专利名称：牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法
技术领域：
本发明利用胰蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备降血压肽，属于生物技术领域，尤其涉及多肽的膜分离技术。
背景技术：
大量的研究发现，蛋白质在人体内并不完全是以氨 基酸的形式被人体所吸收，而更多的是以小分子肽的形式被人体吸收利用。这些由数个氨基酸组成小分子肽不仅具有营养功能和生理活性，还具有一定的功能特性，如抗氧化性、抗菌性、提高免疫性等诸多新功倉泛。降血压肽就是这样一种具有降低血压功能的小分子肽，分子量主要集中在1500U左右，它是血管紧张素转换酶(Angiotension-converting Enzyme, ACE)的抑制剂，因而也称为 ACE 抑制妝(Angiotension-converting Enzyme Inhibitory peptides, ACEIP)。人体中存在肾素一血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System, RAS)和激肽释放酶一激肽系统(Kallikrein-Kinin System, KKS)对血压的调节起着重要作用。ACE催化RAS系统中的血管素I转化成具有强烈血管收缩作用的血管紧张素II，将KKS系统中具有血管扩张作用的缓激肽降解成无活性的缓释肽，通过这两种方式引起血压上升。ACE抑制肽与ACE结合后阻止了其对血管紧张素I及缓激肽的催化分解，从而起到了降低血压的作用。目前已有多种化学合成肽类药物作为ACE抑制剂，但这类合成降血压药存在作用时间不长，血压容易反弹，并且药物经肾脏排出容易造成肾功能的损伤。而从食品蛋白质经酶解产生的ACE抑制肽具有食用安全性高、无副作用，特别是其对高血压患者具有降压作用，但对血压正常人无降压作用等优点。专利号为ZL02139559. 4的专利，授权公布了一种用粗奶酪为原料制备酪蛋白降血压肽的工艺，其制备工艺简单，但由于其酶水解产物未经过超滤、纳滤等纯化工艺，水解产物含有较多杂肽段和大量盐，限制了产品在保健品和药品中的应用。同时其工艺用盐酸调节PH终止酶解反应，但并未对蛋白酶进行彻底灭火，水解产物潜在的活性蛋白酶类作为食品，会存在潜在的安全风险。其次，未参与水解的酪蛋白，其专利也未提供去除工艺，由于酪蛋白分子量大，不易被吸收，疏水性强，不易溶于水，势必会影响最终产品品质，降低产品营养价值。
发明内容
本发明的目的在于利用青藏高原特有的牦牛曲拉，通过提取纯化得到的酪蛋白为原料，提供一种对引起高血压的ACE有明显抑制作用的牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，工艺简单，纯度高，水解产物不含小分子盐、大分子酪蛋白和活性蛋白酶，适合在食品、保健品及医药领域中使用。本发明是这样实现的，一种牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，包括以下步骤(I)牦牛乳酪蛋白加水溶解，调整浓度为1% 10%，调节温度为20°C 50°C，pH6. O 9. 0,搅拌,使牦牛乳酪蛋白完全溶解；(2)加胰蛋白酶水解，维持反应温度20°C 50°C，pH6. O 9. 0，水解I 7小时；(3)灭活胰蛋白酶，升温至80°C 100°C，维持30 50分钟；(4)沉淀酪蛋白，用5mol/L食用级盐酸调节pH到3. 8 4. 6,使酪蛋白在其等电点处析出；(5)离心除沉淀，4000g 12000g离心力，离心5 30分钟，留上清液；
(6)超滤，用截留量3000Da的超滤膜，超滤步骤(5)所得上清液，除去大分子蛋白及多肽，收集透过液；(7)纳滤，用截留量500Da的纳滤膜，纳滤步骤(6)所得超滤液去除小分子盐和氨基酸，收集回流液；(8)对步骤(7)收集的回流液进行喷雾干燥，即得所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽。在步骤(I)中所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白，购自华羚酪蛋白股份有限公司，步骤(I)中所述的牦牛乳酪蛋白加水溶解是取5 50g牦牛乳酪蛋白，加水500mL进行溶解。在步骤(2)中胰蛋白酶，酶添加量为牦牛乳酪蛋白加入量的O. 5% 2%，所述的胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，酶活为1:2500。在步骤(8)中，是采用喷雾干燥机对步骤(7)收集的回流液进行干燥的，所述喷雾干燥机进风温度为150 165°C，出风温度为65 85°C，流速300 400mL/h。所述的喷雾干燥机现主要采用上海沃迪科技有限公司提供的SD-1500型喷雾干燥机。最终，我们还可以对所述牦牛乳酪蛋白降血压肽进行了降血压活性测定ACE酶液50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL预冷至4°C硼酸缓冲液(pH8. 3，IOOmmoI/L)中，4°C保持12h后4°C、20000r/min离心40min，收集上清液并4°C保。FAPGG底物溶液将FAPGG溶于100mmol/L的硼酸冲液(含300mmol/L的NaCl，pH8. 3),配制成 I. 6mmol/L 溶液。500 μ L FAPGG底物溶液与100 μ L超纯水或抑制剂ACE抑制肽或卡托普利)混匀，37°C预热2min，加入IOOyL ACE酶液开始反应，30min后立即加入100 μ LDTA (IOOmmoI/L)终止反应，加入4000 μ L超纯水稀释，实验平行3次。Omin样品的测定，要先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。于340nm波长处分别测系在Omin和30min时的吸光度，计算差值ΛΑ(ΛΑ = AOmin — A30min)。以单位时间内吸光度的变化表示ACE酶活力，抑制剂对ACE的抑制程度用(2)式计算。
jS, i j
ACE 抑制活性%= (I _ —— ) X100
ii-AC式中AAc为加入超纯水时吸光度在30min内的变；AAi为加入抑制剂时吸光度在30min内的变化。半抑制浓度(IC50)定义为抑制50%ACE酶活力时抑制剂浓度。配制不同浓度的ACE抑制剂(nmol/L或mg/mL)上述步骤测定其ACE抑制活性，以Ig抑制剂的浓度横坐标，ACE抑制活性(%)为纵坐标，进行回归分析回归方程，利用回归方程计算抑制剂的IC50。本发明的有益效果是I.本发明采用青藏高原无污染的牦牛乳酪蛋白为原料，原料蛋白含量高，价格低，间接降低了生产成本；同时开发了牧区资源，对牧区经济发展具有重要意义。2.食源牦牛乳酪蛋白降血压肽，与合成降血压产品相比，食用安全性高、无副作用，特别是其对高血压患者具有降压作用，但对血压正常人无降压作用。可广泛应用于治疗心血管疾病方面的药品、保健食品和食品添加剂中。3.采用膜技术除大分子片段和盐，产品分子量稳定，纯度更高。4.本发明操作工艺简单，绿色环保，生产成本低，适合工业化生产和推广。
具体实施例方式本发明结合具体实施实例做进一步详述
实施例I :(I)牦牛乳酪蛋白加水溶解称取牦牛乳酪蛋白30g，加水500mL，调节反应温度37°C，pH8.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级；(2)加胰蛋白酶水解，胰蛋白酶添加量为I. 5g，维持反应温度30°C，pH8. 0，水解2小时；所述胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，酶活为1:2500 ；(3)灭活胰蛋白酶，升温至90°C，维持30分钟；(4)沉淀酪蛋白用5mol/L食用级盐酸调节pH到4. 6,使酪蛋白在其等电点处析出；(5)离心除沉淀4000g离心力，离心5 30分钟，除去酪蛋白沉淀，留上清液；(6)超滤取离心后上清液，过截留量3000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；(7)纳滤取超滤透过液，通过截留分子量为500Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸；(8)喷雾干燥取纳滤回流液,采用喷雾干燥机,对产品进行喷干,得到牦牛乳酪蛋白降血压肽，得干粉20. Ig,得率67% ；(9)降血压活性测定ACE抑制活性为87. 5%。对所述牦牛乳酪蛋白降血压肽进行了降血压活性测定步骤是ACE酶液50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL预冷至4°C硼酸缓冲液(pH 8. 3，IOOmmoI/L)中，4°C保持12h后4°C、20000r/min离心40min，收集上清液并4°C保。FAPGG底物溶液将FAPGG溶于100mmol/L的硼酸冲液(含300mmol/L的NaCl，pH8. 3),配制成 I. 6mmol/L 溶液。500 μ L FAPGG底物溶液与100 μ L超纯水或抑制剂ACE抑制肽或卡托普利)混匀，37°C预热2min，加入100 μ L ACE酶液开始反应，30min后立即加入IOOLDTA (IOOmmoI/L)终止反应，加入4000 μ L超纯水稀释，实验平行3次。Omin样品的测定，要先加入EDTA再加AACE酶液，其他相同。于340nm波长处分别测系在Omin和30min时的吸光度，计算差值ΔΑ(ΔΑ = AOmin 一 A30min)。以单位时间内吸光度的变化表示ACE酶活力，抑制剂对ACE的抑制程度用(2)式计算。
权利要求
1.一种牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)牦牛乳酪蛋白加水溶解，调整浓度为1% 10%，调节温度为20°C 50°C，pH6.O 9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白完全溶解； (2)加胰蛋白酶水解，维持反应温度20°C 50°C，pH6.O 9. 0，水解I 7小时； (3)灭活胰蛋白酶，升温至80°C 100°C，维持30 50分钟； (4)沉淀酪蛋白，用5mol/L食用级盐酸调节pH到3.8 4. 6,使酪蛋白在其等电点处析出； (5)离心除沉淀，4000g 12000g离心力，离心5 30分钟，留上清液； (6)超滤，用截留量3000Da的超滤膜，超滤步骤(5)所得上清液，除去大分子蛋白及多妝，收集透过液； (7)纳滤，用截留量500Da的纳滤膜，纳滤步骤(6)所得超滤液去除小分子盐和氨基酸，收集回流液； (8)对步骤(7)收集的回流液进行喷雾干燥，即得所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽。
2.如权利要求I所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征是在步骤(I)中所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白，步骤(I)中所述的牦牛乳酪蛋白加水溶解是取5 50g牦牛乳酪蛋白，加水500mL进行溶解。
3.如权利要求I所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征是在步骤(2)中胰蛋白酶，酶添加量为牦牛乳酪蛋白加入量的O. 5% 2%。
4.如权利要求I所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征是在步骤(8)中，是采用喷雾干燥机对步骤(7 )收集的回流液进行干燥的，所述喷雾干燥机进风温度为150 165°C，出风温度为65 85°C，流速300 400mL/h。
全文摘要
本发明涉及一种利用牦牛乳酪蛋白为原料制备降血压肽的方法，该方法主要技术步骤如下(1)牦牛乳酪蛋白溶解；(2)加胰蛋白酶水解；(3)灭活胰蛋白酶；(4)沉淀酪蛋白；(5)离心除沉淀；(6)超滤；(7)纳滤；(8)喷雾干燥。本发明的原料独特，工艺科学合理、简单易行，产品为纯度较高的酪蛋白降血压肽，ACE抑制活性高达70%以上，安全、无副作用，兼具营养和辅助医疗功能，可作为添加剂广泛应用于食品、保健品、药品等领域。
文档编号A61P9/12GK102787155SQ20121031549
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者何潇, 宋礼, 纪银莉, 苏艳萍, 葛静微, 谢小冬, 高维东 申请人:甘肃华羚生物技术研究中心