专利名称：用于增强放射治疗功效的met抑制剂的制作方法
技术领域：
本说明书涉及MET抑制剂在增强肿瘤患者放射治疗功效中的用途。
背景技术：
虽然放射治疗已成功用于治疗癌症患者，但是其可能无法根除肿瘤，后者会以更加具有侵略性的表型复发。与此一致，动物模型的经典研究掲示了电离辐射(IR)的矛盾的促转移作用。放射治疗后的肿瘤进展可能是由干“癌症干细胞”亚群体的正向选择，其在本质上是耐辐射的。然而，显著的证据表明，除了选择之外，IR促进了ー种针对组织再生的适配表型，其可能表现为转移行为。该表型被定义为对于DNA损伤的“应激并恢复型(stress-and-recovery) ”响应,其在单细胞和组织水平上都有发生。在单细胞中，对于DNA损伤的检测得出了特定的分子机制，其主要由阻碍了复制和活性DNA的修复的ATM-p53途径(axis)调节。如果损伤是不可逆的，正常细胞即程序性地进行凋亡，或通过衰老来休眠 其増殖能力。然而，在突变细胞死亡后，组织必须恢复足够的细胞数目和模式，以恢复原始的结构和功能。从而，再生(或“创伤愈合”)被存活下来的正常细胞或肿瘤细胞所启动。如体外观察到的，该过程包括例如从伤ロ边缘脱离、获得成纤维细胞表型、迁移至受损区域、以及可能存在的増殖等步骤。整个过程被称为“上皮-间质转化”(EMT)，一个强调形态学特征的术语。最近，该过程也被定义为“侵袭性生长(IG) ”一个强调与癌症相关的功能性方面的用语。目前普遍承认EMT/IG是组织发育和再生的生理性程序，其被癌细胞篡夺以表现出入侵性和转移性。EMT/IG在癌细胞中的活化(a)有时候是由于支持克隆选择的遗传损伤；(b)更多时候是由于针对不利环境条件的适应性响应。因此，EMT/IG是ー种由几个特定转录因子最终控制的遗传程序，并由ー些胞外信号调节。后者包括分散因子(scatter factor)，例如肝细胞生长因子(HGF)和巨噬细胞刺激蛋白(MSP)，它们结合属于Met家族的酪氨酸激酶受体。
发明内容
因此需要用于增强肿瘤患者放射治疗的功效的改善的解决方案。本说明书的目标是提供该改善的解决方案。根据本发明，上述目标已经由在之后的权利要求中特别重复提到的主题所完成，其应被理解为本说明书的ー个完整的组成部分。本发明的一个实施方式提供了 Met抑制剂在治疗肿瘤(优选表现出失控的Met途径的肿瘤)患者中的用途，其中该Met抑制剂选自i)抗-Met单克隆抗体，ii)含有该抗-Met单克隆抗体的互补决定区(OTR)的遗传工程化的抗体，和iii)含有该抗-Met单克隆抗体的互补决定区(CDR)的⑴或(ii)的片段，或其组合，其中该Met抑制剂能够诱导对MET基因所编码的受体的下调和降低和/或去除患者对放射治疗的抗性。
在优选的实施方式中，该抗-Met单克隆抗体是由杂交瘤细胞系ICLC PD 05006产生的DN30抗-Met单克隆抗体。在进ー步优选的实施方式中,包含于a)遗传工程化的抗体或b)抗-Met单克隆抗体或遗传工程化的抗体的片段中的互补决定区(CDR)是DN30抗-Met单克隆抗体的CDR，该CDR的氨基酸序列如SEQ ID No. : 12-14和20-22所示。本说明书的另ー实施方式涉及用于(例如，通过基因疗法)治疗肿瘤(优选表现出失控的Met途径的肿瘤)患者的编码Met抑制剂的核苷酸序列，所述Met抑制剂选自i)抗-Met单克隆抗体，ii)含有该抗-Met单克隆抗体的互补决定区(OTR)的遗传工程化的抗体，和iii)含有该抗-Met单克隆抗体的互补决定区(CDR)的⑴或(ii)的片段，或其 组合，其中所述Met抑制剂能够诱导对MET基因所编码的受体的下调和降低和/或去除患者对放射治疗的抗性。在优选的实施方式中，该抗-Met单克隆抗体是由杂交瘤细胞系ICLC PD 05006产生的DN30抗-Met单克隆抗体。在优选的实施方式中，包含于编码a)遗传工程化的抗体或b)抗-Met单克隆抗体或遗传工程化的抗体的片段的核苷酸序列中的互补决定区(CDR)是DN30抗-Met单克隆抗体的CDR,该CDR的氨基酸序列如SEQ ID No. :12-14和20-22所示。根据ー个优选的实施方式，该Met抑制剂i)以可溶性蛋白的形式通过注射或输液来进行给药，或ii)通过载体的方式进行全身性或肿瘤内给药。根据进ー步优选的实施方式，该Met抑制剂以Fab片段的形式存在，且可选的偶联有至少ー种稳定分子，其中该稳定分子选自聚こニ醇、白蛋白结合区域、白蛋白。本说明书公开了辐射会上调MET (已知为驱动癌症“侵袭性生长”的致癌基因)的表达，其反过来会促进细胞入侵并保护细胞免受辐射诱导的凋亡。因此，通过特定化合物(即特定的Met抑制剂)来終止MET的表达或抑制其激酶的活性，能促进凋亡并消除辐射诱导的侵入，从而增强放射治疗的功效。
以下仅对本发明參考附图通过实施例的方式进行描述，其中图I. IR诱导MET转录。a，在辐射(IOGy)后给定的时间点的MDA-MB-435S中的Met蛋白。对照，在O时间点的Met。b，在辐射(I-IOGy)后12h的MDA-MB-435S中的Met蛋白。C，在辐射(IOGy)后给定的时间点的MDA-MB-435S的MET转录。d，在辐射(IOGy ;对照，未辐射的细胞)后给定的时间点的MDA-MB-231中由MET启动子(基础，不含启动子的构建体)驱动的荧光素酶活性。柱两个独立实验的三个平行分析的均值土s. e. m. Op < O. 05, η = 6,成对t检验)。a. u.,任意单位。图2. IR诱导的MET转录需要NF-K B。a,在辐射(IOGy)后给定的时间点或低氧培养24h (I % O2)后分析的MDA_MB_435S中的蛋白核聚积。对照，O时间点未辐射的细胞。b，在辐射的MDA-MB-231(10Gy ;对照，未辐射细胞)中的染色质免疫沉淀。柱表示在MET启动子中每个NF-K B结合序列(κΒ1_κΒ2)的抗_p65/RelA和非特异性IgG免疫沉淀之间的比例(三个平行分析的均值土 s. e. m.)。使用NFKBIAd κΒα)启动子作为阳性对照。C，其p65/RelA表达被沉默(siRELA ；si对照，对照)的MDA-MB-231中的MET启动子活性，并接受辐射(IOGy ;对照，未辐射的细胞)。柱表示MET启动子驱动的和无启动子(基础)的荧光素酶表达之间的比例(三个独立实验的三个平行分析的均值土s. e. m)。插图siRNA转染后的p65/RelA蛋白。d,福射后给定的时间点(对照，O时间点的未辐射的细胞)的其p65/RelA表达被沉默(siRELA ;si对照，对照)的MDA-MB-435S中的Met蛋白积累。图3. IR诱导的MET表达需要ATM激酶活化。用ATM激酶抑制剂CGK733处理并在辐射后给定的时间点提取的MDA-MB-435S中的Met蛋白表达、Chk2磷酸化(p-Chk2)和p65/RelA核易位。对照，O时间点的未辐射的细 胞。图4. IR诱导的侵袭性生长需要Met。a,由辐射的MDA-MB-231或U_251 (IOGy ;对照，对照)进行的基底膜侵袭。小室(transwell)过滤器(IOX)的显微图。b，在辐射的MDA-MB_435S(10Gy ;对照，对照)中的Met诱导的异常分枝化形态发生，培养中添加或不添加(_)给定的HGF浓度。比例尺ΙΟΟμπι。图5. Met抑制使得细胞对IR诱导的凋亡和增殖捕获敏感。用IOGy辐射的和/或在DN30抗-Met抗体的Fab片段的存在下培养的U-251存活率，各48h (载体未辐射的细胞)。柱三个独立实验的三个平行分析的均值土 s. e. m. (*p< O. 05，相对于单独的Fab-DN30或IOGy而言存活率明显下降，η = 9，成对t检验)。柱产生克隆的细胞的百分比(两个独立实验的三个平行分析的均值土s. e. m.，*p < O. 05, η=6,成对t检验)。图6. IR诱导Met磷酸化。在给定时间点对用HGF(50nM)和/或IR(IOGy)细胞处理的MDA-MB-231中的Met磷酸化用抗-Met抗体进行免疫沉淀,并用抗-磷酸-Tyr抗体(ρ-Tyr)进行蛋白质印迹分析。Met作为蛋白免疫沉淀的对照。对照，用HGF处理的阴性对照细胞(參见方法)图7.鼠和人MET启动子的比对。使用TRANSFAC 7. O 软件(Biobase Biological Database Gmbh, WolfenbutteI,Germany)对人MET启动子(GenBank登录号AF046925)进行分析来鉴定转录因子结合位点。发现了两处推测的NF- K B结合位点(K BI和K B2)。人和鼠(Gene ID :17295)MET启动子的比对显示κΒ2位点(人序列中的-1149/-1136，矩形框)在二者之间高度保守。图8. DN30单克隆抗体重链的核酸(a)和氨基酸(b)序列。⑶R区域在核苷酸和氨基酸序列中均以下划线标明。图9. DN30单克隆抗体轻链的核酸(a)和氨基酸(b)序列。CDR区域在核苷酸和氨基酸序列中均以下划线标明。
具体实施例方式在此对于本发明以非限制性实施例的方式对ー些优选的实施方式进行详细描述。在以下描述中给出了多个特定的细节用于提供对于实施方式的彻底理解。实施方式可以采用或不采用这些特定的细节来进行，或者采用其它方法、组分、材料等等。在其它例子中，没有给出或细述公知的结构、材料或操作以避免使得实施方式的内容模糊不清。在此给出的标题仅仅出于方便考虑，而不是用于解释实施方式的范围或含义。除了损伤细胞内靶点外，电离辐射(大多数情况下通过产生活性氧分子)还对调节分子的活性进行调整，该调节分子控制应激并恢复型生物响应。在该响应中，MET致癌基因的转录上调表现为ー个关键的事件，其导致消除辐射诱导损伤的促存活(pro-survival)和复苏程序的进行。本说明书显示IR诱导的MET上调受到由蛋白激酶ATM在检测到DNA损伤后引发的信号转导途径的控制。该途径涉及ATM激酶的出核转运和转录因子NF-K B从抑制中的解除。显著的是，已知由DNA损伤导致的NF-K B活化在对于辐射的防御响应中具有重要作用，因为NF-κ B是ー种显著的杭-凋亡基因的调节子。有人提出由NF-κ B促进的细胞存活非常有效，以至于能够诱导癌细胞对于放射治疗的“适应性抵抗”。本发明人在此表明，NF- K B维持的针对辐射的适应性响应关键涉及MET 原癌塞因(proto-oncogene)。IR的MET诱导是一种双向的转录事件，其由NF-κ B结合至位于MET启动子的两个K B特异性响应元件所介导。发生于辐射后l_2h的早期转录响应很可能依赖于通过DNA损伤感应器-ATM驱动的内源性途径的NF- K B的活化。可以想象的是，IR诱导的Met过表达自身足以诱发在普遍存在的HGF配体的生理浓度下的信号转导，如低氧诱导的Met过表达中所示的那样。后期持续的MET上调(持续超过24h)也可能受到影响NF-K B的多重外源信号途径的支持。事实上，辐射促进细胞因子(该细胞因子包括TNF-a、IL_l和IL-10)的表达，其在一方面是NF-K B的标靶，在另一方面刺激NF-K B转录活性。本发明人认为，在活体组织中，辐射诱导自分泌/旁分泌循环，该循环反弹作用在NF- K B上，而NF- K B在损伤组织各处传播生存信号的波。显著的是，已知对NF-K B的转录响应的除了促存活基因外还包括负责EMT/IG的分子。促存活和EMT/IG遗传程序的共同执行是一把双刃剑在正常组织中，这些程序导致存活和损伤后的再生；在癌细胞中，其促进恶性肿瘤的进展。MET原癌基因满足成为NF-κ B关键靶标的条件，其是调节同时具有正面和负面影响的应激并恢复型响应所需要的。如在此说明书中所显示的，一方面，IR诱导的Met过表达使得细胞能够愈合创伤单层。另ー方面，IR刺激细胞穿过基底膜，该膜是恶性肿瘤的一个典型特征。更加显著的是，有报道称IR将Met诱导的分枝化形态发生的生理过程转变为在三维基质中混乱的细胞分散。在所有的情况下，虽然在受辐射细胞中表达了ー些NF-K B标靶基因，但是本发明人指出通过MET敲除或功能抑制，Met对于生理侵袭性生长(创伤愈合)和恶性侵袭性生长(侵入)而言都是需要的。从而，报道称的辐射后肿瘤复发侵袭可能涉及在MET致癌基因严格控制下的EMT/IG程序的活化。Met參与抗-凋亡、再生和对IR的侵入响应的这ー观察具有重要的治疗意义 放射治疗与Met抑制的组合能够放射增敏(radiosensitize)癌细胞,并防止促侵入的附属效应。事实上本说明书显示在接触治疗量的IR后对Met的抑制显著损害细胞的生存和克隆形成能力。最重要的是，既然MET表达于ー些正常组织的干细胞/祖细胞，可以想象其同样表达于癌干细胞，后者通常源于正常干细胞或増殖性祖细胞的直接转化。IR诱导的Met表达和活化支持了癌(干)细胞的抗辐射和侵入能力，从而增加了其阳性选择和分散的几率。
因此，Met的抑制(通过可溶性蛋白的形式给药该Met抑制剂或通过基因疗法，即，给药如下定义的编码该Met抑制剂的载体)与常规疗法(即，放射治疗)的组合是消除癌症的进ー步策略。在本说明书中，表述“Met抑制剂”表示抗-Met单克隆抗体、其衍生物和/或片段，其能够诱导对MET基因所编码的受体的下调。在优选的实施方式中，该“Met抑制剂”是DN30抗-Met单克隆抗体、其衍生物和/或片段，其能够诱导对MET基因所编码的受体的下调。表述“抗体衍生物”表示含有抗体的互补决定区(CDR)的分子，例如含有抗体的CDR的遗传工程化的或人源化的抗体或含有抗体的CDR的多肽。表述“抗体片段”表示选自i)抗-Met单克隆抗体,和ii)含有抗-Met单克隆抗体的互补决定区(CDR)的遗传エ程化的或人源化的抗体的ド18げ1 &13、？&13’、？(&13’)2片段的片段。
从药理学观点考虑，使用Fab片段既具有优点也具有缺点。Fab分子可以很容易地使用简单表达系统(包括低等真核和原核细胞)产生(Chambers RS. Curr Opin Chem Biol20059 :46-50)。另外Fab分子相对于全抗体而言免疫原性较低，且其较低的分子量改善了组织渗透。临床上使用Fab片段的问题涉及Fab片段的低血浆半衰期，其是由于较高的肾脏清除导致的。这可以通过将Fab分子局部给药至肿瘤位点来避免。对于需要全身递送和延长治疗的治疗应用，_在増加Fab半衰期的行为是必需的。为了得到増加的Fab半衰期，已经实现了通过与稳定分子(其没有改变Fab片段的抗原结合性质)偶联而得到的Fab的稳定形式。虽然PEG 化(pegylation)是最成熟的技术(Chapman AP. Adv Drug Deliv Rev200254 :531-545.)，但是PEG化并非唯一可行的实现治疗性蛋白质的稳定性的方法。可以代替化学修饰的是，重组Fab分子可以在初级核苷酸序列水平上进行修饰以引入编码能够以高亲和性结合血清白蛋白的肽或结构域的序列(Dennis MS等人，J BiolChem 2002277 :35035-35043 ；Stork R等人，Protein Eng Des Sel 200720 :569-576)，或可以作为嵌合分子获得，其中编码Fab的一条链在框架中与编码无生物活性的蛋白的序列进行融合(例如，血清白蛋白(Subramanian GM等人,Nat Biotechnol 200725:1411-1419))。聚こニ醇、白蛋白结合区域、白蛋白，或任何其它不改变Fab片段的抗原结合性质的序列可被用作能够增加Fab片段的体内血清半衰期的稳定分子。DN30抗-cMet单克隆抗体由保藏在高等生物技术中心(Advanced BiotechnologyCenter) (ABC), Interlab Cell Line Collection(ICLC), S. S. Banca Cellule e Colturein GMP, Largo Rosanna Benzi 10, Genova,意大利、保藏号为 ICLC PD 05006 的杂交瘤细胞
系产生。适合根据本说明书来给药Met抑制剂以降低和/或去除放射治疗抗性的肿瘤包括i)癌，优选地选自膀胱癌、乳腺癌、胆管癌、结肠直肠癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巣癌、胰腺/胆嚢癌、前列腺癌、甲状腺癌；ii)软组织肉瘤，优选地选自卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、MFH/纤维肉瘤；iii)肌肉骨骼肉瘤，优选地选自骨肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；iv)血液系统恶性肿瘤，优选地选自急性骨髄性白血病、成人T细胞白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤；v)其它肿瘤，优选地选自脑肿瘤、黑色素瘤、间皮瘤、肾母细胞瘤(Wilms瘤)。所有这些肿瘤都事实上呈现出“失调的Met途径”，其中该表述意味着这些肿瘤的特征是由于至少以下ー种i)Met突变、ii)Met蛋白过表达、iii)Met基因扩增、iv)升高的循环HGF水平而导致的异常Met信号传导。Met抑制剂给药至人类患者抗-Met抗体通过类似于靶向涉及人类恶性肿瘤的其它受体酪氨酸激酶的抗体的疗程进行给药(例如，曲妥珠单抗(Trastuzumab), 一种针对HER-2的抗体)。典型地,抗体或其衍生物或片段通过静脉输液进行给药，周剂量为5-10mg/kg,优选4-8mg/kg。为了与放射治疗联合，抗-Met抗体的给药将在辐射前一周、更加优选前一天开始，并持续至 放射治疗结束后一周、优选6-48小吋。编码抗-Met抗体、或其衍生物或片段的cDNA序列也可通过“基因治疗”过程对人类患者给药。cDNA序列被克隆在病毒来源(慢病毒、逆转录病毒、腺病毒，等等)的转导载体中并组装成病毒颗粒，该病毒颗粒能够通过特异性表面结合蛋白的方式来特异性靶向肿瘤或肿瘤相关的细胞。然后在GMP等级的设备中生产病毒颗粒制剂。该制剂可以通过一次单独的注射或多次注射被递送至全身或肿瘤内。由病毒载体转导的肿瘤组织会表达由抗-Met抗体或其衍生物或片段序列所编码的蛋白，从而提供自抑制性循环。在下文中提供了实验数据；使用DN30单克隆抗体和/或其衍生物和/或片段进行试验，以对一些优选的实施方式提供细节化的描述，但其并非用于对本发明的限制。材料和方法细胞系和siRNA。细胞系(A549、MDA-MB-231、LoVo、MDAMB-435S、U-87MG、U-251、PC3、SF295、DLDI、SK-N-SH)来自于ATCC。对于ATM激酶抑制，细胞在辐射前预处理4h并随后保存于 CGK733 (10 μ M 于 DMS0)。对靶向 RELA 的 siRNA (ON-TARGET plus SMART poolL-003533-00 人 RELA， NM_021975, Dharmacon，IOOnM)、或对照 siRNA(ON-TARGET plusSMART pool, si CONTROL 非靶向性 siRNA，Dharmacon)进行瞬时转染。siRNA序列如下所述。“SMART pool L-003533-00 人 RELA NM_021975” 为 I :1:1: I 的下述双链体序列的混合物(I)正义GGAUUGAGGAGAAACGUAAUU(SEQ ID No. :1)，反义5’-NUUUCCUACAAGCUCGUGGGUU(SEQ ID No. 2),(2)正义CCCACGAGCUUGUAGGAAAUU(SEQ ID No. :3)，反义5’-NUUUCCUACAAGCUCGUGGGUU(SEQ ID No. :4)，(3)正义GGCUAUAACUCGCCUAGUGUU(SEQ ID No. :5)，反义5’-NCACUAGGCGAGUUAUAGCCUU(SEQ ID No. :6)，(4)正义CCACACAACUGAGCCCAUGUU(SEQ ID No. :7)，反义5’-NCAUGGGCUCAGUUGUGUGGUU(SEQ ID No. :8)。SMART pool, si CONTROL非靶向性siRNA (—个单个的双链体序列):正义AUGUAUUGGCCUGUAUUAG(SEQ ID No. :9)。DN30抗体和DN30Fab片段的制备DN30单克隆抗体按照Prat M.等人，1998，J. Cell Sci 111 :237-247的描述进行制备，并由高等生物技术中心进行保藏，保藏号ICLC PD05006o通过木瓜蛋白酶消化DN30和亲和纯化获得DN30Fab片段(免疫纯Fab制备试剂盒，Pierce)。DN30重链的氨基酸序列示于图8b，如SEQ ID No 10所示，DN30重链核苷酸序列示于图8a，如SEQ ID No. :11所示。对应于DN30重链⑶R区域的氨基酸序列如下所述XDR-Hl GYTFTSYff (SEQ IDNO. 12) ;CDR-H2 :INPSSGRT(SEQ ID NO. :13) ;CDR_H3 :ASRGY(SEQ ID NO. :14)。对应于DN30 重链 CDR 区域的核苷酸序列如下所述CDR-H I GGCTACACCTTCACCAGTTACTGGA (SEQ IDNO. 15) ;CDR-H2 :ATTAATCCTAGCAGCGGTCGTACT(SEQ ID NO. :16) ;CDR_H3 :GCAAGTAGG(SEQID NO. 17)。DN30轻链的氨基酸序列示于图9b，如SEQ ID No :18所示，DN30轻链核苷酸序列示于图9a，如SEQ ID No. :19所示。
对应于DN30轻链CDR区域的氨基酸序列如下所述CDR-LI QSVDYDGGSY(SEQID NO. 20) ；CDR-L2 AAS (SEQ ID NO. :21) ；CDR-L3 QQSYEDPLT (SEQ ID NO. :22)。对应于DN30轻链CDR区域的核苷酸序列如下所述CDR_L1 AAAGTGTTGATTATGATGGTGGTAGTTATAT(SEQ ID NO. :23) ；CDR-L2 GCTGCATCC (SEQ ID NO. :24) ；CDR-L3 CAGCAAAGTTATGAGGATCCGCTCACG(SEQ ID NO. :25)。体外辐射通过线性粒子加速器(Clinac 600C/D, Varian)发射X射线,在6MV下操作。Western 印迹在受辐射的血清饥饿的融汇细胞中研究蛋白表达。为了对细胞质和细胞核部分进行分级，洗涤细胞并将其在冰上“缓冲液A”(IOmM HEPES pH 7. 9UOmM KCl、O. ImM EDTA,O. 5% NP-40、lmM ニ硫苏糖醇、ImM苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂混合物)中培养lOmin。离心分离含有细胞质提取物的上清液。将沉淀重悬于“缓冲液B”(20mM HEPES pH 7.9、400mM KCl、ImM EDTA、ImM ニ硫苏糖醇、10%甘油、ImM苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂混合物)并在4°C下充分混合培养lh。高速离心澄清化得到的核溶解产物。通过SDS-PAGE将等量的蛋白进行分离，并使用以下初级抗体进行蛋白质印迹分析鼠杭-人Met (DL21，公开于 Prat 等人，Int. J. Cancer 49，323-328 (1991))、鼠抗-p65/RelA 和鼠抗-HIF-1 a (BDBiosciences)、兔抗-磷酸_Ser276和兔抗半胱天冬酶_3 (Cell Signaling),兔抗-磷酸-Chk2 (T68, R&D Systems)。分别使用山羊杭-肌动蛋白(C-ll ;Santa CruzBiotechnology)和鼠杭-核纤层蛋白B(Calbiochem)来控制等量的细胞质或细胞核蛋白的上载量。印迹图像使用分子成像仪(GelDoc XR ；Bio-Rad Laboratories)进行捕捉。使用Quantity One I-D(Bio-Rad Laboratories)进行光密度分析。蛋白质印迹为至少三个独立实验获得的代表性結果。Northern 印迹将融汇细胞血清饥饿48h并辐射。将全RNA用0. 8%琼脂糖-甲醛凝胶分离，并按照标准流程转移至尼龙膜(Amersham)。通过pCEV-MET质粒(參见Michieli等人,Oncogene18,5221-5231 (1999))获得含有全编码序列(GenBank登录号J02958)的MET探针，并用[a-32P]dCTP(Megaprime,Amersham)进行标记。42°C下在 50% 甲酸胺中杂交 16h。在 42°C下将尼龙膜用2X SSC-0. 1% SDS洗涤两次，用0. IX SSC-0. 1% SDS洗涤两次，并进行自显影。ROS 检测根据生产商的说明书使用5_(和6)_羧基-2’ _7’ - ニ氯荧光素こ酰こ酸盐(羧基-H2DCFDA, Molecular Probes)评价胞内ROS的生成。简而言之，处理前24h将细胞接种于黑色96孔板(3x IO4个细胞/孔)(IR:10Gy ;H202 :100 μΜ作为对照)。37°C下，细胞在不含酚红的DMEM中、羧基-H2DCFDA(IOyM)存在下培养lh。洗涤细胞，在不含酚红和羧基-H2DCFDA的DMEM中另外培养30分钟，井随后进行辐射。辐射后15min使用荧光分析仪检测 ROS 的生成(λ ex = 485nm, λ em = 535nm) (DTX 880 Multimode Detector)。染色质免疫沉淀(ChIP)使用4x IO7个细胞进行10次ChIP，其或者为受辐射的，或者为对照细胞。辐射后(IOGy)，室温下将细胞用I %甲醛固定15min，用甘氨酸(O. 125M)终止反应。洗涤固定的细胞，在冰冻的补充有蛋白酶抑制剂混合物的PBS中收集细胞并离心。按上述提取细胞质级 分并弃除，沉淀胞核并重悬于Iml的SDS-溶解缓冲液(1% SDS, ImM EDTA, 50mM Tris-HClpH 8，和蛋白酶抑制剂混合物)。然后超声破碎胞核，得到大小为400-1000bp的DNA片段。4°C下14，000rpm离心IOmin澄清化细胞碎片。用稀释缓冲液10X(0. 01%SDS，1. I % TritonX-100,1. 2mM EDTA, 16. 7mM Tris-HCl pH 8,167mM NaCl)稀释含有染色质制剂的上清液。然后在4°C加入蛋白G-琼脂糖(Amersham,补充有0. 2mg/ml的鲑精DNA的50%凝胶楽;，0. 1% BSA和0. 05% NaN3)预澄清化染色质lh。4°C下4000rpm快速离心沉降珠粒，收集上清液。使用3%的染色质制剂作为ChIP标准化的输入。4°C下用4μ g抗体(抗-p65/RelA，Santa Cruz ;全鼠IgG, Chemicon)过夜进行ChIP,然后用50 μ I蛋白G-琼脂糖珠培养3h。将珠粒在4°C下的旋转台上依次用以下溶液洗涤(lOmin/毎次)两次低盐缓冲液(0.1%SDS, I % Triton X-100,2mM EDTA, 20mM Tris-HCl pH 8,150mM NaCl)，两次高盐缓冲液(0. 1% SDS, 1% Triton X_100，2mM EDTA, 20mM Tris-HClpH 8,500mM NaCl)，一次 LiCl 缓冲液(0. 25M LiCl，I %脱氧胆酸，0. 5% NP-40，ImM EDTA, IOmM Tris-HCl pH 8)，以及两次TEdOmMTris-HCl pH 8, ImM EDTA)。用 EB(1% SDS,0. IM NaHCO3)洗提 ChIP 两次并在 65°C放置过夜来逆转甲醛交联。使用RNase(50y g/ml，37°C 30min)和蛋白酶_Κ(500 μ g/ml，45°C 2h)进行处理。对每个样品进行酚/氯仿萃取的纯化，并最终悬浮于40 μ I无菌水中。使用各样品2μ I作为模板用于在ABI PRISM 7900ΗΤ序列检测系统(Applied Biosystems)上使用 SYBR GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems)进行的 Real-Time PCR。使用以下引物-NFKBIA (正向GAACCCCAGCTCAGGGTTTAG-SEQ ID No. 26 ；反向GGGAATTTCCAAGCCAGTCA-SEQ ID No. 27)；- K BI (正向AGGCCCAGTGCCTTATTACCA-SEQ ID No. 28 ；反向GCGGCCTGACTGGAGATTT-SEQ ID No. 29)；-κΒ2(正向GGGACTCAGTTTCTTTACCTGCAA-SEQ ID No. 30 ；反向GGGACTCAGTTTCTTTACCTGCAA-SEQ ID No. 31)。创伤愈合分析在24孔板上将细胞生长至融汇状态，饥饿24hr，并用塑料头进行划刻。使用含有I % FBS的新鲜培养基和仅载体(DMSO)来更换培养基，并立即辐射。24h后，细胞用11%戊ニ醒(Sigma)固定,并用结晶紫染色。用连接反向光学显微镜(DM IRB, Leica)的Leica照相机(Leica DFC320, Leica)获得图像。图像为至少三个独立实验获得的代表性結果。小室分析在Transwell 小室(BD Falcon)中检测细胞侵袭。在包被有20 μ g/cm2重组 Matrigel 基底膜(Collaborative Research)的过滤器上部接种 MDA-MB-231 和MDA-MB-435S细胞(5xl05/小室)。在包被有50 μ g/cm2的过滤器上接种U-251 (104/小室)。在两个小室中添加补充有1% FBS的培养基。接种后lh，辐射细胞(IOGy)，并在37°C培养24h。过滤器上部的细胞进行机械移除，迁移至较低部位的细胞按上述进行固定、染色和拍照。为了对细胞侵袭进行定量，对每个实验条件随机选择10个区域，并用IOX的物镜按上述进行显微观察。使用MetaM0rph7. I软件进行形态分析。图像为至少三个独立实验的代表性结果。分枝化形态发生分析 通过将单细胞重悬于240mg/ml甲基纤维素(Sigma)并在不粘连的96孔板(Greiner)上培养24h形成MDA-MB-435S球体。将球体转移至含有I. 3mg/ml来自鼠尾的I型胶原蛋白(BD Biosciences)、10% FBS和240mg/ml甲基纤维素的基质中。24h后,福射细胞和/或在HGF存在下培养7天。HGF获得自SF9细胞中的杆状病毒重组蛋白。使用来自未感染细胞的条件培养基作为阴性对照。图像为三个独立实验获得的代表性結果。用DN30Fab进行细胞存活分析 将IO3个细胞接种在96孔板上生长24h。用含有I % FBS和DN30Fab (28 μ g/ml)的培养基或仅含载体(PBS)来更换培养基。24h后，辐射细胞(IOGy)。细胞存活率按上述进行分析。IR诱导MET转录本发明人之前已经显示MET原癌基因被细胞外和细胞内的特异性信号所转录调控，这些信号包括生长因子和氧感知器(oxygen sensor)。在此研究了接触治疗剂量(高至IOGy)的IR下的Met表达的调控。在源于不同组织类型的肿瘤组织的十个细胞系中(乳腺癌、肺癌、前列腺癌和结肠癌；黑色素瘤；成胶质细胞瘤；成神经细胞瘤)，发现Met蛋白水平在辐射后24h显著增カロ。在代表性的细胞系中(例如MDA-MB-435S和MDA-MB-231)中，细化的时间进程实验显示了 Met蛋白聚积的双向性。其特征为l_2h左右的Met诱导的早期峰( 5倍)，然后是相似的晩期峰或平台，其发生在6h，并在辐射后24h下降(图Ia)。剂量响应实验显示Met诱导在IGy后开始，并在5Gy达到平台(图Ib)。在受辐射的细胞中还观察到MET mRNA的聚积和全长MET启动子的活化(图lc-d)，表明IR诱导的MET过表达涉及转录机理。有趣的是，在MDA-MB-231中还检测到短暂和不依赖配体的Met自磷酸化，其发生在接触IR后IOmin内(图6)。IR诱导的Met磷酸化的强度与那些由非饱和浓度(50ng/ml)的HGF所诱导的相当。然而，磷酸化的动力学不同，因为IR诱导的峰值在IOmin后达到，而HGF诱导的峰值在30min后达到。同时进行IR和HGF刺激没有协同效应(图6)。IR诱导的MET转录需要NF-K B已知IR会调控ー些转录因子，包括NF-K B。因此，基因组表达谱显示，在检测的细胞系中，IR显著诱导早期NF-κ B响应。例如，在MDA-MB-231中，辐射后Ih所调控的33基因中的9个是NF-κ B的标靶，其表现出比预期高 20倍的频率。另外，在MDA-MB-231、MDA-MB-435S或U-251细胞的时间进程实验中，IR(IOGy)诱导了迅速(30min内)和持续(至24h)的NF- K B亚基p65/RelA的核聚积，这是NF- κ B活化的标志(图2a)。另外，在辐射后的早期时间点，核p65/RelA的Ser276被短暂磷酸化(图2a)。该磷酸化已知被活性氧物质(ROS)经过蛋白激酶A所诱导，并促进p65/RelA与转录共活化剂CBP/p300之间的相互作用，其是上调一系列的早期靶基因所必须的。这些数据表明IR通过p65/RelA亚基的核聚积和早期短暂磷酸化促进NF- κ B功能活化。在人MET启动子中，对于两处推测的NF- κ B结合位点κ BI，位于相对于序列(GenBank登录号AF046925)的转录起始位点的-1349/_1340bp ；和κ Β2,位于-1149/-1136bp,通过计算机(in silico)分析进行了鉴定。有趣的是，κ B2位点在小鼠met启动子中高度保守(图7 ;小鼠met (小家鼠)启动子序列，如SEQ ID No 32所 示，和人met (人类)启动子序列，如SEQ ID No. :33所示)。染色质免疫沉淀实验显示在接触IOGy的细胞中p65/RelA与任一位点的结合都显著增加(图2b)，表明MET在受辐射细胞中受NF- κ B转录控制。这些发现提示本发明人去研究是否NF- κ B对于MET的IR诱导而言是必需的。由于p65/RelA參与几个NF-κ B异ニ聚体每ー个的形成，从而对于整个NF- κ B-驱动的转录活性都很重要，因此通过RNA干扰终止了 p65/RelA的表达。在用针对p65/RelA 的 siRNA (SMART pool L-003533-00 人 RELA，SEQ ID No. :1_8)处理的 MDA-MB-231或MDA-MB-435S中，IR不再能诱导全长MET启动子活性(图2c)或者Met蛋白的聚积。总而言之，这些数据提供了令人信服的证据显示IR诱导的MET上调需要转录因子NF-κ B的活化。还考虑了 IR诱导的MET转录中涉及的低氧可诱导因子-1 (HIF-I)，因为(a)HIF_l被证明是在受辐射细胞中由ROS的形成而受到激活，和(b)HIF-l是显著的MET表达调控齐U。然而，HIF-I的相关性很低，如补充方法所显示。首先，在MDA-MB-231和MDA-MB-435S中，IR没有诱导HIF-Ia亚基的核易位(其是HIF-I活化的标志)，其在当细胞培养于低氧浓度下可以观察到(图2a)。在受辐射细胞中缺少HIF-I活化并非因为ROS生产变弱，因为ROS在接触IOGy下15min后平均增加了 25±3. 5%。根据之前对接触I-IOGy的细胞系的观察，推測其与辐射后2-5min平均80%的ROS诱导有夫。此外，已发现IR不能激活包括两个功能性低氧响应元件(HRE)的所谓的“最小”MET启动子，和负责低氧诱导的MET上调的Ap-I位点。总而言之，这些数据显示HIF-I不參与IR导致的MET上调。然而，观察到低氧诱导了 p65/RelA的核易位和丝氨酸的磷酸化(图2a)。最后，也排除了主要的IR-标靶一转录因子p53的參与的可能性。事实上，MDA-MB-435S和MDA-MB-231 (表现出最高IR诱导MET的两种细胞系)带有p53失活突变(分别为G266E和R280K)。此外，与鼠启动子不同，人MET启动子不被p53的结构性活化状态所上调。IR诱导的MET表达由ATM激酶活化介导NF- κ B是ー些同时由胞外和胞内信号启动的途径的交叉点。胞内信号包括由蛋白激酶ATM在检测到DNA损伤后诱发的那些(信号)。为了考察IR诱导的MET是否依赖ATM激酶的活化，对MDA-MB-435S或MDA-MB-231用10 μ M的特异性小分子抑制剂CGK733进行了处理。在时间进程实验中，CGK733防止了 IR诱导的特异性ATM底物Chk2磷酸化，以及p65/RelA核易位，和Met蛋白过表达。这些数据显示ATM激酶对IR诱导的MET上调是必需的(图3)。IR诱导的侵袭性生长需要MetMet过表达并不意味着在不存在胞外配体HGF下的激酶活化。然而，其引起配体依赖的信号传导活性的显著增加(即，敏化作用)。这已经在低氧上调Met表达至与辐射诱导相当或较低水平的细胞中被观察到。本发明人从而考察了 IR诱导的Met过表达是否能诱发或增强Met依赖的生物响应。这包括侵袭性生长的生理和病理方面。在评价细胞再生受伤组织(即，生理侵袭性生
长)的伤ロ愈合分析中，受辐射的MDA-MB-231和MDA-MB-435S均自发性地通过从伤ロ边缘解离并在受损区域迁移而表现出愈合程序。经24h监测，该响应与由HGF刺激引起的响应相重叠，HGF也被称为“分散因子”，因其促进细胞解离和移动。然而，IR引发的愈合响应并非因为HGF自分泌循环的诱导，因为经定量PCR測定，受辐射细胞没有表达HGF。本发明人推断IR诱导的Met过表达使得细胞对于存在于补充有I %血清的培养基中的少量HGF敏感。该条件可能模拟了 HGF在体内的生理存在，其在胞外基质中到处存在。然后对受辐射细胞进行了小室分析，检测其体外侵入人工基底膜的能力，其与体内侵入(即恶性侵袭性生长)密切关联。事实上，受辐射细胞(例如MDA-MB-231、MDA-MB-435S或U-251)在低血清浓度(1% )下自发性跨越了小室基底膜(图4a)，再一次模拟了由HGF引发的行为。IR将Met诱导的形态发生变为侵入过程分枝化形态发生是ー个复杂的生理过程，其由HGF诱导从而在发育过程中产生三维的器官。该多步骤程序需要包括细胞迁移、増殖和空间重组，最終产生由极化细胞填充的中空分支细管。ー些研究的细胞系(例如MDA-MB-435S)可完整进行体外分枝化形态发生程序。接触IR使得这些细胞对于次优浓度(5nM)的外源性HGF敏感，该浓度独自无法诱导分枝化形态发生(图4b)。重要的是，HGF刺激的受辐射细胞构建了结构显著改变的细管，因为细胞从腔外表面解离并传播至周围基质中(图4b)。该表现令人联想到被描述为响应TNF α时发生的异常形态发生形式的“三维分散(tridimensional scatter)”。结论是治疗剂量的IR可能将生理分枝化形态发生改变为异常的促侵入过程。对Met的抑制使得细胞对IR诱导的凋亡和增殖捕获敏感作为EMT/IG程序的一部分，Met通过包括P13-激酶/AKT在内的下游途径的持续活化发出強烈的杭-凋亡信号。本发明人从而推论，MET上调能够预防辐射诱导的细胞死亡，而相反的，对Met的抑制能够增强放射治疗的功效。在DN30抗-Met抗体Fab片段存在下保存的受辐射细胞中观察到细胞存活率降低(高达75% )，所述抗体已知能够诱导MET的下调，并从而抑制MET的信号传导和生物活性(Petrelli 等人，PNAS 103 :5090-5,2006)(图 5)。这些结果表明Met抑制活性通过在治疗后增加细胞死亡和降低重新増殖的能力而使得细胞对放射治疗敏感。自然，虽然本发明的原则保持不变，但是其构建和实施方式的细节可以根据仅通过实施例的方式进行描述和阐明的内容进行广泛的变化，而不会偏离本发明的范围。
权利要求
1.用于治疗肿瘤患者的Met抑制剂，所述Met抑制剂选自 i)抗-Met单克隆抗体， )含有该抗-Met单克隆抗体的互补决定区(CDR)的遗传工程化的抗体，和iii)含有该抗-Met单克隆抗体的互补决定区(CDR)的(i)或(ii)的片段，或其组合，其中所述Met抑制剂能够诱导对MET基因所编码的受体的下调和降低和/或去除患者对放射治疗的抗性。
2.用于治疗肿瘤患者的编码Met抑制剂的核苷酸序列，所述Met抑制剂选自 i)抗-Met单克隆抗体， )含有该抗-Met单克隆抗体的互补决定区(CDR)的遗传工程化的抗体，和 iii)含有该抗-Met单克隆抗体的互补决定区(CDR)的(i)或(ii)的片段， 其中所述Met抑制剂能够诱导对MET基因所编码的受体的下调和降低和/或去除患者对放射治疗的抗性。
3.根据权利要求I或权利要求2的Met抑制剂或编码Met抑制剂的核苷酸序列，其中所述Met抑制剂选自 i)DN30抗-Met单克隆抗体， ii)含有DN30抗-Met单克隆抗体的互补决定区(CDR)的遗传工程化的抗体，所述CDR具有如SEQ ID NO. :12-14和20-22所示的氨基酸序列，和 iii)含有DN30抗-Met单克隆抗体的互补决定区(CDR)的(i)或(ii)的片段，所述⑶R具有如SEQ ID NO. :12-14和20-22所示的氨基酸序列，或其组合， 其中所述DN30抗-Met单克隆抗体是由杂交瘤细胞系ICLC PD05006严生的。
4.根据权利要求I或权利要求3的Met抑制剂，其中所述Met抑制剂用于以可溶性蛋白的形式通过注射或输液来进行给药。
5.根据权利要求2或权利要求3的所述编码Met抑制剂的核苷酸序列，其中所述编码所述Met抑制剂的核苷酸序列用于通过载体的方式来进行给药，其中所述载体颗粒的形式。
6.根据权利要求5的所述编码Met抑制剂的核苷酸序列，其中所述载体适于靶向肿瘤或肿瘤相关的细胞。
7.根据权利要求5或权利要求6的所述编码Met抑制剂的核苷酸序列，其中所述载体用于进行全身性或肿瘤内给药，优选经注射给药。
8.根据前述任ー权利要求的Met抑制剂或编码Met抑制剂的核苷酸序列，其中所述片段是Fab片段，优选是含有至少ー种稳定分子的Fab片段。
9.根据权利要求8的Met抑制剂或编码Met抑制剂的核苷酸序列，其中所述至少ー种稳定分子选自聚こニ醇、白蛋白结合域、白蛋白。
10.根据前述任ー权利要求的Met抑制剂或编码Met抑制剂的核苷酸序列，其中所述Met抑制剂和/或所述编码所述Met抑制剂的核苷酸序列用于在对所述患者进行放射治疗前至少一周进行给药。
11.根据前述任ー权利要求的Met抑制剂或编码Met抑制剂的核苷酸序列，其中所述Met抑制剂和/或所述编码所述Met抑制剂的核苷酸序列用于在对所述患者进行放射治疗前至少一天进行给药。
12.根据前述任ー权利要求的Met抑制剂或编码Met抑制剂的核苷酸序列，其中所述Met抑制剂和/或所述编码所述Met抑制剂的核苷酸序列进行给药直到放射治疗结束后至少一周、优选6_48小时。
13.根据前述任ー权利要求的Met抑制剂或编码Met抑制剂的核苷酸序列，其中所述肿瘤选自癌、骨骼肌肉肉瘤、软组织肉瘤、造血系统恶性肿瘤、脑肿瘤、黑色素瘤、间皮瘤、肾母细胞瘤。
全文摘要
本发明涉及用于增强放射治疗功效的MET抑制剂。本发明涉及用于在癌症患者治疗中减轻和/或去除患者对放射治疗抗性的Met抑制剂和/或编码Met抑制剂的核苷酸序列，其中该Met抑制剂选自i)抗-Met单克隆抗体，ii)含有该抗-Met单克隆抗体的互补决定区(CDR)的遗传工程化的抗体，和iii)含有该抗-Met单克隆抗体的互补决定区(CDR)的(i)或(ii)的片段，或其组合。
文档编号A61P35/00GK102688491SQ20121008036
公开日2012年9月26日 申请日期2012年3月16日 优先权日2011年3月18日
发明者C·伯卡希奥, F·佩特隆泽利, P·M·科蒙利奥, R·德桑蒂斯 申请人:梅思尔斯平移研究有限公司