使用刺激免疫应答的平台技术的缀合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开从病原体比如病毒中发现的天然存在的蛋白序列产生的模板化的缀合物。在平台中，该序列被“模板化”成共有卷曲螺旋序列，以便形成适合免疫对象的双链抗原。
【专利说明】使用刺激免疫应答的平台技术的缀合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年I月26日提交的美国专利申请号61/436，582的优先权权益。该申请的内容通过参考以它们的整体并入本文。
【技术领域】
[0003]本申请涉及产生有效刺激对各种病毒疾病免疫应答的缀合物的技术。
【背景技术】
[0004]传染病比如流感每年感染数亿人。世界上，流感可影响上达5-15%的人口，估计三百万至五百万的病例为严重疾病，并且估计每年250，000至500，000人死亡。(见URLwww.who, int/mediacentre/factsheets/2003/fs21 l/en/)。其{也病毒病原体，I:匕如严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、副流感病毒和呼吸道合胞体病毒，每年造成额外的发病率和死亡率。
[0005]由于病原体中的突变，比如流感病毒恒定的抗原性漂移和周期性的抗原性转变，使得控制这些疾病复杂化。随着突变造成之前循环的流感病毒株的抗原性改变的积累，从而突变体病毒遇到不具有对抗该突变体病毒株的保护抗体的个体，疾病的传播增加。由于免疫压力造成的突变体流感病毒的快速选择需要每年开发和生产新的流感疫苗。
[0006]数位研究人员已经注意到了有效疫苗策略的需要。Nabel和Fauci在NatureMedicine, 16 (12): 1389 (2010)中对需要广泛保护性“通用的流感疫苗”进行评论。在“Template-based coile d-coil antigens elicit neutralizing antibodies tothe SARS-coronavirus,，，Journal of Structural Biology, 155:176-194 (2006)中，和在国际专利申请W02005/077103中，Tripet等描述了肽疫苗的一种方法。在“Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell responseagainst2009pandemic HlNlinfluenza virus infection,，，J.Experimental Medicine,2011年I月10日，打印前电子公开，PMID:21220454中，Wrammer等描述了与多重流感株交叉反应的中和抗体。
[0007]本发明解决了对抗病原体比如呼吸道病毒的有效疫苗的需要。本发明也解决了用单个疫苗保护免遭快速突变病原体、单个病原体的多抗原性不同毒株、或多病原体的需要。
【发明内容】
[0008]本发明包括两条肽的模板化的缀合物。如下产生缀合物:将天然存在的α螺旋表位的第一氨基酸序列改变成七残基重复序列以形成第一模板化的表位；将天然存在的α螺旋表位的第二序列改变成七残基重复序列以形成第二模板化的表位；形成两个模板化的表位的复合体以产生卷曲螺旋结构；并连接卷曲螺旋结构至载体，比如载体蛋白，以形成缀合物。在一种实施方式中，两个模板化的表位具有不同的序列。本发明也包括通过施用缀合物至对象，比如需要其的对象产生免疫应答的方法。缀合物以足够的量施用至对象以在对象中产生保护性免疫应答。在一种实施方式中，至少一个表位不衍生自流感病毒蛋白。
[0009]在一种实施方式中，缀合物包含两条多肽，即，第一多肽和第二多肽，其中每条多肽包含至少一个七残基重复序列，并且其中所述两条多肽具有小于或不大于约90%的序列同一'I"生；两条多肽之间的共价连接(covalent linkage);和载体，比如载体蛋白，其与多肽之一共价连接。在另一种实施方式中，缀合物包含两条多肽，即，第一多肽和第二多肽，其中每条多肽包含至少一个七残基重复序列，并且其中所述两条多肽具有约100%的序列同一性；两条多肽之间的共价连接；和载体，比如载体蛋白，其与多肽之一共价连接。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少两个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少三个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少四个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少五个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少六个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少七个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少八个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少九个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少十个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少十一个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少十二个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少十三个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少十四个七残基重复序列。在任何一种实施方式中，缀合物包含至少十五个七残基重复序列。在另外的实施方式中，单个另外的异亮氨酸残基紧接在最后的七残基重复序列之后存在。在另外的实施方式中，单个另外的半胱氨酸残基紧接着在最后的七残基重复序列之后存在。在任何一种实施方式中，至少一个表位不衍生自流感病毒蛋白。
[0010]在一种实施方式中，缀合物的第一多肽可包括下列形式:
[0011][ I _bj J-C jj-L-ejj-f J^gliJn,
[0012]其中[Ι-?3π-(3π-?-θπ-?.πιπ]是在第一多肽的序列中重复η次的模式或区段。每个区段或模式可以相同或不同，即，η个区段或模式任何一个中的“b”、“c”、“e”、“f”和“g”中的氨基酸独立于其他η个 区段或模式任何一个中的“b”、“c”、“e”、“f”和“g”中的氨基酸选择。每个区段中的“I”是异亮氨酸和每个区段中的“L”是亮氨酸。数字η是至少3的整数。在一些实施方式中，η是3至15的整数，包括3和15 ;g卩，η是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15。
[0013]数字i为从I至η的整数，其中i的值由其出现在区段中的位置确定。在序列中首先出现的N末端区段赋予i=l的值。对于每一个另外的区段，数字i增加1，直到C末端区段赋予i=n的值。可独立于在第一多肽的所有其他区段中每个b、C、e、f和g氨基酸和第二多肽的所有区段，选择在η个区段的每个中的每个b、c、e、f和g。在一种实施方式中，b、c、e、f和g氨基酸选自免疫应答期望对抗的病原体的I类病毒融合蛋白的α螺旋区域。在另外的实施方式中，单个另外的异亮氨酸残基紧接在最后的区段之后(即，在最后区段的C末端)存在。
[0014]在一种实施方式中，缀合物的第二多肽可包括下列形式:
[0015][I_b2i_c2i_L_e2i_f2i_g2i] η，
[0016]其中[1-b21-c21-L-e21-f2i_g2i]是在第二多肽的序列中重复η次的区段。在每个区段中的“I”为异亮氨酸和在每个区段中的“L”为亮氨酸。数字η为至少3的整数并且与第一多肽的η相同。在一些实施方式中，η为从3至15的整数，并包括3和15 ;即，η为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，并且与第一多肽的η相同。数字i为从I至η的整数，其中i的值由其出现在区段中的位置确定，从而在序列中首先出现的N末端区段赋予i=l的值，对于每一个另外的区段，i增加1，并且C末端区段赋予i=n的值。可独立于在第二多肽的所有其他区段中每个b、c、e、f和g氨基酸和第一多肽的所有区段，选择在η个区段的每个中的每个b、c、e、f和g。b、C、e、f和g氨基酸选自免疫应答期望对抗的病原体的I类病毒融合蛋白的α螺旋区域。在一种实施方式中，缀合物的第二多肽具有与缀合物的第一多肽相同的序列。在另一种实施方式中，缀合物的第二多肽具有与缀合物的第一多肽不同的序列，并且b、c、e、f和g氨基酸选自与第一多肽所选自的蛋白不同的I类病毒融合蛋白，或选自相同I类病毒融合蛋白的与第一多肽所选自的区域不同的部分。在另外的实施方式中，单个另外的异亮氨酸残基紧接在最后的区段之后(即，在最后区段的C末端)存在。在一种实施方式中，第一多肽和第二多肽长度相等。
[0017]在另一实施方式中，本发明包括下列形式的缀合物:
[0018][载体部分]_[连接体A]_[连接体Bl]_[模板化的表位1]_[表位I修饰体]
[0019][修饰体B2]-[模板化的表位2]-[表位2修饰体]
[0020]其中连接体A、连接体B1、修饰体B2、表位I修饰体和表位2修饰体任选地存在。在一些实施方式中，不存在[载体部分]。在进一步的实施方式中，缀合物可任选地包括模板化的表位I和模板化的表位2之间的另外的共价连接体C ;任选地包括表位I修饰体和表位2修饰体之间的另外的共价连接体D或任选地包含模板化的表位I和模板化的表位2之间的另外的共价连接体C以及表位I修饰体和表位2修饰体之间的另外的共价连接体D。
[0021] 在缀合物的一种实施方式中，表位I修饰体和表位2修饰体都存在并且选自亲水氨基酸、极性氨基酸和带电氨基酸。表位I修饰体和表位2修饰体每个可包括一个半胱氨酸残基，用于在模板化的表位I和模板化的表位2之间形成二硫键(这种二硫键可接着组成(comprise)表位I修饰体和表位2修饰体之间的连接体D)。表位I修饰体和表位2修饰体可以相同或不同，并且可选自-Arg、-(Arg)2、-(Arg) 3、-(Arg)4、-Lys> -(Lys)2、-(Lys) 3、-(Lys)4、- Arg-酰胺、-(Arg)2_ 酰胺、-(Arg) 3_ 酰胺、-(Arg)4_ 酰胺、-Lys-酰胺、-(Lys) 2-酰胺、-(Lys) 3_ 酰胺、-(Lys) 4_ 酰胺、-Cys>-Cys~Arg>-Cys- (Arg) 2、-Cys- (Arg)3、-CyS- (Arg) 4、-Cys_Lys、_Cys_ (Lys) 2、_Cys_ (Lys) 3、_Cys_ (Lys) 4、_Cys_ 酉先胺、-Cys-Arg-酉先胺、-Cys-(Arg)2-酉先胺、-Cys- (Arg) 3~ 酉先胺、-Cys- (Arg) 4-酉先胺、-Cys-Lys-酉先胺、-Cys- (Lys) 2_ 酉先胺、-Cys- (Lys) 3_ 酉先胺和一Cys- (Lys) 4_ 酉先胺。
[0022]当[连接体A]存在时，其可以是肽；非遗传编码的氨基酸比如正亮氨酸、α-氨基-3-胍基丙酸或丙氨酸；包括非遗传编码的氨基酸的肽。当[连接体BI]存在时，其可以是氨基酸或妝，比如_ Gly-、-Gly-Gly-、-(Gly)3_、- (Gly)4_、-Arg->-Arg-Arg->-(Arg) 3_、_ (Arg) 4->_Gly-Arg->-Gly-Gly-Arg->-Gly-Gly-Arg-Arg->-Arg-Gly-、-Arg-Arg-Gly-或一Arg-Arg-Gly-Gly-。当[修饰体B2]存在时,其可以是氨基酸或肽，比如 Gly-、Gly-Gly-、(Gly) 3_、(Gly) 4_、Arg-、Arg-Arg-、(Arg) 3_、(Arg) 4_、Gly-Arg-、Gly-Gly-Arg-> Gly-Gly-Arg-Arg-> Arg-Gly-> Arg-Arg-Gly-或-Arg-Arg-Gly-Gly-。如果[表位I修饰体]和[表位2修饰体]存在，[连接体BI]的优选部分是-Gly-Gly-并且优选地不存在[修饰体B2]。如果不存在[表位I修饰体]和[表位2修饰体]，[连接体BI]的优选部分是一Arg-Arg-Gly-Gly-并且优选地[修饰体B2]存在并且是Arg-Arg-Gly-Gly-。当存在时，[修饰体B2]可任选地在N末端氮上乙酰化(例如，乙酰基-Arg-Arg-Gly-Gly-)。
[0023]在一种实施方式中，如下选择用于产生模板化的表位I和模板化的表位2的表位:
[0024]模板化的表位I衍生自病毒株中表位的序列，而模板化的表位2衍生自相同病毒的相同毒株中的不同表位的序列；
[0025]模板化的表位I衍生自病毒株中表位的序列，而模板化的表位2衍生自相同病毒的不同毒株中的相同表位的序列；
[0026]模板化的表位I衍生自病毒株中表位的序列，而模板化的表位2衍生自相同病毒的不同毒株中的不同表位的序列；或
[0027]模板化的表位I衍生自第一病毒中表位的序列，而模板化的表位2衍生自第二不同病毒的表位的序列。
[0028]在一种实施方式中，缀合物中使用的表位或用于缀合物的修饰的或模板化的表位衍生自来自一种或多种具有I类病毒融合蛋白的病毒的I类病毒融合蛋白的干区。在一种实施方式中，一种或多种病毒选自流感A病毒株、SARS病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒5、副流感病毒4或副流感病毒3。在一种实施方式中，一种或多种病毒选自SARS病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒5、副流感病毒4或副流感病毒3。在一种实施方式中，I类病毒融合蛋白可选自流感PR8(流感A/PR/8/34 (HlNl)) HA2结构域、SARS冠状病毒S2、呼吸道合胞体病毒RSV A2F、副流感病毒3PIV3F、副流感病毒5PIV5F或副流感病毒4PIV4A F。在另一种实施方式中，I类病毒融合蛋白可选自SARS冠状病毒S2、呼吸道合胞体病毒RSVA2F、副流感病毒3PIV3F、副流感病毒5PIV5F或副流感病毒4PIV4A F。病毒蛋白的七残基重复序列区域选为待被修饰和模板化用于缀合物的表位。
[0029]用于本发明作为模板化的表位I和模板化的表位2的模板化的表位可选自:
[0030]流感PR8HA23MP (381-409)模板化的表位 3MP (IKSLQNAINGLTNKINTLIEKINILFTACRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0031 ]流感 PR8HA25P (420-448)模板化的表位 5P (IENLNKKIDDLFLDIWTLNAEILVLLENCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0032]流感PR8HA26P (448-476)模板化的表位 6P (IRTLDFHISNLKNLIEKLKSQIKNLAKECRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0033]SARS冠状病毒S2中的HRC结构域(I 151-1179)模板化的表位(ISGLNASIVNLQKEIDRLNEVIKNLNESCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0034]呼吸道合胞体病毒RSV A2F (157-185)模板化的表位(ILHLEGEINKLKSAILSLNKAIVSLSNGCRR-酰胺(SEQ ID NO:))，
[0035]呼吸道合胞体病毒RSV A2F (171-199)模板化的表位(ILSLNKAIVSLSNGISVLTSKILDLKNYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0036]呼吸道合胞体病毒RSV A2F (492-520)模板化的表位(ISQLNEKINQLLAFIRKLDELIHNLNAGCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0037]副流感病毒3PIV3F (144-172)模板化的表位(IEKLKEAIRDLNKAIQSLQSSIGNLIVACRR-酰胺(SEQ ID NO:))；[0038]副流感病毒3PIV3F (151-179)模板化的表位(IRDLNKAIQSLQSSIGNLIVAIKSLQDYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0039]副流感病毒3PIV3F (460-488)模板化的表位(INKLKSDIEELKEWIRRLNQKIDSLGNWCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0040]副流感病毒5PIV5F (130-158)模板化的表位(INELAAAILNLKNAIQKLNAAIADLVQACRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0041]副流感病毒5PIV5F (144-172)模板化的表位(IQKLNAAIADUQAIQSLGTAIQALQDHCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0042]副流感病毒5PIV5F (453-481)模板化的表位(IAALNKSISDLLQHIAQLDTYISALTSACRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0043]副流感病毒4PIV4A F (131-159)模板化的表位(IQELAKLILTLKKAITELNEAIRDLANSCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0044]副流感病毒4PIV4A F (145-173)模板化的表位(ITELNEAIRDLANSIKILVKMISALQNQCRR-酰胺(SEQ ID NO:));和
[0045]副流感病毒4PIV4A F (447-475)模板化的表位(ILDLSTDINQLNQLIKSLEDHIQRLTDYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))。在一种实施方式中，模板化的表位I和模板化的表位2不相同(当不相同的模板化的表位I和模板化 的表位2用在缀合物中时，缀合物则是杂双链缀合物)。在另一种实施方式中，仅仅模板化的表位I或模板化的表位2之一选自流感病毒表位，并且另一个模板化的表位选自不同的病毒。在另一种实施方式中，模板化的表位I和模板化的表位2相同(当相同的模板化的表位I和模板化的表位2用在缀合物中时，缀合物则是同双链缀合物)。在上面列举的任何模板化的表位的另一实施方式中，不存在两个C末端精氨酸残基。
[0046]用于本发明作为模板化的表位I和模板化的表位2的模板化的表位可选自:
[0047]SARS 冠状病毒 S2 的 HRC 结构域(I 151-1179)模板化的表位(ISGLNASIVNLQKEIDRLNEVIKNLNESCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0048]呼吸道合胞体病毒RSV A2F (157-185)模板化的表位(ILHLEGEINKLKSAILSLNKAIVSLSNGCRR-酰胺(SEQ ID NO:))，
[0049]呼吸道合胞体病毒RSV A2F (171-199)模板化的表位(ILSLNKAIVSLSNGISVLTSKILDLKNYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0050]呼吸道合胞体病毒RSV A2F (492-520)模板化的表位(ISQLNEKINQLLAFIRKLDELIHNLNAGCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0051]副流感病毒3PIV3F (144-172)模板化的表位(IEKLKEAIRDLNKAIQSLQSSIGNLIVACRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0052]副流感病毒3PIV3F (151-179)模板化的表位(IRDLNKAIQSLQSSIGNLIVAIKSLQDYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0053]副流感病毒3PIV3F (460-488)模板化的表位(INKLKSDIEELKEWIRRLNQKIDSLGNWCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0054]副流感病毒5PIV5F (130-158)模板化的表位(INELAAAILNLKNAIQKLNAAIADLVQACRR-酰胺(SEQ ID NO:))；[0055]副流感病毒5PIV5F (144-172)模板化的表位(IQKLNAAIADLVQAIQSLGTAIQALQDHCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0056]副流感病毒5PIV5F (453-481)模板化的表位(IAALNKSISDLLQHIAQLDTYISALTSACRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0057]副流感病毒4PIV4A F (131-159)模板化的表位(IQELAKLILTLKKAITELNEAIRDLANSCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；
[0058]副流感病毒4PIV4A F (145-173)模板化的表位(ITELNEAIRDLANSIKILVKMISALQNQCRR-酰胺(SEQ ID NO:));和
[0059]副流感病毒4PIV4A F (447-475)模板化的表位(ILDLSTDINQLNQLIKSLEDHIQRLTDYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))。在一种实施方式中，模板化的表位I和模板化的表位2不相同。在另一实施方式中，模板化的表位I和模板化的表位2相同。在上面列举的任何模板化的表位的另一实施方式中，不存在两个C末端精氨酸残基。
[0060]在另一实施方式中，模板化的表位1、模板化的表位2，或模板化的表位I和模板化的表位2二者可选自:
[0061]流感PR8HA23MP (381-409)模板化的表位 3MP，
[0062]流感PR8HA25P (420-448)模板化的表位 5P ；
[0063]流感PR8HA26P (448-476)模板化的表位 6P，
[0064]SARS冠状病毒S2的HRC结构域(1151-1179)模板化的表位；
[0065]呼吸道合胞体病毒RSV A2F(157-185)模板化的表位，
[0066]呼吸道合胞体病毒RSV A2F (171-199)模板化的表位；
[0067]呼吸道合胞体病毒RSV A2F (492-520)模板化的表位；
[0068]副流感病毒3PIV3F (144-172)模板化的表位；
[0069]副流感病毒3PIV3F (151-179)模板化的表位；
[0070]副流感病毒3PIV3F (460-488)模板化的表位；
[0071]副流感病毒5PIV5F (130-158)模板化的表位；
[0072]副流感病毒5PIV5F (144-172)模板化的表位；
[0073]副流感病毒5PIV5F (453-481)模板化的表位；
[0074]副流感病毒4PIV4A F(131_159)模板化的表位；
[0075]副流感病毒4PIV4A F (145-173)模板化的表位；和
[0076]副流感病毒4PIV4A F (447-475)模板化的表位
[0077]其中所选择的模板化的表位具有游离的羧基末端(即，序列没有C末端酰胺)。在一种实施方式中，模板化的表位I和模板化的表位2不相同。在另一实施方式中,仅仅模板化的表位I或模板化的表位2之一选自流感病毒表位，并且另一模板化的表位选自不同的病毒。在另一实施方式中，模板化的表位I和模板化的表位2相同。
[0078]在另一实施方式中，模板化的表位1、模板化的表位2，或模板化的表位I和模板化的表位2二者可选自:
[0079]SARS冠状病毒S2的HRC结构域(1151-1179)模板化的表位；
[0080]呼吸道合胞体病毒RSV A2F(157-185)模板化的表位，
[0081]呼吸道合胞体病毒RSV A2F (171-199)模板化的表位；[0082]呼吸道合胞体病毒RSV A2F (492-520)模板化的表位；
[0083]副流感病毒3PIV3F (144-172)模板化的表位；
[0084]副流感病毒3PIV3F (151-179)模板化的表位；
[0085]副流感病毒3PIV3F (460-488)模板化的表位；
[0086]副流感病毒5PIV5F (130-158)模板化的表位；
[0087]副流感病毒5PIV5F (144-172)模板化的表位；
[0088]副流感病毒5PIV5F (453-481)模板化的表位；
[0089]副流感病毒4PIV4A F(131_159)模板化的表位；
[0090]副流感病毒4PIV4A F (145-173)模板化的表位；和
[0091]副流感病毒4PIV4A F (447-475)模板化的表位
[0092]其中所选择的模板化的表位具有游离的羧基末端(即，序列没有C末端酰胺)。在一种实施方式中，模板化的表位I和模板化的表位2不相同。 在上面列举的任何模板化的表位的另一实施方式中，不存在两个C末端精氨酸残基。
[0093]在缀合物的另一实施方式中，
[0094]模板化的表位I是流感PR8HA23MP (381-409)模板化的表位3MP和模板化的表位2是流感PR8HA25P (420-448)模板化的表位5P。
[0095]在缀合物的另一实施方式中，
[0096]模板化的表位I是流感PR8HA23MP (381-409)模板化的表位3MP和模板化的表位2是流感PR8HA26P (448-476)模板化的表位6P。
[0097]在缀合物的另一实施方式中，
[0098]模板化的表位I是流感PR8HA25P (420-448)模板化的表位5P和模板化的表位2是流感PR8HA26P (448-476)模板化的表位6P。
[0099]在缀合物的另一实施方式中，
[0100]模板化的表位I是流感PR8HA23MP (381-409)模板化的表位3MP和模板化的表位2是SARS冠状病毒S2的HRC结构域(1151-1179)模板化的表位。
[0101]在缀合物的另一实施方式中，
[0102]模板化的表位I是流感PR8HA25P (420-448)模板化的表位5P和模板化的表位2是SARS冠状病毒S2的HRC结构域(1151-1179)模板化的表位。
[0103]在缀合物的另一实施方式中，
[0104]模板化的表位I是流感PR8HA26P (448-476)模板化的表位6P和模板化的表位2是SARS冠状病毒S2的HRC结构域(1151-1179)模板化的表位。
[0105]在缀合物的另一实施方式中，
[0106]模板化的表位I是呼吸道合胞体病毒RSV A2F (157-185)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(171-199)模板化的表位。
[0107]在缀合物的另一实施方式中，
[0108]模板化的表位I是呼吸道合胞体病毒RSV A2F (157-185)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(492-520)模板化的表位。
[0109]在缀合物的另一实施方式中，
[0110]模板化的表位I是呼吸道合胞体病毒RSV A2F (171-199)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(492-520)模板化的表位。
[0111]在缀合物的另一实施方式中，
[0112]模板化的表位I是副流感病毒3PIV3F (144-172)模板化的表位和模板化的表位2是副流感病毒3PIV3F(151-179)模板化的表位。
[0113]在缀合物的另一实施方式中，
[0114]模板化的表位I是副流感病毒3PIV3F (144-172)模板化的表位和模板化的表位2是副流感病毒3PIV3F(460-488)模板化的表位。
[0115]在缀合物的另一实施方式中，
[0116]模板化的表位I是副流感病毒3PIV3F (151-179)模板化的表位和模板化的表位2是副流感病毒3PIV3F(460-488)模板化的表位。
[0117]在缀合物的另一实施方式中，
[0118]模板化的表位I是副流感病毒3PIV3F (144-172)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(157-185)模板化的表位。
[0119]在缀合物的另一实施方式中，
[0120]模板化的表位I是副流感病毒3PIV3F (144-172)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(171-199)模板化的表位。
[0121]在缀合物的另一实施方式中，
[0122]模板化的表位I是副流感病毒3PIV3F (151-179)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(171-199)模板化的表位。
[0123]在缀合物的另一实施方式中，
[0124]模板化的表位I是副流感病毒3PIV3F (151-179)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(157-185)模板化的表位。
[0125]在缀合物的另一实施方式中，
[0126]模板化的表位I是副流感病毒5PIV5F (130-158)模板化的表位和模板化的表位2是副流感病毒5PIV5F (144-172)模板化的表位。
[0127]在缀合物的另一实施方式中，
[0128]模板化的表位I是副流感病毒5PIV5F (130-158)模板化的表位和模板化的表位2是副流感病毒5PIV5F(453-481)模板化的表位。
[0129]在缀合物的另一实施方式中，
[0130]模板化的表位I是副流感病毒5PIV5F (144-172)模板化的表位和模板化的表位2是副流感病毒5PIV5F(453-481)模板化的表位。
[0131]在缀合物的另一实施方式中，
[0132]模板化的表位I是副流感病毒5PIV5F (130-158)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(157-185)模板化的表位。
[0133]在缀合物的另一实施方式中，
[0134]模板化的表位I是副流感病毒5PIV5F (130-158)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(171-199)模板化的表位。
[0135]在缀合物的另一实施方式中，
[0136]模板化的表位I是副流感病毒5PIV5F (144-172)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(171-199)模板化的表位。
[0137]在缀合物的另一实施方式中，
[0138]模板化的表位I是副流感病毒5PIV5F (144-172)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(157-185)模板化的表位。
[0139]在缀合物的另一实施方式中，
[0140]模板化的表位I是副流感病毒4PIV4A F (131-159)模板化的表位和模板化的表位2是副流感病毒4PIV4A F(145-173)模板化的表位。
[0141]在缀合物的另一实施方式中， [0142]模板化的表位I是副流感病毒4PIV4A F (131-159)模板化的表位和模板化的表位2是副流感病毒4PIV4A F(447-475)模板化的表位。
[0143]在缀合物的另一实施方式中，
[0144]模板化的表位I是副流感病毒4PIV4A F (145-173)模板化的表位和模板化的表位2是副流感病毒4PIV4A F(447-475)模板化的表位。
[0145]在缀合物的另一实施方式中，
[0146]模板化的表位I是副流感病毒4PIV4A F (131-159)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(157-185)模板化的表位。
[0147]在缀合物的另一实施方式中，
[0148]模板化的表位I是副流感病毒4PIV4A F (131-159)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(171-199)模板化的表位。
[0149]在缀合物的另一实施方式中，
[0150]模板化的表位I是副流感病毒4PIV4A F (145-173)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(171-199)模板化的表位。
[0151]在缀合物的另一实施方式中，
[0152]模板化的表位I是副流感病毒4PIV4A F (145-173)模板化的表位和模板化的表位2是呼吸道合胞体病毒RSV A2F(157-185)模板化的表位。
[0153]在上面列举的任何模板化的表位的另外的实施方式中，不存在两个C末端精氨酸残基。
[0154]在本发明的另一种实施方式中，缀合物的载体部分是蛋白质或肽。蛋白质可以是匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、破伤风类毒素、霍乱亚单位B、来自流感嗜血杆菌(H.1nfluenza)的蛋白D或白喉类毒素。在本发明的另一实施方式中，载体部分可以是非种系选择性(promiscuous)T细胞肽表位，比如Ho P.C.等(1990), “Identification of two promiscuous T cell epitopes from tetanustoxin, ” Eur.J.1mmunol.20:477-83中公开的那些。在本发明的另一实施方式中，载体部分可以是非种系选择性人麻疹T细胞肽表位。在本发明的另一实施方式中，载体部分可以是肽 KLLSLIKGVIVHRLEGVE(SEQ ID NO:)或 Kaumaya P.T.等(2009)，“Phase I activeimmunotherapy with combination of two chimeric， human epidermal growth factorreceptor2， B—cell epitopes fused to a promiscuous T—cell epitope in patientswith metastatic and/or recurrent solid tumors，，，J.Clin.0ncol.27:5270 ;或SundaramR.等，(2002)，“Synthic Peptides as Canccer Vaccines，，，Biopolymer66:200-216 中公开的任何其他非种系选择性T细胞肽表位。在本发明的另一实施方式中，缀合物的载体部分是非蛋白部分。非蛋白部分可以是多糖，比如藻酸(藻酸盐)。在本发明的另一实施方式中，载体部分可省略。
[0155]在本发明的另一实施方式中，载体部分和连接体A(如果存在)、连接体Bl(如果存在连接体BI，并且不存在连接体A)，或模板化的表位I (如果连接体A和连接体BI都不存在)之间的连接是化学上明确的。
[0156]在缀合物的一种实施方式中，使用的模板化的表位不包括其中模板化的表位I和模板化的表位2具有相同序列的模板化的流感表位。
[0157]在缀合物的一种实施方式中，使用的模板化的表位不包括模板化的流感表位。
[0158]在本文描述的肽、表位和模板化的表位的任何一种实施方式中，在“a”或“d”位置的I个、2个或3个残基可以从所指示的残基变化。在一种实施方式中，一个“a”残基选自异亮氨酸之外的氨基酸。在一种实施方式中，两个“a”残基独立地选自异亮氨酸之外的氨基酸。在一种实施方式中，三个“a”残基独立地选自异亮氨酸之外的氨基酸。在一种实施方式中，一个“d”残基选自亮氨酸之外的氨基酸。在一种实施方式中，两个“d”残基独立地选自亮氨酸之外的氨基酸。在一种实施方式中，三个“d”残基独立地选自亮氨酸之外的氨基酸。在一种实施方式中，一个或两个“a”残基独立地选自异亮氨酸之外的氨基酸和一个“d”残基独立地选自亮氨酸之外的氨基酸。在一种实施方式中，一个“a”残基独立地选自异亮氨酸之外的氨基酸和一个或两个“d”残基独立地选自亮氨酸之外的氨基酸。
[0159]在一种实施方式中，本发明包含试剂盒，其包括组合物和在对象中使用的说明书，所述组合物包括本发明的缀合物。
[0160]在一种实施方式中，本发明包含在有需要的个体中诱导抗体应答的方法，该方法包括以足以在个体中诱导 抗体应答的量施用本文公开的任何一种缀合物至需要其的个体。在一种实施方式中，抗体应答是产生中和抗体。
【专利附图】
【附图说明】
[0161]图1是模板化的缀合物的示意图。(A)具有任选的连接体C ； (B)具有任选的连接体D ； (C)具有任选的连接体C和修饰体B2 ； (D)具有任选的连接体C、修饰体B2并且没有载体部分。
[0162]图2显示卷曲螺旋结构中残基的排列。
[0163]图3描绘天然序列(A)，用于产生3个杂双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自流感病毒PR8，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0164]图4描绘天然序列(A)，用于产生同双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0165]图5描绘天然序列(A)，用于产生3个杂双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自流感和SARS病毒的组合，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0166]图6描绘天然序列(A)，用于产生3个同双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自呼吸道合胞体病毒(RSV)，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0167]图7描绘天然序列(A)，用于产生3个杂双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自呼吸道合胞体病毒(RSV)，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。[0168]图8描绘天然序列(A)，用于产生3个同双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自副流感病毒3(PIV3)，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0169]图9描绘天然序列(A)，用于产生3个杂双链模板化的肽缀合物，⑶衍生自副流感病毒3(PIV3)，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0170]图10描绘天然序列(A)，用于产生4个杂双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自RSV和PIV3的组合，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0171]图11描绘天然序列(A)，用于产生3个同双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自副流感病毒5(PIV5)，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0172]图12描绘天然序列(A)，用于产生3个杂双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自副流感病毒5(PIV5)，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0173]图13描绘天然序列(A)，用于产生4个杂双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自RSV和PIV5的组合，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0174]图14描绘天然序列(A)，用于产生3个同双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自副流感病毒4(PIV5)，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0175]图15描绘天然序列(A)，用于产生3个杂双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自副流感病毒4(PIV5)，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0176]图16描绘天然序列(A)，用于产生4个杂双链模板化的肽缀合物，(B)衍生自RSV和PIV4的组合，(C)在具有修饰体B2的可选平台排列中。
[0177]图17描绘用于产生同-链(homo-stranded)模板肽缀合物5A和5P的模板化的流感序列，以及用于测试抗体结合的HA蛋白。
[0178]图18描绘流感抗体5A与各种HA蛋白的结合。
[0179]图19描绘流感抗体5P与各种HA蛋白的结合。
[0180]图20描绘模板化的流感序列用于产生同-链模板肽缀合物6A和6P。
[0181]图21描绘流感抗体6A与各种HA蛋白的结合。
[0182]图22描绘流感抗体6P与各种HA蛋白的结合。
[0183]图23描绘流感抗体(5A、6A、5P和6P)与HlNlHA蛋白的结合。
[0184]图24描绘流感抗体(5A、6A、5P和6P)与H5N1HA蛋白的结合。
[0185]图25描绘流感抗体(5A、6A、5P和6P)与H2N2HA蛋白的结合。
[0186]图26描绘流感抗体(5A、6A、5P和6P)与H3N2HA蛋白的结合。
[0187]图27描绘流感抗体(5A、6A、5P和6P)与H7N7HA蛋白的结合。
[0188]图28描绘用于产生同-链模板肽缀合物5A和5P和杂-链模板肽缀合物5A/5P的模板化的流感序列。
[0189]图29描绘流感抗体5P/6P与各种HA蛋白的结合。
[0190]图30描绘结合各种HA蛋白的流感抗体5P。
[0191]图31描绘结合各种HA蛋白的流感抗体6P。
[0192]图32描绘5P-6P抗体对不同肽抗原的结合。
[0193]发明详述
[0194]在一种实施方式中，本发明包括用于在对象中产生免疫应答的模板化的缀合物。
[0195]“对象”意思是脊椎动物，比如鸟类或哺乳动物，优选人类。[0196]“非遗传编码的”氨基酸是与遗传密码使用的20种氨基酸不同的氨基酸。这20种遗传编码的氨基酸是L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纟颜氨酸。本发明中使用的非遗传编码的氨基酸的例子为正亮氨酸、α-氨基-3-胍基丙酸和β-丙氨酸。
[0197]如本文所使用，“疫苗”是用于诱导个体中的免疫应答的免疫原性制剂。疫苗可具有多于一种为免疫原性的组分。疫苗可用于预防性和/或治疗性目的。疫苗不必要必须预防病毒感染。不被理论所束缚，本发明的疫苗可以以这样的方式影响个体的免疫应答:当如本文所描述的施用疫苗时，病毒感染以较少的量发生(包括根本没有发生)或改善病毒感染的生物或生理作用。
[0198]如本文所使用，术语“表位”指包含能够引起免疫应答的区域和/或包含能够特异性结合抗体的区域的分子(或分子缔合)。表位可选自，例如之前未知与抗体特异性结合的蛋白的部分。
[0199]“特异性结合”指解离常数为不大于约10_6Μ，优选地不大于约10_7Μ，更优选地不大于约10_8Μ，仍更优选地不大于约10_9Μ，再更优选地不大于约KTkiM,或可选地亲和力为至少约106/Μ，优选地至少约107/Μ，更优选地至少约108/Μ，仍更优选地至少约109/Μ，再更优选地至少约iolcl/M的结合。
[0200]物质的“有效量”或“足够量”是足以引起期望的生物作用比如有益结果——包括临床结果的量，因此，“有效量”取决于其应用的背景。在本发明的背景下，疫苗的有效量的例子是在个体中足以诱导免疫应答(例如，抗体产生)的量。有效量可以以一次或多次给药施用。
[0201]免疫应答的“刺激”或“诱导”可包括体液和/或细胞免疫应答。一方面，其指与根本没有给予疫苗时的免疫应答相比应答增加，这可源自引起应答和/或应答增强。
[0202]如本文所使用的，并如本领域所熟知的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果——包括临床结果——的方法。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓解或改善、感染程度的减小、感染的稳定状态(即，不恶化)、感染状态的改善或减轻和病毒效价的降低(无论可检测的或检测不到的)。“治疗”可也指与如果不接受治疗期望的存活相比延长存活。本领域技术人员熟知病毒感染(比如流感感染)的症状，并可包括但不限于发烧、咳嗽、流鼻涕、充血、肌肉疼、喘鸣、恶心和疲劳。
[0203]“保护性免疫应答”可包括提供有益的或期望的临床结果的任何免疫应答。在个体中提高存活率可认为是保护性免疫应答。
[0204]在某些疫苗实施方式的情况下，“宽保护性”指诱导针对不同流感病毒例如，针对多种血清学不同的流感病毒株进行保护的能力。
[0205]本领域理解“中和抗体”，并对于某些实例其指来自宿主动物的能够防止或抑制病毒感染的免疫球蛋白。对于某些实施方式，当讨论血凝素糖蛋白结构时，“干区”与流感HA蛋白的ΗΑ2结构域相关。
[0206]如本文所使用，烷基是单价饱和烃，其可以是直链的、支链的或环状的或其组合。烷基具有指定的碳原子数目，例如，C1-C12烷基可具有I个和12个之间的碳原子，或如果未指定数目，具有约I至8个碳原子。烷基的例子为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁、基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、环丙基-甲基、甲基-环丙基、戊基、环戊基、己基、环己基、庚基、环庚基、辛基和环辛基。烷基可在烷基的任何位置处连接至分子的剩余部分，其中氢可从相应的烷烃去除。
[0207]如本文所使用，杂烷基是单价饱和烃，其可以是直链的、支链的或环状的或其组合，其中基团中的一个或多个碳原子已经被杂原子取代。杂原子包括氧(-0-)、氮(优选地用C1-C8烷基，例如，-N(CH3)-取代)和硫(-S-)。杂烷基具有指定的碳原子数目，例如，C1-C12杂烷基可具有I个和12个之间的碳原子，或如果未指定数目，具有约I至约8个碳原子；不限制杂原子的数目，但优选地从I个至3个杂原子。杂烷基的例子是-0-CH2CH2-0-CH2CH2-0-。
[0208]如本文所使用，烃基是单价饱和或不饱和烃，其可以是直链的、支链的或环状的或其组合，但不包括芳基和芳族体系。烃基具有指定的碳原子数目，例如,C1-C12烃基可具有I个和12个之间的碳原子，或如果未指定数目，具有约I至8个碳原子。烃基的例子为甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、I, 3- 丁间二烯基、环丙基-甲基、甲基-环丙基、戊基、环戊基、己基、环己基、庚基、环庚基、辛基和环辛基。烃基可在烃基上任何化学上可行的位置处连接至分子的剩余部分。
[0209]如本文所使用的，除非另外指出，单数形式“一个(a，an)和“所述”包括复数参考。例如，“一个”表位包括一个或多个表位。
[0210]一般方法
[0211]除非另外指出，本发明的实施使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术，其在本领域的技术范围内。这些技术在文献中充分地阐释，比如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook 等，1989)和 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook 和Russel, 2001),(本文一起或单独地称为 “Sambrook”)。Oligonucleotide Synthesis (Μ.J.Gait，ed.，1984); AnimaI Cell Culture (R.1.Freshney, ed., 1987) ; Handbookof Experimental Immunology(D.M.ffeir&C.C.Blackwell, eds.) ;Gene TransferVectors for Mammalian Cells(J.M.Miller&M.P.Calos,eds., 1987) ;CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel 等，eds.，1987，包括至 2001 年的补充)；PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等，eds.，1994);CurrentProtocols in Immuno1gy(J.E.Coligan 等,eds., 1991) ;The ImmunoassayHandbook(D.Wild, ed., Stockton Press NY, 1994) ;Bioconjugate Techniques (GregT.Hermanson, ed., Academic Press, 1996) ;Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff, ff.H.Albert, and N.A.Staines, eds., ffeinheim:VCH Verlags gesellschaftmbH,1993), Antibodies, A Laboratory Manual, (Harlow and Lane, Cold Spring HarborPublications, New York, 1988);Using Antibodies:A Laboratory Manual(Harlow andLane, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY, 1999), CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry(Beaucage 等 eds.，John ffiley&Sons, Inc., NewYork,2000) ;Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis andProperties(Agrawal, ed., Humana Press Inc., New Jersey, 1993), Vaccines (Plotkin andOrenstein, eds., 4th ed.2004);和 Vaccines (S.Plotkin, 3rd ed.1999)。[0212]模板化的缀合物概述
[0213]在一种实施方式中，本发明包括模板化的缀合物比如，图1中显示的那些。缀合物包括第一多肽(模板化的表位I)、第二多肽(模板化的表位2)、任选的连接体A和任选的连接体B1、载体、任选的连接体C(图1A)、任选的连接体D(图1B)和任选的表位I修饰和任选的表位2修饰。下面更详细讨论这些要素的每一个。
[0214]载体
[0215]载体可与缀合物一起使用。载体的使用是任选的。可使用适合用于人类或其他哺乳动物的任何载体。一方面，用于缀合物的载体通常是蛋白比如匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、破伤风类毒素、霍乱亚单位B、来自流感嗜血杆菌的蛋白D或白喉类毒素或非蛋白部分比如多糖藻酸(藻酸盐)。另一个方面中，用于缀合物的载体是肽，比如非种系选择性T细胞肽表位，比如非种系选择性人麻疹T细胞肽表位，比如肽KLLSLIKGVIVHRLEGVE(SEQ ID NO:)。载体可增强肽表位的免疫原性。一个方面中，使用的载体是食品和药品管理局(FDA)批准的用于人类的载体。
[0216]任选的连接体A、任选的连接体BI
[0217]连接体A和连接体BI是附着至表位指定的模板化的表位I的任选组分。它们用于连接模板化的表位I以及与模板化的表位I相关联的模板化的表位2至载体蛋白。它们可提供另外的功能；例如，它们可起到间隔子的作用以确保表位复合体保持在距载体蛋白足够距离处，从而期望的肽表位的卷曲螺旋构象不被载体蛋白改变。包括非遗传编码的氨基酸，比如正亮氨酸或α -氨基-3-胍基丙酸，或可容易检测而不受遗传编码的氨基酸干扰的另一部分，提供了检测给定制剂中缀合物浓度的简单方法。
[0218]在一种实施方式中，任选的连接体A是_ CH2-C (=0)-和任选的连接体BI是-正亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-(-Nle-Gly-Gly-),其中连接体A的亚甲基共价连接至载体,连接体A的羰基共价连接至连接体BI的正亮氨酸残基的氨基，和连接体BI的C末端甘氨酸共价连接至模板化的表位I的N 末端氨基。如果模板化的表位I通过固相肽合成制备，则连接体BI可通过延伸合成物容易地并入到模板化的表位I上，以在模板化的表位I的N末端包括 Nle-Gly-Gly0
[0219]当连接体A是-CH2-C(=0)_时，其可通过使用碘代乙酸酐容易地并入，以将碘代乙酰基1-CH2-C(=0)_连接至连接体BI——如果连接体BI存在的话，或连接至模板化的表位I的N末端——如果连接体BI不存在的话。这产生1-CH2-C(=0)-Nle-Gly-Gly-[模板化的表位1]，或者如果模板化的表位2在并入连接体A之前已经连接至模板化的表位1，这产生1-CH2-C (=0)-Nle-Gly-Gly-[模板化的表位1]-[模板化的表位2]。碘代乙酰化复合体可接着与包含亲核部分的载体蛋白——比如具有游离的硫醇基的半胱氨酸残基——反应，产生[载体蛋白]-CH2-C(=0)-Nle-Gly-Gly-[模板化的表位1]-[模板化的表位2]。
[0220]可使用的其他连接(linkage)包括_00C_(CH2)n_C00--其中η是从I至12的整
数——作为连接体Α，和-Nle-Gly-Gly-作为连接体BI。化合物PGig-OOC- (CH2) n_C00H，其中PGlg是羧酸保护基比如叔丁基或苄基，可连接至-Nle-Gly-Gly-[模板化的表位I]-[模板化的表位2]，以形成PGig-OOC- (CH2)n-C00-Nle-Gly-Gly—[模板化的表位I]-[模板化的表位2]。可接着去除保护基，产生H00C-(CH2)n-C00-Nle-Gly-Gly—[模板化的表位I]-[模板化的表位2]，其可使用缩合剂比如1-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)连接至载体蛋白上的氨基。η的示例性值为η=4(己二酸连接体)或η=3(戍二酸连接体)。
[0221]可用作连接体A的另一种连接体是马来酰亚胺-(CH2)n-羧酸，形式如下:
[0222]
【权利要求】
1.一种缀合物,其包括: 两条约相等长度的模板化的α螺旋多肽，其中每条多肽包括至少两个七残基重复序列，并且其中所述多肽衍生自至少一种病毒； 所述两条多肽之间的共价连接；和 与所述多肽之一共价连接的载体蛋白； 其中第一多肽包括下列形式:
2.权利要求1所述的缀合物，其中模板化的表位I和模板化的表位2衍生自选自相同病毒的相同毒株的两个不同的表位序列。
3.权利要求1所述的缀合物，其中模板化的表位I所衍生自的所述表位序列选自病毒株，并且模板化的表位2所衍生自的所述表位序列选自相同病毒的不同毒株中的相同表位。
4.权利要求1所述的缀合物，其中模板化的表位I所衍生自的所述表位序列选自病毒株，并且模板化的表位2所衍生自的所述表位序列选自相同病毒的不同毒株中的不同表位。
5.权利要求1所述的缀合物，其中模板化的表位I所衍生自的所述表位序列选自病毒，并且模板化的表位2所衍生自的所述表位序列选自不同的病毒。
6.权利要求1-4任一项所述的缀合物，其中所述病毒是流感病毒。
7.权利要求5所述的缀合物，其中模板化的表位I和模板化的表位2中的一个衍生自选自流感病毒的序列，并且模板化的表位I和模板化的表位2中的另一个衍生自选自非流感病毒的病毒。
8.权利要求2所述的缀合物，其中模板化的表位I是
流感 PR8HA25P (420-448)模板化的表位 5P (IENLNKKIDDLFLDIWTLNAEILVLLENCRR-酰胺(SEQ ID NO:))并且模板化的表位2是流感PR8HA26P(448-476)模板化的表位6P(IRTyFH工 SNLKNLIEKLKSQIKNLAKECRR-酰胺(SEQ ID NO:))。
9.权利要求8所述的缀合物，具有下列形式: KLH-Nle-GG-1ENLNKKIDDLFLDIWTLNAEILVLLENCRR-酰胺
Ac-1RTLDFHISNLKNLIEKLKSQIKNLAKECRR-酰胺 其中KLH是匙孔血蓝蛋白，Nle是正亮氨酸，和每个链中的每个C残基之间的竖线|指示半胱氨酸二硫键。
10.权利要求8的缀合物，具有下列形式: KLH-Nle-RRGG-1ENLNKKIDDLFLDIWTLNAEILVLLENC-酰胺
Ac-RRGG-1RTLDFHISNLKNLIEKLKSQIKNLAKEC-酰胺 其中KLH是匙孔血蓝蛋白，Nle是正亮氨酸，和每条链中的每个C残基之间的竖线|指示半胱氨酸二硫键。
11.权利要求1所述的缀合物，其中所述载体部分选自蛋白质、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、破伤风类毒素、霍乱亚单位B、来自流感嗜血杆菌的蛋白D、白喉类毒素、非种系选择性T细胞肽表位、非种系选择性人麻疹T细胞肽表位、肽KLLSLIKGVIVHRLEGVE(SEQ ID NO:)、非蛋白部分、多糖或藻酸(藻酸盐)。
12.权利要求1所述的缀合物，其中所述载体部分和连接体A(如果存在)、连接体BI (在连接体A不存在的情况下如果存在)或模板化的表位I (如果连接体A和连接体BI都不存在)之间的连接是化学上明确的。
13.在有需要的对象中产生保护性免疫应答的方法，包括以足以产生所述保护性免疫应答的量施用权利要求1-12任一项所述的缀合物至对象。
14.在有需要的个体中诱导抗体应答的方法，所述方法包括以在所述个体中足以诱导抗体应答的量施用权利要求1-12任一项所述的缀合物至有需要的个体。
15.权利要求14所述的方法，其中所述抗体应答是产生中和抗体。
16.在有需要的对象中产生保护性免疫应答的方法，包括以足以产生所述保护性免疫应答的量施用权利要求1所述的缀合物至对象。
17.在有需要的个体中诱导抗体应答的方法，所述方法包括以在所述个体中足以诱导抗体应答的量施用权利要求1所述的缀合物至有需要的个体。
18.权利要求17所 述的方法，其中所述抗体应答是产生中和抗体。
【文档编号】A61K39/385GK103476427SQ201280015237
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年1月26日 优先权日:2011年1月26日
【发明者】R·S·霍奇斯, K·V·霍尔姆斯, Z·颜, W·J·哈特索克, Z·钱, B·E·B·希尔什 申请人:科罗拉多大学董事会，法人