基质样本，称重后按I : 5v/v加入lmg/mL胃蛋白酶(P印sin)+0. lmol/L HCL(DDW，pH = 1)，50°C水浴溶解，由于释放大量碱性氨基酸，完全溶解后，样品PH值增加至4. 3左右。使用lmol/L NaOH(DDW,pH = 14)溶液调整样品pH值至7. 4，按体积比9 I比例加入IOX角膜上皮细胞培养液，12000转离心IOmin后，取上清液过滤除菌，得到脱细胞角膜基质凝胶溶液。经蛋白定量检测后，使用IX角膜上皮细胞培养液调整制备的脱细胞角膜基质凝胶溶液浓度至50mg/ml，置于25°C，此时凝胶呈液态，备用。(C)将液态的细胞外基质凝胶与种子细胞混悬。向3X IO6个角膜上皮细胞中加入50 μ L脱细胞角膜基质凝胶溶液，充分混合均匀，得到液体混悬液。(d)将液态混悬液均匀滴加于脱细胞角膜基质支架(常规方法制备，O. 3mm厚度，IOmm直径)上。(e)将载体上的液态混悬液凝固成固态凝胶。由于脱细胞角膜基质支架内保留了大量蛋白多糖成分，具备了快速吸水的特性，37°C培养箱内放置20分钟,使混悬液达到一定程度的浓缩。然后将培养皿放置于4°C培养箱内静置520分钟，利用脱细胞角膜基质支架进一步吸水不断增加液态混悬液的浓度，同时4°C的低温条件使得液态混悬液快速形成固体凝胶，此时角膜上皮细胞已在脱细胞基质表面直接形成复层细胞结构。(f)对形成的复层细胞结构，加入培养液培养至可移植强度。加入IOml角膜上皮细胞培养液,静止培养6 24小时后,转移至连续灌注培养系统培养24 48小时，然后再转移至气液界面培养系统培养24 48小时，以上处理，使得快速制备的复层细胞结构的细胞连接蛋白逐渐增加，3 5天即可达到实用的可移植强度(细胞桥粒连接蛋白含量30000pg/cm2-35000pg/cm2)。构建复层细胞中的角膜上皮细胞的克隆形成率为9. 5±3. 5%,明显优于逐层培养复层细胞培养方法(克隆形成率为6. 5±2% )实施例2利用脱细胞皮肤基质凝胶快速制备组织工程皮肤细胞片。(a)准备种子细胞。取活体取材获得的4个2mm直径组织块，分别常规原代培养，并传代扩增至P5代，获取4X IO7个的人表皮上皮细胞和I X IO7个人成纤维细胞，按4 I比例，将人表皮上皮细胞和人成纤维细胞混合，离心去除培养液，作为种子细胞备用。(b)制备脱细胞皮肤基质凝胶，控制浓度和温度，使其呈液态。脱细胞皮肤基质样本(按照常规方法制备)称重后按I : 5v/v加入lmg/mL胃蛋白酶(pepsin) +0. lmol/L HCL (DDW, pH = I)，50°C水浴溶解，使用 lmol/L NaOH(DDW, pH =14)溶液调整样品pH值至7. 4，按体积比9 I比例加入IOX人上皮细胞培养液，12000转离心IOmin后，取上清液过滤除菌，得到脱细胞皮肤基质凝胶溶液。经蛋白定量检测后，使用IX人上皮细胞培养液调整制备的脱细胞皮肤基质凝胶溶液浓度至100mg/ml，置于250C，此时凝胶呈液态，备用。(C)将液态的细胞外基质凝胶与种子细胞混悬。向混合细胞(人表皮上皮细胞和人成纤维细胞)中加入500 μ L脱细胞皮肤基质凝胶溶液，充分混合均匀，得到液态混悬液。
(d)将液态混悬液均匀滴加于脱细胞皮肤基质支架(常规方法制备，3mm厚度，50mm直径)上。(e)将载体上的液态混悬液凝固成固态凝胶。4°C下，利用负压蒸发的方式脱水浓缩液态混悬液，使其快速形成固体凝胶。此时种植的混合细胞已在脱细胞 皮肤基质表面直接形成复层细胞结构。(f)对形成的复层细胞结构，加入培养液培养至可移植强度。加入20ml人上皮细胞培养液静止培养12-24小时后，转移至气液界面培养系统培养3-5天。以上处理,使得快速制备的复层细胞结构的细胞连接蛋白逐渐增加,4 6天即可达到实用的可移植强度(细胞桥粒连接蛋白含量60000pg/cm2-70000pg/cm2)。构建上皮的细胞克隆形成率为10. 5±2.5%，克隆形成率和细胞表型都明显优于逐层培养复层细胞培养方法(克隆形成率为4. 5±3. 5% )。实施例3利用脱细胞心脏基质凝胶快速制备组织工程心肌细胞片。(a)准备种子细胞。新鲜分离I日龄乳鼠心室肌组织，将获取的2X106个心肌细胞置于离心管内，离心去除培养液,备用。(b)制备脱细胞心脏基质凝胶，控制浓度和温度，使其呈液态。脱细胞心脏基质样本(按照常规方法制备)称重后按I : 5v/v加入lmg/mL胃蛋白酶(pepsin) +0. lmol/L HCL (DDW, pH = I)，50°C水浴溶解，使用 lmol/L NaOH(DDW, pH =14)溶液调整样品pH值至7. 4，按体积比9 I比例加入IOX心肌细胞培养液，12000转离心IOmin后，取上清液过滤除菌。经蛋白定量检测后，使用IX心肌细胞培养液调整制备的脱细胞心脏基质凝胶溶液浓度至80mg/ml，置于25°C，此时凝胶呈液态，备用。(c)将液态的基质凝胶与种子细胞混悬。向2 X IO6个心肌细胞中加入100 μ L脱细胞心脏基质凝胶溶液，充分混合均匀，得到液态混悬液。(d)将液态混悬液均勻滴加于I型胶原支架载体(常规方法制备，O. Imm厚度，IOmm直径)上。(e)将载体上的液态混悬液凝固成固态凝胶。4°C下，利用负压蒸发的方式脱水浓缩液态混悬液，使其快速形成固体凝胶。此时种植的细胞已在I型胶原支架表面直接形成复层细胞结构。(f)对形成的复层细胞结构，加入培养液培养至可移植强度。加入IOml心肌细胞培养液，静止培养6-12小时后，转移至连续灌注培养系统培养4 6天。以上处理,使得快速制备的复层细胞结构的细胞连接蛋白逐渐增加,5 7天即可达到实用的可移植强度(细胞桥粒连接蛋白含量50000pg/cm2-60000pg/cm2)。心肌细胞的β -半乳糖苷酶表达仅为25 %，远远优于逐层培养复层细胞的方法(β -半乳糖苷酶表达80% :细胞衰老现象严重)。
权利要求
1.ー种快速构建复层细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤 a)将种子细胞和液态的细胞外基质凝胶混悬； b)将液态混悬液置于构建载体上，使载体上的液态混悬液凝固成固态凝胶，直接形成复层细胞结构，然后加入培养液培养复层细胞至足够强度。
2.根据权利要求I所述的快速构建复层细胞的方法，其特征在于，所述的种子细胞是经过体外培养扩增或从组织块中新鲜分离得到。
3.根据权利要求I所述的快速构建复层细胞的方法，其特征在于，所述的细胞外基质凝胶是所需构建组织的细胞外基质蛋白、多糖和糖蛋白的混合物或単一成分所形成的凝胶。
4.根据权利要求I或3所述的快速构建复层细胞的方法，其特征在于，所述的液态的细胞外基质凝胶是通过控制细胞外基质凝胶的浓度和温度使其呈液态，其温度为20 37°C。
5.根据权利要求I所述的快速构建复层细胞的方法，其特征在于，所述的构建载体是利用天然组织脱细胞基质形成天然支架材料或是利用合成材料构建的高分子支架材料。
6.根据权利要求5所述的快速构建复层细胞的方法，其特征在干，所述的天然组织脱细胞基质为脱细胞角膜基质、脱细胞皮肤基质或脱细胞心脏基质。
7.根据权利要求I所述的快速构建复层细胞的方法，其特征在于，所述的将载体上的液态混悬液凝固成固态凝胶，其方法是降低混悬液的温度或使液态混悬液脱水以提高凝胶浓度或两者的结合来使液态混悬液凝固成固态凝胶。
8.根据权利要求7所述的快速构建复层细胞的方法，其特征在于，所述的降低混悬液的温度，其混悬液的温度为4 20°C。
9.根据权利要求7所述的快速构建复层细胞的方法，其特征在干，所述的使液态混悬液脱水以提高凝胶浓度是利用构建载体的吸水性实现液态混悬液的脱水从而提高凝胶浓度使液态混悬液形成固态凝胶或利用负压蒸发的方式脱水浓缩液态混悬液形成固态凝胶。
10.根据权利要求I所述的快速构建复层细胞的方法，其特征在于，所述的培养复层细胞是利用种子细胞的培养液进行培养，培养的方式包括静态培养、气液界面培养、连续灌注培养或者它们的组合。
全文摘要
本发明公开了一种快速构建复层细胞的方法。它是将将种子细胞和液态的细胞外基质凝胶混悬；将液态混悬液置于构建载体上，使载体上的液态混悬液凝固成固态凝胶，直接形成复层细胞结构，然后加入培养液培养复层细胞至足够强度。本发明可快速制备满足增殖活性和力学强度要求的各种含有复层细胞的组织器官，是组织工程构建技术的重大突破，同时本发明原理可靠，工艺简单灵活，产品重现性好，极易实现产业化。
文档编号A61L27/38GK102614547SQ20121006651
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月13日 优先权日2012年3月13日
发明者周强, 武征, 王智崇 申请人:中山大学中山眼科中心