专利名称：一种制备半乳糖基壳聚糖/5-氟尿嘧啶纳米粒的方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向于肝脏的药物的制备方法，尤其涉及一种用于治疗肝癌的靶向药物的制备方法。
背景技术：
肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，目前肝癌的首选治疗是肝移植，但价格昂贵，供体短缺，导致大多数患者在等待供肝过程中死亡。化疗是治疗肿瘤的又一主要手段，但是现有抗癌药物，生物利用率低，在杀伤肝癌细胞的同时，对正常细胞也有较大毒副作用，并严重抑制机体免疫系统，导致患者常死于化疗药物的并发症，因此，治疗过程中，患者普遍有明显的恶心呕吐等副作用，给患者带来不适感。 5-氟尿嘧啶(5-FU，又称氟尿嘧啶)属细胞周期特异性药物，它在体内可转变为氟尿嘧啶脱氧核苷酸，并与胸腺嘧啶核苷合成酶特异结合，起到干扰RNA、DNA及蛋白质生物合成的作用，因此，5-FU具有抗瘤谱广，疗效显著等特点，临床上主要用于肝癌，胃癌、胰腺癌、乳腺癌等的治疗。如专利CN100337631C公开的氟尿嘧啶注射乳剂、CN1957922A公开的载有5-FU和增效剂的缓释注射剂、专利CN1666747A公开的含5-FU的果糖注射液、以及专利CN1318430C公开的三(5-氟尿嘧啶)稀土配合物，均可用于治疗肝癌，并取得了较好的疗效。然而，由于肿瘤组织与正常组织之间核酸合成代谢的拮抗作用差异无统计学意义，导致5-FU的特异选择性小，对增殖快的正常组织也有影响，较常见的有骨髓抑制及胃肠道反应等毒副作用。同时，5-FU还具有体内代谢快、有效期短的弱点，需要大剂量长时间静脉滴注给药来达到体内的有效浓度及作用维持时间。另外，5-FU的吸收不规则，若体内浓度过高时会发生毒副反应，给病人带来很大痛苦。这些缺陷使得5-FU在临床应用上受到较大限制。1906年Ehrilich首先提出靶向给药的概念，后来发展为靶向给药系统和靶向治疗。肝癌的靶向治疗，主要通过两种机制可以实现肝癌药物的靶向传输被动靶向和主动靶向。被动靶向是通过对纳米载体的理化性质(大小、形状、亲水性、表面电荷和囊壁孔径等)，进行控制和修饰，可调控其在体内的分布和药物释放特性，或选用对机体各种组织和病变亲和力不同，使纳米粒达到靶向运输目的[3]。主动靶向是将配体、结合位点或抗体等特异性的靶向分子偶联至纳米粒子表面而使药物定向分布到靶组织。随着生物医药与纳米技术相互融合集成，诞生了纳米生物医药技术。其中靶向纳米药物载体技术由于其特异性强、效果显著，避免了对正常组织的损伤，同时保护药物不被降解，为人类提高现有肝癌治疗药物的临床疗效和生物利用度，降低毒副作用提供了理想的解决方案
发明内容
本发明提供了一种制备具有肝脏靶向性的、治疗肝癌的药物的方法，即制备半乳糖基壳聚糖/5-氟尿喃唳纳米粒的方法。本发明所述制备半乳糖基壳聚糖/5-氟尿嘧啶纳米粒的方法，步骤包括步骤1，提供半乳糖基壳聚糖(GC)纳米材料，将GC纳米材料溶于有机酸，并调节pH值至5 6. 5，加水至GC质量浓度为0. 01 0. 05% ;所述有机酸为Cl C5的脂肪酸，可以是一元羧酸或多元羧酸，或其混合物。步骤2，将5-FU硫酸盐溶液与步骤2中制备的GC溶液混合，混悬，得到GC/5-FU纳米颗粒。其中步骤I中所述有机酸优选为C2 C4的脂肪酸，如乙酸、丙酸等。步骤I中优选调节pH值至5 6，更优选为调节至5. 5 6，如5. 7、5. 8、5. 9。调节PH值所用碱优选为Na0H、K0H、氨水、或其中任意几种的混合物。更优选地，调节pH值时，还可以加入有机酸羧酸盐，如乙酸钠、乙酸钾、或其中任意几种的混合物。步骤2中，所述5-FU硫酸盐溶液中，硫酸盐优选为硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、或其中任意几种的混合物。步骤2中，5-FU与GC质量比优选为5 20 I，更优选为5 15 I，更优选为7 13 1，如 8 1、9 UlO 1、11 1、12 I。步骤2中，5-FU与GC混合后的溶液中，5-FU浓度优选为I 5mg/ml、更优选为
I.5 3mg/ml、更优选为I. 5 2. 5mg/ml、最优选为I. 5 2mg/ml。步骤2中，所述悬混优选为在漩涡振荡器上进行，转速优选为2500rpm ;悬混时间优选为20s lmin，更优选为20s 50s，更优选为20s 40s，如30s、35s。根据本发明所述制备方法的一种优选实施方式，步骤I中，半乳糖基壳聚糖纳米材料制备方法优选为乳糖酸溶于酸性缓冲液，在偶联剂存在的条件下，与壳聚糖反应，制备得到GC纳米材料。其中，所述偶联剂如碳二亚胺，所述碳二亚胺可以是来自碳二亚胺盐，如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等，优选的碳二亚胺如I-乙基-3 (3- 二甲氨丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、或其盐(如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等)、或其衍生物(如乙二醇双(琥珀酰亚胺基丁二酸)、N-(马来酰亚胺烷酰氧基)琥珀酰亚胺酯)，可以是其中的任意一种或几种的混合物。所述缓冲溶液优选为四甲基乙二胺(TEMED，或TMEDA)酸性缓冲液，pH值优选为3 6，更优选为3 5，更优选为4 5，更优选为4. 5 5，如4. 6,4. 7,4. 8,4. 9。所述四甲基乙二胺酸性缓冲溶液中，调节pH值所用的酸可以是有机酸、无机酸，或其混合物，并优选为无机酸、或无机酸与有机酸的混合物。应当理解的是，这里述的酸包括酸式盐在内。所述无机酸如盐酸、硫酸、硝酸、硫酸氢盐、磷酸、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、氢溴酸等，可以是其中的任意一种或几种的组合。所述盐优选为钠盐、钾盐、或其混合物。其中，乳糖酸与壳聚糖重量比优选为0. 5 2 1，更优选为I 2 I。 其中，偶联剂与壳聚糖重量比优选为0.01 0.5 I。根据本发明所述制备方法的一种优选实施例，其中，步骤I中，将GC纳米材料、乙酸钠溶于乙酸的方法为将GC纳米材料溶于乙酸，放置10 20h，加入乙酸钠，壳聚糖终浓度为2mM。根据本发明所述制备方法的一种优选实施例，其中，步骤2中，悬混后，将产物放置一段时间，以促进颗粒的形成，放置时间优选为20min Ih,更优选为20min 50min,如25min、30min、35min、40min、45mino本发明还提供了一种上述方法制备的具有肝脏靶向性的负载5-FU的GC纳米颗粒。本发明上述纳米颗粒的平均粒径优选为30 40nm。本发明还提供了所述负载5-FU的GC纳米颗粒在治疗肝癌药物中的应用。本发明提供了一种制备具有肝脏靶向性的GC/5-FU的方法，药物包封率大于80%，载药率大于15%，Zeta电势在10 IlmV之间，所制备的药物具有良好的缓释效果，体外实验表明对肝癌细胞具有较其它药物更强的杀伤作用，体内分别检测表明，肝癌组织中5-FU浓度较肝脏和其它正常组织明显提高，即具有良好的肝癌细胞靶向性。
图I为本发明所述方法制备的半乳糖基壳聚糖/5-FU纳米颗粒SEM照片；图2为本发明所述方法制备的半乳糖基壳聚糖/5-FU纳米颗粒粒径分布图；图3为GC/5-FU在模拟体液(37°C，pH=7. 4)的体外释放曲线；图4 为 5-FU 和 GC/5-FU 对 SW480 和 SMMC-7721 的 IC50 对比；图5A为尾静脉分别注射5-FU、CS/5-FU、GC/5-FU后不同组织中5-FU水平；图5B为肝癌与各组织中5-FU浓度比值；图6A为GC/5-FU、5-FU、GC治疗后肿瘤重量对比；图6B为GC/5_FU、5_FU、GC治疗后小鼠存活率对比；图7为GC/5-FU、5_FU、GC治疗后肝癌组织凋亡指数对比；其中*代表如GC或control组比，P〈0. 01 ; * *代表与5-FU组相比P〈0. 01。
具体实施例方式实施例I乳糖酸I. 5g溶于25ml TEMED/HC1缓冲液(pH值4. 7)中，然后加入0. 07gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、0.3g I-乙基-3 (3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)Ug壳聚糖，室温下反应72h，冷冻干燥，制备得到半乳糖基壳聚糖(GC)纳米材料。GC纳米材料用乙酸溶解，过夜，加入乙酸钠，用NaOH调节pH值至5. 7，加入水至GC浓度为0. 02%，无菌微孔过滤器进行过滤除菌。按照5-FU与GC质量比为10 :1，取溶于4. 5ml硫酸钠溶液(浓度50nM)，配成5ml溶液，与制备的GC溶液混合，置于漩涡振荡器上(2500rpm)混悬30s，产物室温放置30min，以进一步促进颗粒形成，得到负载5-FU的GC纳米颗粒(GC/5-FU纳米颗粒)。经过测试和计算，本实施例制备的GC/5-FU纳米颗粒载药率(纳米粒中5_FU重量含量)达16. I %，包封率(纳米粒中5-FU占制备过程中投入药物总重量的比)达81. 82%，Zeta 电势为 +10. 34mV0实施例2、
乳糖酸I. 2g溶于25ml TEMED/HC1缓冲液(pH值4. 7)中，然后加入0. 05gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、0.4g I-乙基-3 (3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)Ug壳聚糖，室温下反应70h，冷冻干燥，制备得到半乳糖基壳聚糖(GC)纳米材料。GC纳米材料用乙酸溶解，过夜，加入乙酸钠，用NaOH调节pH值至5. 7，加入水至GC浓度为0. 02%，无菌微孔过滤器进行过滤除菌。按照5-FU与GC质量比为8 1，取溶于4. 5ml硫酸钠溶液(浓度50nM)，配成5ml溶液，与制备的GC溶液混合，置于漩涡振荡器上(2500rpm)混悬30s，产物室温放置30min，以进一步促进颗粒形成，得到负载5-FU的GC纳米颗粒(GC/5-FU纳米颗粒)。经过测试和计算，本实施例制备的GC/5-FU纳米颗粒载药率达15. 4%，包封率达82. 02%, Zeta 电势为 +10. 30mV。 实施例3乳糖酸2. Ig溶于25ml TEMED/HC1缓冲液(pH值4. 7)中，然后加入0. 08gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、0. 3g I-乙基-3 (3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)、1. Ig壳聚糖，室温下反应70h，冷冻干燥，制备得到半乳糖基壳聚糖(GC)纳米材料。GC纳米材料用乙酸溶解，过夜，加入乙酸钾，用KOH调节pH值至5. 7，加入水至GC浓度为0. 02%，无菌微孔过滤器进行过滤除菌。按照5-FU与GC质量比为15 1，取溶于4. 5ml硫酸钾溶液(浓度50nM)，配成5ml溶液，与制备的GC溶液混合，置于漩涡振荡器上(2500rpm)混悬30s，产物室温放置30min，以进一步促进颗粒形成，得到负载5-FU的GC纳米颗粒(GC/5-FU纳米颗粒)。经过测试和计算，本实施例制备的GC/5-FU纳米颗粒载药率达16. 4%，包封率达80. 75%, Zeta 电势为 +10. 32mV。以实施例I中得到的GC/5-FU为例，进行性能检测，方法如下GC/5-FU纳米粒特征图I显示了 SEM观察本发明制备的GC/5-FU的照片，图2为本发明制备的GC/5-FU粒径分布图,可以看出，本发明制备的GC/5-FU纳米颗粒平均粒径(35. 1±4. 5) mm,呈正态分布，纳米颗粒为规则的球形，表面光滑，大小均匀，纳米间无粘连。现已知大多数正常组织的血管内皮的孔径为2nm，毛细血管后微静脉的孔径为6nm,而不连续的肿瘤血管的孔径为100 780nm,本组纳米粒的粒径控制在35. Inm左右,这样不仅可以使载药纳米颗粒进入肿瘤间隙，还可以避免纳米颗粒进入正常组织。GC/5-FU纳米粒的体外释放实验称取GC/5-FU纳米粒20mg装入透析袋内，加入少量pH值为7. 4的模拟体液(SBF)形成混悬液，然后置于15ml SBF液中，于37°C水平恒温振荡器(频率为60rpm)内进行动态透析;分别于0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9和IOd后，取出透析液，同时补充15ml新鲜SBF维持原体积不变，于波长265nm测定吸光度值，据标准吸收曲线计算不同时间纳米微粒释放5-FU的量，根据标准曲线方程，计算其浓度和累积释放量，取3次实验的平均值，以累积释药百分率对时间作图，绘制载药纳米粒的释放曲线(见图3)。5-FU在各时间点的累积释放百分率(Q)计算公式为
f-1Q(%) 二(Vb x G + X Z c)x 100%. M—1. X-1
n=l
式中Ct为各时间点测得释放介质中的5-FU浓度(11^/1111)肩为投入的6(/54。米粒的质量(mg)，V0为释放介质的总体积(ml)，V为每次取样体积(ml)，X为测得GC/5-FU纳米粒的载药量(％)。从图3中可以看出，第I天出现突释，而第2 第7天逐渐释放，7天后缓慢释放，10天累计释放率95. 7%，说明本发明制备的GC/5-FU具有良好的缓释效果，并且药物释放时间长。GC/5-FU纳米粒对肿瘤细胞的杀伤效果SW480和SMMC-7721均溶于含10%胎牛血清的PRMI 1640培养基中，37°C、5% CO2中常规培养。取指数生长期细胞制成I X IO5个/mL细胞悬液，以190 u I/孔接种于96孔培养板上，培养24h后，分别加入IOiU不同浓度的5-FU和GC/5-FU纳米粒，分别培养至I、
2、3、4、5、6、7、8、9和IOd后，每孔加入30 y g噻唑蓝(MTT)液，继续培养4h，吸除孔内液体，每孔加入200 u I 二甲基亚砜，振荡IOmin后用Bio-Rad自动微板读数仪测定490nm的吸光度。每组实验均重复3次。每个浓度组选取24、48、72h共3个作用时间点进行MTT检测，观测5-FU和GC/5-FU对两种细胞株的生长抑制情况。并采用Bliss法I IOd计算出IC50值。根据5-FU和GC/5-FU在I IOd内不同时相点对SW480与SMMC-7721的IC50，绘制时间依赖性杀伤效应曲线(图4)，从图4可以看出，5-Fu的时间依赖性杀伤效应主要在I 6d，但7d后时间依赖性杀伤效应进入一个平台期；GC/5-FU-SMMC-7721和GC/5-FU-SW480的时间依赖性杀伤效应则从I IOd呈持续增加趋势，并且6d后，GC/5-FU-SW480的IC50值小于5-FU-SW480和5-FU-SMMC-7721。说明本发明制备的GC/5-FU纳米粒具有对肿瘤细胞持久杀伤效果。GC/5-FU纳米粒抑制小鼠肝癌移棺樽型的疗效观察用小鼠肝癌细胞株(H22)建立小鼠肝癌皮下模型。将小鼠处死后解剖出肿瘤组织，挑选生长旺盛新鲜的肿瘤组织，制成6X IO7个/ml的肿瘤细胞悬液。20%乌垃坦腹腔麻醉后，正中切口，用Iml注射器注射50 u I肿瘤细胞悬液注入肝左叶被膜下，稍等2min至无渗出，逐层关腹。GC/5-FU纳米粒体内靶向件取血清0. 5mL分别加入适量标准液配成5-FU浓度分别为0. 1,0. 2,0. 5、I. 0,5. O、20mg/L的标准血清，以5-FU浓度为x轴，测得5-FU的峰面积为Y轴，进行线性回归。原位肝癌移植模型成模后，随机分三组，每组5只动物模型，予以尾静脉分别注射剂量 200 ill (含 0. 371mg5-Fu)的 5-FU、CS/5_FU、GC/5_FU 后，30min 后处死小鼠，取动物模型的肝癌，肝脏，脾脏，肾脏，肺，肌肉，心脏和小肠组织以生理盐水洗净(血液除外)、滤纸吸干、取适当精确称取0. 5 I. 0g，转移到组织匀浆器，制成组织匀浆，定量吸取0. 5ml (血样则取血清)，按预处理项下操作，测得各组织的5-FU的浓度。图5A和图5B给出了不同组织中5_FU水平，可见肝癌组织中5_FU水平最高，正常肝脏次之；肝癌组织中5-FU水平是正常肝脏的8. 69倍、是肾脏的23. 35倍、血浆的85. 15倍，可见本发明制备的GC/5-FU具有良好的肝癌靶向性。
GC/5-FU纳米粒治疗小鼠原位肝癌移植模型的疗效观察待小鼠原位肝癌移植模型成模后第5天，肝癌组织约4 6mm (见图1)，将实验分为4组对照组(control)、纳米粒组(GC)、5-Fu组(5_Fu)和5_Fu纳米粒(GC/5-FU)。Control组用生理盐水静脉注射，剂量200 yl。GC组用空纳米尾静脉注射200 ill。5-Fu 组进行静脉注射，剂量 200 U I (含 0. 371mg5_Fu)。GC/5-Fu组予以GC/5-FU纳米粒进行静脉注射，剂量200 U I (含0. 371mg5_Fu)。成模后第6天开始连续尾静脉注射5天。成模后第15天处死部分小鼠(每组10只)，观察各小鼠的肿瘤生长情况、各肿瘤的平均重量。而其余各组小鼠(每组约15只)，进行生存分析。从图6A 可以看出，GC/5-Fu 的瘤重为(0. 4361 ±0. 1153) g，5_Fu 组为(0. 7932±0. 1283)g，GC 为(I. 3989±0. 2125)g，和 control 组为(I. 5801±0. ·2821)g，4 组瘤重之间差异有显著的统计学意义(P〈0. 01) ；GC/5-FU组和5-FU组的瘤重明显小于GC组及control组,差异有统学意义(p〈0. 01) ;GC/5_FU的瘤重又显著小于5_Fu组(p〈0. 01)。从图6B可以看出，control组的中位生存时间为12d，GC组为13d，5-FU为17d，而GC/5-FU组最高为30d。GC/5-FU组的生存时间最长(P〈0. 01)。流氏技术检测小鼠移植性肝癌H22细胞增殖周期及凋亡从每组所取出的瘤块中各取I 2mm3研磨制成细胞悬液，用0. lmol/L的PBS洗3次，体积分数70%的乙醇固定细胞沉淀，碘化丙啶染液(含质量浓度为50mg/L)，I. 0%的TritonX-IOO和质量浓度为10mg/L的RNaseA，4°C避光染色30min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期分布。按如下公式计算增殖指数(PI)= (S+G2/M) / (Go/Gi+S+^/M)GC/5-FU组和5-FU组的G0-G1期细胞较control组和GC组明显增高，而增殖指数明显降低；control组，GC组，5-FU和GC/5-FU组的凋亡指数依次升高(P〈0. 01);且GC/5-FU组的凋亡指数较5-FU组明显增强(P〈0. 01)，说明本发明制备的GC/5-FU能够促进5-FU进入肿瘤细胞，增强5-FU对肿瘤细胞的凋亡作用。原位末端标记法(TUNEL法)检测肝癌的凋亡取4iim厚肝癌的组织切片，经4%多聚甲醛固定，蛋白酶K (0. 02mg/L)室温消化30min后。在3% H2O2室温下浸泡5min以灭活内源性过氧化物酶。将切片置于平衡缓冲液中20min，含TDT酶(I 20)的标记混合液加到切片上，37°C温育I. 5h。洗涤，加入过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，37°C环境下放置30min，洗涤后，用DAB显色。反应混合液中加入双蒸水代替TDT作阴性对照。结果判定背景无色，细胞核内有棕黄色或棕褐色着色者为凋亡细胞。每例选择10个以上高倍视野，DMR+Q550病理图像分析仪(Laica公司，德国)计数至少1000个癌细胞,计算出凋亡细胞的百分率，即凋亡指数(apoptotic index,Al)。从图7可以看出，contro I组，GC组，5-FU和GC/5-FU组的凋亡指数依次升高(P〈0. 01) ;GC/5-FU 组的平均 Al 为 21. 34%，较 5-FU 组的 14. 74% 明显增高(P〈0. 05)。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
权利要求
1.一种制备半乳糖基壳聚糖/5-氟尿嘧啶纳米粒的方法，其特征在于，步骤包括 步骤1，提供半乳糖基壳聚糖纳米材料，将GC纳米材料溶于有机酸,并调节pH值至5飞.5，加水至GC质量浓度为O. ΟΓΟ. 05% ;所述有机酸为CfC5的脂肪酸，可以是一元羧酸或多元羧酸，或其混合物； 步骤2，将5-FU硫酸盐溶液与步骤2中制备的GC溶液混合，混悬，得到GC/5-FU纳米颗粒。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I中调节pH值至5飞。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，调节pH值所用碱为NaOH、KOH、氨水、或其中任意几种的混合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，调节pH值时，还加入有机酸羧酸盐。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述5-FU硫酸盐溶液中，硫酸盐为硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、或其中任意几种的混合物。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2中，5-FU与半乳糖基壳聚糖纳米材料质量比为5 20 :1。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，悬混后，将悬混产物放置一段时间，以促进颗粒的形成。
8.—种如权利要求I所述方法制备的具有肝脏靶向性的负载5-FU的半乳糖基壳聚糖纳米颗粒。
9.根据权利要求8所述的负载5-FU的半乳糖基壳聚糖纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒平均粒径为30 40nm。
10.一种如权利要求8所述负载5-FU的半乳糖基壳聚糖纳米颗粒在治疗肝癌药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种制备GC/5-FU纳米粒的方法，将GC纳米材料溶于有机酸，与5-FU硫酸盐溶液混合，悬混得到GC/5-FU纳米颗粒。所述制备的GC/5-FU纳米颗粒具有较高的载药率、和包封率，并且纳米颗粒为球形，表面光滑，无团聚现象；合适的粒径能够是载药纳米颗粒进入肿瘤间隙，而避免进入正常组织，使其具有更好的靶向性。
文档编号A61K31/513GK102670517SQ20121017563
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者程明荣 申请人:程明荣