专利名称：基于穿膜肽的口服复合纳米载体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体的说是利用穿膜肽和固体脂质纳米粒构建一种新型口服复合纳米载体。此复合纳米载体的特征在于利用固体脂质纳米粒在胃肠道内特殊的吸收途径和穿膜肽的促吸收作用，有效解决口服难吸收药物的吸收问题，提高药物的口服生物利用度。
背景技术：
穿膜肽(cell-permeable peptides, CPPs)是一类具有较强细胞膜穿透能力的多肽，它们具有高效穿过细胞膜而不损伤细胞膜结构和功能的特点。多数研究证明穿膜肽在常规的用量范围内基本没有毒性。穿膜肽可以促进多肽、蛋白质等难吸收药物在鼻腔粘膜、肠道粘膜、肺部给药、皮肤给药的吸收，从而使很多药物和治疗方法重获新生。有研究证明， 采用长链脂肪酸对水溶性穿膜肽进行修饰，可以增加穿膜肽的两亲性，从而使其更容易插入到磷脂双分子层中。此外，修饰后的穿膜肽细胞摄取能力会明显增强。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)系指以生物相容的高熔点脂质为骨架材料制成的纳米球。SLN作为药物传递系统载体，与常见的药物载体相比具有生物相容性好、可生物降解、载药能力强、物理化学存储稳定、对靶器官有特异趋向性、成本低和利于大规模生产等优点，是一种具有发展前景的新型给药系统。研究表明，固体脂质纳米粒作为口服药用载体，可以在一定程度上改善难吸收药物的口服吸收，但其主要经Peyer结上的M细胞或胞饮作用转运，吸收较为有限。常见的吸收促进剂连续使用会给粘膜造成直接损伤，使其临床使用时受到了限制。因此急需开发一种既能有效的促进纳米粒的口服吸收，又对胃肠道粘膜及其人体的生理功能造成最小伤害的口服纳米粒载体。
发明内容
本发明目的旨在提供一种脂质穿膜肽修饰固体脂质纳米粒的新型口服复合纳米载体及其制备方法和用途。所述的复合纳米载体，其特征在于它含有难吸收药物、固体脂质材料、稳定剂和脂质穿膜肽。所述的复合纳米载体，其特征在于按质量比它含有0. I 30%的难吸收药物，10 98%的固体脂质材料，0. I 60%的稳定剂，0. 01 25%的脂质穿膜肽，0 20%抗氧化剂，0 95%冻干支撑剂，0 95%的水。所述的复合纳米载体，其特征在于所述的难吸收药物包括下列的一种或多种紫杉醇、多烯紫杉醇、多柔比星、表柔比星、长春新碱、9-羟基喜树碱、藤黄酸。所述的复合纳米载体，其特征在于所述的固体脂质材料选自各种长链脂肪酸以及脂肪酸的甘油酯的一种或多种。所述的复合纳米载体，其特征在于所述的稳定剂是磷脂和(或)表面活性剂，磷脂选自天然磷脂、半合成磷脂和全合成磷脂的一种或多种，表明活性剂选自泊洛沙姆188和吐温80的一种或两种。所述的复合纳米载体,其特征在于所述的脂质穿膜肽为精氨酸(Arginine, R)的直链聚合物Rn(n = 5 16)，它们的N端被脂肪酸修饰，脂肪酸优选碳链为8 20碳原子的，更优选的硬脂酸(Stearic Acid, SA)。所述的复合纳米载体，其特征在于可以制备难吸收药物的口服药物制剂。有益成果当制备的复合纳米载体口服后，首先带正电荷的纳米粒可以吸附带带负电的胃肠道表面，增加纳米粒的局部浓度，其次脂质穿膜肽可以抑制P-糖蛋白的外排作用，从而促进纳米粒口服吸收，提高药物口服生物利用度。
图I为市售制剂(Taxol)大鼠口服给药后的血药浓度-时间曲线(n = 6)。 图2为紫杉醇固体脂质纳米粒(PTX-SLN)大鼠口服给药后的血药浓度-时间曲线(n = 6)。图3为SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳米粒(SA-R8-PTX-SLN)大鼠口服给药后的血药浓度-时间曲线(n = 6)。以下通过非限定性实施例进一步详细说明本发明，本发明的保护范围，不局限于此。
具体实施例方式下列实施例中R为精氨酸，SA为硬脂酸实施例I :穿膜肽修饰9-羟基喜树碱固体脂质纳米粒(I)穿膜肽的合成采用固相合成法合成SA-R9，具体过程如下在50ml侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入Ig Rinkamide-MBHA树脂(0. 74mmol. g—1)，加20mL DMF溶胀lOmin，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20 % U啶/DMF溶液，搅拌30min，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入I. 44g(2. 22mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 为 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃 ~5~ 磺酰基)、0.46g(2. 22mmol) 二环己基碳二亚胺和0. 30g(2. 22mmol) HOBt (I-羟基苯并三唑)和20mlDMF,室温搅拌进行缩合反应。反应2h后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤,用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸己联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，重复上面操作，即从用20%哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的a-氨基都用 Fmoc 保护，氨基酸依次为Fmoc_Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH,Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH,Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH。最后树脂用甲醇洗第三次,真空干燥。将上述已接肽的树脂加入到50ml圆底烧瓶中，加入15mL试剂K (TFA/苯甲硫醚/EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (v/v))，室温下搅拌3h。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱过夜。离心，除去乙醚，真空干燥，得到SA-RRRRRRRRR粗肽。将IOOmg上述的SA-RRRRRRRRR粗肽溶于2ml纯水中，用制备用反相HPLC纯化，收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得SA-RRRRRRRRR纯肽。质谱分析表明，其分子量为1699，与理论值相符。最终得N端被硬脂酸修饰的RRRRRRRRR(SA-R9)。(2)固体脂质纳米粒制备精密称取15mg 9-轻基喜树碱、200mg山箭酸甘油酯、IOOmg卵磷脂置于500mL爺型瓶，加入一定量氯仿振摇溶解，真空旋蒸除去氯仿形成含药薄膜，抽真空过夜除去痕量有机溶剂；称取50mg泊洛沙姆188至IOmL蒸馏水中形成水相；将水相加入到茄型瓶中水化成均勻乳池液，探头超声，得到9-轻基喜树碱固体脂质纳米粒粗品，离心(2000rpm, IOmin)除去少量金属屑，过0. 8 y m滤膜三次，整粒，得9-羟基喜树碱固体脂质纳米粒分散液。精确移取5mL 9_羟基喜树碱固体脂质纳米粒分散液，加入7. 5mg SA-R9，磁力搅拌过夜(4°C，12h)，得到脂质穿膜肽SA-R9和9-羟基喜树碱固体脂质纳米粒的复合纳米载体。该复合纳米载体的平均粒径为168. 3nm,多分散系数PDI为0. 174，zeta电位为21. 5mV,·9-羟基喜树碱的包封率为93. 74%。以5%蔗糖为冻干保护剂，将上述复合纳米载体制备成冻干粉保存，使用时用蒸馏水复溶使用。实施例2 :穿膜肽修饰紫杉醇固体脂质纳米粒(I)穿膜肽的合成采用固相合成法合成SA-R8,具体过程如下在50ml侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入Ig Rinkamide-MBHA树脂(0. ，加20mL DMF溶胀lOmin，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20 % U啶/DMF溶液，搅拌30min，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入I. 44g(2. 22mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 为 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、0.46g(2. 22mmol) 二环己基碳二亚胺和0. 30g(2. 22mmol) HOBt (I-羟基苯并三唑)和20mlDMF,室温搅拌进行缩合反应。反应2h后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤,用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸己联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，重复上面操作，即从用20%哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的a-氨基都用 Fmoc 保护，氨基酸依次为Fmoc_Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH,Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH,Fmoc-Arg (Pbf)-OH。最后树脂用甲醇洗第三次，真空干燥。将上述已接肽的树脂加入到50ml圆底烧瓶中，加入15mL试剂K (TFA/苯甲硫醚/EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (v/v))，室温下搅拌3h。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱过夜。离心，除去乙醚，真空干燥，得到SA-RRRRRRRR粗肽。将IOOmg上述的SA-RRRRRRRR粗肽溶于2ml纯水中，用制备用反相HPLC纯化，收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得SA-RRRRRRR纯肽。质谱分析表明，其分子量为1543，与理论值相符。最终得N端被硬脂酸修饰的RRRRRRRR(SA-R8)。
(2)固体脂质纳米粒制备精密称取IOmg紫杉醇、225mg单硬脂酸甘油酯、225mg大豆磷脂置于500mL茄型瓶，加入一定量氯仿振摇溶解,真空旋蒸除去氯仿形成含药薄膜,抽真空过夜除去痕量有机溶剂；称取IOOmg泊洛沙姆188和IOOmg吐温80至IOmL蒸馏水中形成水相；将水相加入到茄型瓶中水化成均匀乳浊液，探头超声，得到紫杉醇固体脂质纳米粒粗品，离心(2000rpm，IOmin)除去少量金属屑，过0. 8 ii m滤膜三次,整粒,得紫杉醇固体脂质纳米粒分散液。精确移取5mL紫杉醇固体脂质纳米粒分散液，加入IOmg SA-R8,磁力搅拌过夜，得到脂质穿膜肽SA-R8和紫杉醇固体脂质纳米粒的复合纳米载体。该复合纳米载体的平均粒径为217. lnm，多分散系数I3DI为0. 280, zeta电位为34. 3mV，紫杉醇的包封率为91. 70%。以10%蔗糖为冻干保护剂，将上述复合纳米载体制备成冻干粉保存，使用时用蒸馏水复溶使用。(3)大鼠药动学实验18只SD雄性大鼠，体重(200 ±20) g，随机分为三组，作为受试动物。服药前禁食12小时，自由饮水。给药方案其中参比制剂为市售制剂(Taxol)，受试制剂为自制的紫杉醇固体脂质纳米粒(PTX-SLN)和SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳米粒(SA-R8-PTX-SLN), 口服给药(20mg/kg)。市售制剂(Taxol)、紫杉醇固体脂质纳米粒和SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳米粒口服给药后分别于 0. 25,0. 5,0. 75、l、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48h，眼底取血 0. 4mL置肝素抗凝塑料离心管中，6000rpm离心IOmin,取0. 15mL上层血衆,备用。市售制剂(Taxol)大鼠口服给药后的血药浓度_时间曲线见图I。紫杉醇固体脂质纳米粒(PTX-SLN)大鼠口服给药后的血药浓度-时间曲线见图2。SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳米粒(SA-R8-PTX-SLN)大鼠口服给药后的血药浓度-时间曲线见图3。由图I、图2和图3可见，市售制剂(Taxol)和紫杉醇固体脂质纳米粒口服给药后，分别在4h和12h后血药浓度已在检测限以下，SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳米粒在36h仍在检测限以上。表ITaxol、PTX-SLN 和 SA-R8-PTX-SLN 的大鼠口服药动学参数(n = 6)
ParameterUnitTaxolPTX-SLNSA-R8-PTX-SLN
^tg mL'10.74士0.200.73±0.041.42士0.22*
Tmaxh1.33 士0.580.92±0.140.83士 0.14
AUQm Hg h mL11.32±0.214.43±0.35*12.76士2.75*
AUCo-CO HghmL'11.47±0.174.84±0.22*17.08士 6.68*
MRTh2.26±0.325.89±0.48*25.82±12.37*
CLmLh"12743.1±312.4 827.07±39.02*229.73±132.53*注*P< 0. 05，与 Taxol 比较。采用非房室模型计算市售制剂(Taxol)、紫杉醇固体脂质纳米粒和SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳米粒大鼠口服给药后的药动学参数，结果见表I。根据市售制剂(Taxol)、紫杉醇固体脂质纳米粒和SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳米粒大鼠口服给药后血药浓度-时间曲线下面积(AUCVt)，以市售制剂(Taxol)为参比，计算紫杉醇固体脂质纳米粒(PTX-SLN)和SA-R8修 饰紫杉醇固体脂质纳米粒(SA-R8-PTX-SLN)的相对生物利用度，PTX-SLN和SA-R8-PTX-SLN的相对生物利用度分别提高了 2. 35倍和8. 67倍。
权利要求
1.一种新型的口服复合纳米载体，其特征在于它含有难吸收药物、固体脂质材料、稳定剂和脂质穿膜肽。
2.根据权利要求I所述的复合纳米载体，其特征在于按质量比它含有0.I 30%的难吸收药物，10 98%的固体脂质材料，0. I 60%的稳定剂，0. 01 25%的脂质穿膜肽，0 20%抗氧化剂，0 95%冻干支撑剂，0 95%的水。
3.根据权利要求I和权利要求2所述的复合纳米载体，其特征在于所述的难吸收药物包括下列的一种或多种紫杉醇、多烯紫杉醇、多柔比星、表柔比星、长春新碱、9-羟基喜树碱、藤黄酸。
4.根据权利要求I和权利要求2所述的复合纳米载体，其特征在于所述的固体脂质材料选自各种长链脂肪酸以及脂肪酸的甘油酯的一种或多种。
5.根据权利要求I和权利要求2所述的复合纳米载体，其特征在于所述的稳定剂是磷脂和(或)表面活性剂，磷脂选自天然磷脂、半合成磷脂和全合成磷脂的一种或多种，表明活性剂选自泊洛沙姆188和吐温80的一种或两种。
6.根据权利要求I和权利要求2所述的复合纳米载体，其特征在于所述的脂质穿膜肽为精氨酸(Arginine, R)的直链聚合物Rn(n = 5 16),它们的N端被脂肪酸修饰,脂肪酸优选碳链为8 20碳原子的,更优选的硬脂酸(StearicAcid, SA)。
7.根据权利要求I和权利要求2所述的复合纳米载体，其特征在于可以制备难吸收药物的口服药物制剂。
全文摘要
本发明公开了一种脂质穿膜肽和固体脂质纳米粒构建的新型口服复合纳米载体及其制备方法和用途。通过薄膜分散-超声法制备载药的固体脂质纳米粒，然后采用穿膜肽和载药固体脂质纳米粒共孵育的方法，构建的新型口服复合纳米载体。所述的复合纳米载体利用固体脂质纳米粒的在胃肠道内特殊的吸收途径和穿膜肽的促吸收作用，有效解决口服难吸收药物的吸收问题，提高药物的口服生物利用度。
文档编号A61K9/14GK102743338SQ20121014110
公开日2012年10月24日 申请日期2012年5月9日 优先权日2012年5月9日
发明者吕慧侠, 周建平, 姜天玥, 孙博, 张振海, 张银龙 申请人:中国药科大学