专利名称：构建pGM-CSF-EGFP-IRES-Rae1-IL21载体的方法
技术领域：
本发明涉及一种载体的构建方法，尤其涉及ー种构建具有抑制免疫逃逸功能、促进肿瘤细表达被免疫系统识别能力的载体的方法、所构建的载体及其应用。
背景技术：
肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，早期肝癌的首选治疗是肝移植和手术切除，但肝移植供体短缺，价格昂贵，导致大多数患者在等待供肝过程中死亡，故早期肝癌主要手术切除为主。对于失去手术机会的肝癌患者，现有的抗癌药，生物利用率低、靶向性差，在杀伤肝癌细胞的同时对正常细胞也有较大毒副作用，并严重抑制机体免疫系统，导致患者常死于化疗药物的并发症。20世纪50年代Burnet和Thomas提出免疫系统能识别自发恶性转化细胞(免疫监视)，免疫监视主要与抗病毒免疫有夫。抗肿瘤免疫面对的是“自身”抗原(肿瘤抗原)，以细胞免疫为主，需多种细胞參与，如CD8+T和CD4+T细胞是主要的效应细胞。当肿瘤细胞不表达抗原表位、抗原加工缺陷、抗原调变、抗原脱落、缺乏主要组织相容性复合体I (majorhistocompatibility complexI,
MHC-I)类分子、缺乏免疫共刺激分子、肿瘤细胞表达抑制分子、肿瘤细胞表达细胞凋亡调控因子配体(FasL)等,或机体在免疫缺陷、免疫抑制均造成自然杀伤细胞(natural killer,NK)和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte,CTL)的活性降低，即发生了肿瘤的免疫逃逸(肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统识别和攻击，从而得以在体内生存和增埴的现象称为免疫逃逸，immune escape)。由于肿瘤细胞分泌的免疫抑制分子可在肿瘤局部形成深度免疫抑制“黑洞”区，在此区的免疫细胞严重受抑，即使功能正常甚至活化的免疫细胞一旦进入，也将成为功能受抑的“沉默”细胞，结果使免疫细胞无法对其攻击清除，这被认为是肿瘤逃避免疫监视得以发生发展的重要机制。
发明内容
针对肝癌患者出现的肿瘤免疫逃逸现象，本发明提供了一种可以抑制免疫逃逸的载体、所述载体的构建方法、以及所述载体的应用。本发明的第一个方面是提供一种构建pGM-CSF-EGFP-IRES-Rael_IL21载体的方法，步骤包括
针对GM-CSF 基因(GeneID NM_009969. 4)、Rae_l 基因(GeneID NM_175112. 5)、EGFP 基因、IL21基因(GeneID NM_021782. 2)的⑶S区序列提供PCR引物，通过PCR扩增在上述基因的5’端和3’端均添加酶切位点；
PCR扩增EGFP基因的DCs区，将EGFP的PCR产物进行和pIRES载体(Cat. No. 631605)分别进行双酶切，然后将EGFP和pIRES酶切产物进行连接，得到pEGFP-IRES质粒；
将GM-CSF基因与pEGFP-IRES质粒连接(pEGFP-GM_CSF_IRES)，然后分别插入Rae-I基因和IL21基因。根据本发明所述方法的ー种优选实施例，其中，EGFP的PCR产物进行和pIRES载体的双酶切优选为EcoRI和MluI双酶切。在本发明所述的优选实施例中，所设计的PCR引物能够在GM-CSF基因的5’端添加XhoI酶切位点，3’端添加EcoRI酶切位点；在EGFP基因的5’端添加EcoRI酶切位点，3’端添加MluI酶切位点；在Rae-I基因的5’端添加Xbal酶切位点，3’端添加Sall酶切位点；在IL21基因的5’端添加Sall酶切位点，3’端添加Notl酶切位点。在本发明所述的优选实施例中，所述PCR引物优选为
GM-CSF基因PCR引物
SEQ ID No. I CAGATCTCGAGGCCACCATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCSEQ ID No. 2 GTCAGAATTCCCATTTTTGGCCTGGTTTTTTGEGFP基因PCR引物
SEQ ID No. 3 GTCAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGSEQ ID No. 4 ACTTAACGCGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCRae-I基因PCR引物
SEQ ID No. 5 GTACATTCTAGAGCCACCATGAGTCTGTTTGGATCAACCTCTSEQ ID No. 6 GAATGTCGACGTATTTCTTATTCCTTGGCTTTAGCTIL-21基因PCR引物
SEQ ID No. 7 GTCAGTCGACGCCACCATGGAGAGGACCCTTGTCTGTCSEQ ID No. 8 AATTGCGGCCGCCTAGGAGAGATGCTGATGAATCATC上述引物中，下划线部分为酶切位点。本发明上述的优选实施例中，PCR扩增EGFP基因CDS区的反应，优选为以PIRES2-EGFP为模板进行扩増。以PIRES2-EGFP为模板进行扩增的反应体系优选为
IOXBuffer5 μ I
硫酸镁溶液(50mM)2μ I
dNTP (IOmM)I μ I
Taq HiFi (5U/y I)0. 2 μ I
上游引物(10 μ Μ)1μ I
下游引物(10 μ Μ)I μ I
PIRES2-EGFPI μ I
ddH20至总体积50 μ I
以PIRES2-EGFP为模板进行扩增的反应条件优选为94°C，3min——(94°C, 30s——56°C, 30s-68°C,45s) X35 个循环-68で，lOmin。本发明上述的优选实施例中，所述双酶切反应体系优选为
IOXBuffer R3μ I
EGFP 基因 PCR 产物 /pIRES I μ g 第一种限制性内切酶O. 5μ1
第二种限制性内切酶O. 5μ1ddH20至总体积30 μ I
根据上述引物，所述两种内切酶优选为EcoRI和Mlul。其中，双酶切反应条件优选为37°C，反应时间优选为4 5h。本发明上述的优选实施例中，所述pIRES与EGFP酶切产物连接反应体系优选为 10XT4连接酶缓冲液3μ1
EGFP基因PCR酶切产物 I μ g PIRES酶切产物I μ g
T4连接酶I μ I
ddH20至总体积10 μ I
本发明上述的GM-CSF基因与pEGFP-IRES质粒连接反应优选为将PMD-19T-GM-CSF载体和pEGFP-IRES质粒分别进行双酶切，然后进行连接，双酶切反应体系优选为IOXBuffur Tango5 μ I
PMD-19T-GM-CSF/pEGFP-IRES 2 μ I 第一种限制性内切酶O. 5μ1
第二种限制性内切酶O. 5μ1
ddH20至总体积30 μ I
根据上述引物，所述两种内切酶优选为XhoI和EcoRI。本发明上述的方法中，Rae-I基因与IL21基因片段插入顺序优选为先将Rae-I基因片段插入。其中，Rae-I基因片段插入方法优选为Rae-I片段与pEGFP_GM_CSF- IRES质粒经Xbal 和 Sall 双酶切后连接，得到 pGM-CSF-EGFP-IRES-Rae-l。其中，IL21基因片段插入方法优选为IL21片段与目的载体pEGFP_GM_CSF-IRES-Rael 经 Sall 和 Notl 双酶切后连接，得到 pEGFP-GM-CSF-IRES- Rael_IL21 载体。本发明的第二个目的是提供ー种上述方法构建的pEGFP-GM-CSF-IRES-Rael-IL21 载体。本发明的第三个目的是提供ー种上述方法构建的pEGFP-GM-CSF-IRES-Rael-IL21载体在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明的第四个目的是提供ー种上述方法构建的pEGFP-GM-CSF-IRES-Rael-IL21载体在制备预防肝癌抗原中的应用。本发明提供了一种构建重组载体的方法，所构建的重组载体能够促进NK和CTL细胞活性、促进机体免疫系统激活、促使肿瘤细胞被NK和CTL细胞识别、并便于检测基因转染情况，可用于制备治疗或预防肿瘤的药物或疫苗。。
图I为本发明构建的载体结构示意 图2为本发明所用pIRES载体图谱；
图3为EGFP的PCR扩增电泳照片；
图4A为pEGFP-IRES重组载体菌落PCR鉴定照片；
图4B为pEGFP-IRES重组载体酶切鉴定照片；图5A为pGM-CSF-EGFP-IRES重组载体菌落PCR鉴定照片；
图5B为pGM-CSF-EGFP-IRES重组载体酶切鉴定照片；
图6A为pGM-CSF-EGFP-IRES-Rae-l重组载体菌落PCR鉴定照片；
图6B为pGM-CSF-EGFP-IRES-Rae-l重组载体酶切鉴定照片；
图7A为pEGFP-GM-SCF-IRES-Rael-IL21重组载体菌落PCR鉴定照片；
图7B为pEGFP-GM-SCF-IRES-Rael-IL21重组载体酶切鉴定照片。具体实施例方式本发明提供了一种构建pEGFP-GM-SCF-IRES-Rael-IL21载体的方法，其中所述的GM-CSF基因、Rae-I基因、EGFP基因、IL21基因，以及pIRES载体均是已知的，并已经商业化。下面通过具体实施例对本发明所述方法、载体、及其应用进行详细的介绍和描述，以使更好的理解本发明内容，但是应当理解的是，下述实施例并不限制本发明范围。I、引物设计
首先针对上述基因CDS区序列设计并合成引物，以在GM-CSF基因的5’端添加XhoI酶切位点，3’端添加EcoRI酶切位点；在EGFP基因的5’端添加EcoRI酶切位点，3’端添加MluI酶切位点；在Rae-I基因的5’端添加Xbal酶切位点，3’端添加Sall酶切位点；在IL21基因的5’端添加Sall酶切位点，3’端添加Notl酶切位点。所述引物如下
GM-CSF-XhoI-F CAGATCTCGAGGCCACCATGTGGCTGCAGAATTTACTTT TCGM-CSF-EcoRI-R GTCAGAATTCCCATTTTTGGCCTGGTTTTTTGEGFP-EcoRI-F GTCAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGEGFP-MluI-R ACTTAACGCGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCRae-I-Xbal-F GTACATTCTAGAGCCACCATGAGTCTGTTTGGATCAACCT CTRae-I-SalI-R GAATGTCGACGTATTTCTTATTCCTTGGCTTTAGCTIL21-SalI-F GTCAGTCGACGCCACCATGGAGAGGACCCTTGTCTGTCIL21-NotI-R AATTGCGGCCGCCTAGGAGAGATGCTGATGAATCATC2、PCR扩增EGFP基因
以pIRES2-EGFP为模板，PCR扩增EGFP基因⑶S，扩增体系如下_
权利要求
1.一种构建pGM-CSF-EGFP-IRES-Rael-IL21载体的方法，其特征在于，步骤包括 针对GM-CSF基因、Rae-1基因、EGFP基因、IL21基因的⑶S区序列提供PCR引物，通过PCR扩增在上述基因的5’端和3’端均添加酶切位点； PCR扩增EGFP基因的DCs区，将EGFP的PCR产物进行和pIRES载体分别进行双酶切，然后将EGFP和pIRES酶切产物进行连接，得到pEGFP-IRES质粒； 将GM-CSF基因与pEGFP-IRES质粒连接，然后分别插入Rae-I基因和IL21基因。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，EGFP的PCR产物进行和pIRES载体的双酶切为EcoRI和MluI双酶切。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所设计的PCR引物能够在GM-CSF基因的5’端添加XhoI酶切位点，3’端添加EcoRI酶切位点；在EGFP基因的5’端添加EcoRI酶切位点，3’端添加MluI酶切位点；在Rae-I基因的5’端添加Xbal酶切位点，3’端添加Sall 酶切位点；在IL21基因的5’端添加Sall酶切位点，3’端添加Notl酶切位点。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR引物为 GM-CSF基因PCR引物SEQ ID No. I CAGATCTCGAGGCCACCATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCSEQ ID No. 2 GTCAGAATTCCCATTTTTGGCCTGGTTTTTTGEGFP基因PCR引物SEQ ID No. 3 GTCAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGSEQ ID No. 4 ACTTAACGCGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCRae-I基因PCR引物SEQ ID No. 5 GTACATTCTAGAGCCACCATGAGTCTGTTTGGATCAACCTCTSEQ ID No. 6 GAATGTCGACGTATTTCTTATTCCTTGGCTTTAGCTIL-21基因PCR引物SEQ ID No. 7 GTCAGTCGACGCCACCATGGAGAGGACCCTTGTCTGTCSEQ ID No. 8 :AATTGCGGCCGCCTAGGAGAGATGCTGATGAATCATC。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR扩增EGFP基因CDS区的反应，以PIRES2-EGFP为模板进行扩増。
6.一种权利要求I所述方法构建的pEGFP-GM-CSF-IRES- Rael_IL21载体。
7.—种权利要求6所述载体在制备治疗肝癌药物中的应用。
8.—种权利要求6所述载体在制备预防肝癌抗原中的应用。
全文摘要
本发明构建了一种pGM-CSF-EGFP-IRES-Rae1-IL21载体，其中，GM-CSF和IL-21基因的功能是促进机体免疫系统的激活，尤其是NK细胞和CTL细胞的激活；Rae-1基因转染到肿瘤细胞后，主要促进肿瘤细胞表达NKG2D配体(即Rae-1)，促使肿瘤细胞被机体免疫系统尤其是NK细胞和CTL细胞的识别；绿色蛋白(EGFP)基因主要便于监测基因在体内的转染情况，可在荧光显微镜下观察各组织的基因转染情况。
文档编号A61P35/00GK102660567SQ201210175428
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者程明荣 申请人:程明荣