一种短肽、载铜纳米生物材料及在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】一种自组装短肽，它的氨基酸序列为序列表中SEQ?ID?NO：1所述。一种载铜纳米生物材料，为RP自组装短肽、RAD16-II自组装短肽、CuSO4和灭菌去离子水配制成的混合溶液所形成的凝胶状物质，所述混合溶液中，RP自组装短肽的浓度为0.1mM～4mM，RAD16-II自组装短肽的浓度为2mM～8mM、CuSO4的浓度为10μM～100μM，所述RP自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ?ID?NO：1所述，所述RAD16-II自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ?ID?NO：2所述。实验表明，所述载铜纳米生物材料可在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中应用。
【专利说明】一种短肽、载铜纳米生物材料及在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物材料领域，特别涉及自组装短肽、含自组装短肽的载铜纳米生物材料及其在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]自组装短肽是一种新型的纳米生物材料，自20世纪90年代问世以来，受到了人们的广泛重视，得到了快速的发展，并在细胞三维培养及制备疏水药物载体、止血药物、烧伤治疗药物、抑菌药物、白血病治疗或预防药物等方面应用。但是，制备出更多的自组装短肽、扩大自组装短肽的应用范围仍然是科技工作者关注的问题。
[0003]下肢缺血性疾病是一种世界范围内常见的下肢动脉慢性狭窄或闭塞导致的外周血管病，下肢缺血性疾病主要包括下肢动脉硬化闭塞症(ASO)、血栓闭塞性脉管炎(TAO)和糖尿病动脉硬化闭塞症(DAO)。下肢缺血性疾病往往由于病侧主要动脉严重闭塞，造成远端供血障碍，其最终结局往往是截肢甚至死亡。下肢缺血性疾病发病率都在逐年急速上升。据统计，在西方国家最新的重度下肢缺血(Critical limb ischemia, CLI)的发病率为500-1000/百万人/年，在美国每年病例数量为150000-300000。CLI第一年的死亡率和发病率超过了恶性肿瘤，死亡率为25%，截肢率为30%。在我国，现有下肢缺血病人2000万以上,年增长高达60万。近年来，随着引起血管疾病危险因素的增多，如高血脂、高血压、糖尿病等疾病发病人数的急速增加以及老龄化时代的到来，下肢缺血性疾病已逐渐凸显出严重的危害程度和发病率逐年增高的趋势，面对如此严峻形势，如何减少患者的致残率、挽救已濒于截肢的病人肢体，是医疗领域急需解决的问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种自组装短肽和含自组装短肽的载铜纳米生物材料，本发明的再一目的是证明载铜纳米生物材料能使病变组织器官的血管新生，以便开发出一类治疗下肢缺血性疾病的新型药物。
[0005]本发明所述自组装短肽，命名为RP，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所述，其理论分子量为3066.15道尔顿。本发明所述载铜纳米生物材料，为上述RP自组装短肽、RAD16-1I自组装短肽、CuSO4和灭菌去离子水配制成的混合溶液所形成的凝胶状物质，所述混合溶液中，RP自组装短肽的浓度为0.1mM~4mM，RAD16-1I自组装短肽的浓度为2mM~~8mM、CuSO4的浓度为ΙΟμΜ~ΙΟΟμΜ，所述RAD16-1I自组装短肽已公开[见ShuguangZhang.Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cellcultures.Seminars in Cancer Biology 15 (2005) 413 - 420]，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID N0:2所述。本发明所述载铜纳米生物材料，其制备方法如下:
[0006](I)去离子水的灭菌处理
[0007]将去离子水在蒸汽压103.4kPa、温度121.3°C下处理至少30分钟，然后冷却至室温;
[0008](2)原料溶液的配制
[0009]在室温、常压下将CuSO4用步骤(I)灭菌处理的去离子水配制成CuSO4溶液，然后在超净台的无菌环境中将CuSO4溶液用0.22 μ m的一次性滤器过滤除菌，所述CuSO4溶液中，CuSO4的浓度是上述形成凝胶状物质的混合液中的CuSO4浓度的2倍倍；
[0010]在超净台的无菌环境中于室温、常压下将RP自组装短肽用步骤(I)灭菌处理的去离子水配制成RP自组装短肽溶液，所述RP自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO:1所述，所述RP自组装短肽溶液中，RP自组装短肽的浓度是上述形成凝胶状物质的混合液中的RP自组装短肽浓度的2倍倍；
[0011]在超净台的无菌环境中于室温、常压下将RAD16-1I自组装短肽用步骤(I)灭菌处理的去离子水配制成RAD16-1I自组装短肽溶液，所述RAD16-1I自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所述，所述RAD16-1I自组装短肽溶液中，RAD16-1I自组装短肽的浓度是上述形成凝胶状物质的混合液中的RAD16-1I自组装短肽浓度的2倍倍；
[0012](3)混合液的配制
[0013]所述混合液由步骤(2)配制的CuSO4溶液、RP自组装短肽溶液和RAD16-1I自组装短肽溶液组成，CuSO4溶 液的量按混合液中CuSO4的浓度为10 μ M~100 μ M计量，RP自组装短肽溶液的量按混合液中RP自组装短肽的浓度为0.1mM~4mM计量，RAD16-1I自组装短肽溶液的量按混合液中RAD16-1I自组装短肽的浓度为2mM~8mM计量，在超净台的无菌环境中于室温、常压下将计量好的CuSO4溶液、RP自组装短肽溶液和RAD16-1I自组装短肽溶液加入反应容器中，并混合均匀；
[0014](4)成胶
[0015]将步骤(3)所配制的混合液在室温、常压下超声反应20 min~40min，然后在常压、4°C的环境中放置12小时~24小时，即形成的凝胶状的载铜纳米生物材料。
[0016]上述方法中，超声反应的超声功率为160W~200W。
[0017]动物实验表明，用本发明所述载铜纳米生物材料对下肢缺血动物模型干预治疗，可使缺血下肢的血管新生，从根本上改善缺血下肢的血供，显著减少了缺血下肢的局部坏疽(见实施例5、实施例6)。
[0018]本发明所述载铜纳米生物材料可以通过添加药学上可接受的载体或赋形剂，制成适于临床使用的治疗下肢缺血性疾病的药物。
[0019]本发明具有以下有益效果:
[0020]1、本发明提供了一种新型自组装短肽，增加了自组装短肽的种类。
[0021]2、实验表明，本发明所述载铜纳米生物材料可促进缺血下肢的血管新生，从根本上改善缺血下肢的血供，显著减少缺血下肢的局部坏疽，对下肢缺血动物模型取得了显著的治疗效果。
[0022]3、本发明所述载铜纳米生物材料是通过对缺血下肢进行肌肉局部注射的方式进行治疗，较之搭桥、介入等手术方式治疗，操作更加简单，易于推广。
[0023]4、本发明可为下肢缺血疾病的治疗提供一种有效的新药品，具有明显的社会效益和经济效益。【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明所述方法制备的自组装短肽RP纯化后的高效液相色谱图(HPLC)；
[0025]图2是本发明所述自组装短肽RP的质谱图；
[0026]图3是实施例2所制备的RAD16-1I自组装短肽纯化后的高效液相色谱图(HPLC);
[0027]图4是实施例2所制备的RAD16-1I自组装短肽的质谱图；
[0028]图5是原子力显微镜(AFM)图，图中，Cu-NM代表本发明所述载铜纳米生物材料；
[0029]图6是实验小鼠的缺血下肢病理评分照片
[0030]图7是实验小鼠的缺血下肢病理评分图，图中，Cu-NM代表本发明所述载铜纳米生物材料；
[0031 ] 图8是实验小鼠的缺血下肢治疗后第28天的血流灌注量测定照片，图中，Cu-NM代表本发明所述载铜纳米生物材料；
[0032]图9是实验小鼠的缺血下肢治疗后第28天的血流灌注量测定图，图中，Cu-NM代表本发明所述载铜纳米生物材料，**，表示Cu-NM治疗组与对照组(Control组)具有显著性差异(P〈0.01)。
【具体实施方式】
[0033]实施例1:自组装短肽RP的合成
[0034]1、材料及设备
[0035]1.1 试剂
[0036]芴甲氧羰基(Fmoc)- 氨基酸为美国SIAM公司产品；PyBOP、Boc-His-Merrifield resin树脂、六氢吡唳、二甲基吡唳为Merck公司产品；二甲基甲酰胺(DMF)为日本三星公司产品(使用前先经茚三酮浸泡和3A分子筛脱水，并测定无游离氨基);二氯甲烷(DCM)，为中国医药(集团)上海化学试剂公司产品(使用前用无水碳酸钾浸泡处理)；三氟乙酸(TFA)为GEEL BELGIUM公司产品；甲醇为上海振兴化工一厂产品；HPLC甲醇为Merck公司产品；四氢呋喃为上海化学试剂站中心化工厂产品。
[0037]1.2 仪器
[0038]431A型多肽合成仪为Applied biosystems产品，高效液相色谱仪为安捷伦1100色谱仪，制备色谱仪为WATERS600E ;冷冻干燥机(FREEZE DRYER 18)为LABC0NC0产品；质谱仪为 Finnigan LCQ。
[0039]2、制备方法
[0040]2.1肽链的合成:
[0041]肽链的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc保护基团的脱除用30%六氢吡啶的DMF溶液；肽链从树脂上的切落用切肽试剂(三氟乙酸/结晶苯酚/水/乙二硫醇/甲乙硫醚=81.5/5/5/2.5/1)。
[0042]接肽前树脂处理:
[0043]①称取100毫克Boc- His -Merrifield resin到砂芯过滤反应器中；
[0044]②加入二氯甲烷浸泡洗涤6 次，每次5毫升，过滤除去洗涤的二氯甲烷；
[0045]③加入10%的TFA (二氯甲烷作溶剂)5毫升，室温反应2小时，以除去树脂上氨基酸N端的BOC保护基；[0046]④加入二氯甲烷浸泡洗涤3次，每次5毫升，然后加入5%的三乙胺(二氯甲烷作溶剂) 5毫升，2次中和PH值后再用二氯甲烷洗涤6次，DMF洗涤5次即可放入仪器反应器中进行接肽反应。
[0047]接肽在431 A多肽合成仪上进行,称取IOOmg His -Merrifield resin放入反应器中，然后按下列量在合成仪中依次加入各种Fmoc-氨基酸(反应过程中加入的FMOC-氨基酸并不是一次全部加入反应容器，而是按照多肽的序列顺序从C端逐渐加入，每一个氨基酸反应周期时间为40分钟，在加入氨基酸的同时要加入相同摩尔的PYBOP试剂和HOBT试剂)
[0048]以下是序列中需要加入氨基酸的量:
[0049]
【权利要求】
1.一种自组装短肽，其特征在于它的氨基酸序列为序列表中SEQ ID N0:1所述。
2.一种载铜纳米生物材料，其特征在于该材料为RP自组装短肽、RAD16-1I自组装短肽、CuSO4和灭菌去离子水配制成的混合溶液所形成的凝胶状物质，所述混合溶液中，RP自组装短肽的浓度为0.1mM~4mM，RAD16-1I自组装短肽的浓度为2mM~8mM、CuSO4的浓度为10 μ M~100 μ M，所述RP自组装短肽为权利要求1所述自组装短肽，所述RAD16-1I自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID Ν0:2所述。
3.权利要求2所述载铜纳米生物材料的制备方法，其特征在于工艺步骤如下: (1)去离子水的灭菌处理 将去离子水在蒸汽压103.4kPa、温度121.3°C下处理至少30分钟，然后冷却至室温； (2)原料溶液的配制 在室温、常压下将CuSO4用步骤(I)灭菌处理的去离子水配制成CuSO4溶液，然后在超净台的无菌环境中将CuSO4溶液用0.22 μ m的一次性滤器过滤除菌，所述CuSO4溶液中，CuSO4的浓度是权利要求2所述混合液中的CuSO4浓度的2倍~4倍； 在超净台的无菌环境中于室温、常压下将RP自组装短肽用步骤(I)灭菌处理的去离子水配制成RP自组装短肽溶液，所述RP自组装短肽为权利要求1所述自组装短肽，所述RP自组装短肽溶液中，RP自组装短肽的浓度是权利要求2所述混合液中的RP自组装短肽浓度的2倍4倍； 在超净台的无菌环境中于室温、常压下将RAD16-1I自组装短肽用步骤(I)灭菌处理的去离子水配制成RAD16-1I自组装短肽溶液，所述RAD16-1I自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID N0:2所述，所述RAD16-1I自组装短肽溶液中，RAD16-1I自组装短肽的浓度是权利要求2所述混合液中的RAD16-1I自组装短肽浓度的2倍倍； (3)混合液的配制 所述混合液由步骤(2)配制的CuSO4溶液、RP自组装短肽溶液和RAD16-1I自组装短肽溶液组成，CuSO4溶液的量按混合液中CuSO4的浓度为10 μ M~100 μ M计量，RP自组装短肽溶液的量按混合液中RP自组装短肽的浓度为0.1mM~4mM计量，RAD16-1I自组装短肽溶液的量按混合液中RAD16-1I自组装短肽的浓度为2mM~8mM计量， 在超净台的无菌环境中于室温、常压下将计量好的CuSO4溶液、RP自组装短肽溶液和RAD16-1I自组装短肽溶液加入反应容器中，并混合均匀； (4)成胶 将步骤(3)所配制的混合液在室温、常压下超声20 min~40min，然后在常压、4°C的环境中放置12小时~24小时，即形成凝胶状的载铜纳米生物材料。
4.权利要求2所述载铜纳米生物材料在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中的应用。
【文档编号】A61K38/16GK103467577SQ201210188770
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月8日 优先权日:2012年6月8日
【发明者】唐成康, 康裕建 申请人:四川大学华西医院