针对cd74的人抗体和抗体-药物缀合物的制作方法

针对cd74的人抗体和抗体-药物缀合物的制作方法
【专利摘要】本文公开了与人CD74结合的分离的人单克隆抗体及相关的抗体-药物缀合物。还公开了包含抗体或抗体-药物缀合物的药物组合物，以及使用该抗体和/或抗体-药物缀合物的治疗和诊断方法。
【专利说明】针对CD74的人抗体和抗体-药物缀合物
发明领域
[0001]本发明涉及⑶74特异性抗体及其抗体-药物缀合物(ADCs)，这些抗体或ADCs的药物组合物，及其在治疗应用中的用途。
[0002]发明背景
[0003]人白细胞抗原(HLA) 11类组织相容性抗原Y链，也称HLA-DR抗原相关不变链、Ia抗原相关不变链、Ii和CD74，是一种具有短细胞质内尾巴的跨膜蛋白。CD74的主要功能是调节细胞内室中负载到主要组织相容性复合体(MHC)II类异二聚体上的肽。
[0004]细胞表面上仅表达少部分的总细胞⑶74。细胞表面的⑶74会在结合和不结合CD74抗体的情况下被非常快速地内化(Roche PA et al., PNAS1993; 90:8581-8585;HansenHJ et al., Biochem J1996;320:293-300;Ong GL et al.，Immunologyl999;98:296-302)。因此细胞表面CD74的稳态水平相当低，在单核细胞中，从每个细胞有数百个到数千个分子。
[0005]细胞表面上表达的⑶74的确切功能未知，但是研究证明⑶74发挥前炎性细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)膜受体的作用。结合⑶74的MIF通过MAPK和Akt通路激活下游信号，并促进细胞增殖和存活。这种内化很可能也受到所存在的作为辅助受体的CD44、CXCR2 或 CXCR4 的调节。
[0006]⑶74的上调已经在许多类型的癌症以及某些感染和炎症中被观察到。各种形式的人源化CD74特异性单克隆抗体，hLLl，已经被提出用于治疗CD74阳性肿瘤(Chang CH et al.,Bl ood2005;106:4308-4314;Sapra P et al., Clin CanRes2005;11:5257-5264;Stein R et al., Blood2004;104:3705-11;Govindan SV etal.J Nucl Med2000;41:2089-2097;Hertlein E et al.,Blood2010;I16:2554-2558;Stein R et al., Clin Cancer Res2009;15:2808-2817;SharkeyRM et al., J NuclMed2009;50:444-453;Lundberg BB et al., Drug Deliv2007;14:171-175;Griffiths GLet al., Int J Cancerl999;81:985-992;Griffiths GL etal., Cancer Res2003;9:6567-6571;Ochakovskaya R et al., Clin Cancer Res2001;7:1505-1510;Shih L et al., CancerTmmunol Immunother;Burton JD et al., Clin Cancer Res2004;10:6606-6611;LundbergBB et al., J Control Release2004;94:155-161)。
[0007]尽管已经取得了很多进展，但是仍然需要有改进的基于治疗抗体和ADCs用于治疗严重疾病的方法，例如改进的癌症治疗。
发明概要
[0008]本发明的一个目的是提供一种新型高特异性和有效的单克隆CD74特异性抗体和这些⑶74特异性抗体的ADC。本发明的抗体或ADC对表达⑶74的细胞上显示与本领域已经描述的抗体不同的CD74结合特征或其它效应。特别地，抗体的特征是，在与CD74抗原结合后会被快速内化，使它们适合于以ADC的形式用于治疗应用，或者用于其它快速内化有优势的应用。该新型ADC的特征是可高效杀伤表达CD74的肿瘤细胞。[0009]抗体和相应的ADC可以以多种形式提供，包括但不限于，抗体片段和双特异性抗体形式。在优选实施方案中，抗体是人抗体。
[0010]本发明的另一个目的是提供基于这些⑶74特异性抗体的ADC，用于医学用途，提供高效且选择性地导致肿瘤细胞死亡的途径。
[0011]本发明的这些和其它方面在下文将更加详细地说明。
[0012]附图简述
[0013]图1是实施例中使用的重组⑶74蛋白的氨基酸序列的图。⑶74vl和-v2, CD74del2-36vl 和-v2,以及 HisCD74vl 和 _ v2 分别相应于 SEQ ID N0S: 1-6。
[0014]图2:是本发明抗体可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列的比对结果的图。每个VH/VL序列的SEQ ID NO列举在序列右侧的圆括号内。根据MGT命名系统的互补决定区(CDR)突出显示如下:斜体序列代表CDR1，下划线序列代表CDR2，粗体序列代表CDR3。
[0015]图3:是ELISA确定的⑶74特异性抗体与代表性变体I和2同种型胞外域的重组蛋白(CD74vl和CD74v2)结合的图。所有人抗体都是通过用相关重链和轻链表达载体瞬时共转染HEK-293F细胞产生的。
[0016]图4:是FACS确定的⑶74特异性抗体与Raji细胞上的细胞⑶74结合的图。所有人抗体通过用相关重链和轻链表达载体瞬时共转染HEK-293F细胞产生。
[0017]图5:⑶74特异性抗体与食蟹猴⑶74的交叉反应性。人扁桃体(上图)和食蟹猴淋巴结(下图)用⑶74特异性抗体染色。*:生发中心；Mf:巨噬细胞;#:外套层(Mantle zone)B细胞。
[0018]图6:抗-K -ETA’-预温育的⑶74特异性抗体剂量依赖性诱导细胞死亡。显示了一次代表实验。数据显示了 用抗-K -ETA’-预温育的⑶74HuMab抗体处理两个复孔细胞的平均百分比活力。百分比活力的计算如实施例14所述。
[0019]图7:由 ELISA 确定的 CD74HuMab 抗体 005 和 006 (A)和 011 (B)及相应 ADC 与⑶73vl胞外域重组蛋白的结合。显示了一次代表性实验。
[0020]图8:由对Daudi细胞的FACS分析确定的CD74HuMab抗体005和006⑷和011 (B)及相应ADC与表面表达的CD74的结合。所示数据是从三次独立实验计算得到的平均荧光强度(MFI)。
[0021]图9:⑶74特异性ADC剂量依赖性诱导细胞杀伤。对下述每种细胞系显示了一个代表性实验=Daudi (A)，Raji (B)，M4A4 (C)和NC1-H747 (D)细胞。所示数据是用CD74特异性ADC处理的两个复孔细胞的百分比存活。
[0022]图10:⑶74特异性抗体治疗性处理SCID小鼠体内Daud1-1uc异种移植物的体内功效。带有确立的Daud1-1uc肿瘤的小鼠用⑶74特异性ADC处理。所示数据是每组的平均生物发光成像(BLI)信号土S.E.Μ.(每组η=7只小鼠)。
[0023]图11:⑶74特异性ADC治疗SCID小鼠体内Raj1-1uc异种移植物的体内功效。带有确立的Raj1-1uc肿瘤的小鼠用⑶74特异性ADC处理。所示数据是每组的平均BLI信号土 S.E.M.(每组η=7只小鼠)。
[0024]图12:⑶74特异性ADC治疗SCID小鼠体内Raj i异种移植物的体内功效。已经皮下建立Raji肿瘤的小鼠用⑶74特异性ADC处理。所示数据是每组的平均肿瘤体积土 S.E.M.(每组n=6只小鼠)。[0025]图13:CD74特异性ADC治疗SCID小鼠体内M4A4异种移植物的体内功效。已经建立M4A4肿瘤的小鼠用⑶74特异性ADC处理。所示数据是每组的平均肿瘤体积土S.E.Μ.(每组η=7只小鼠)。
[0026]图14:⑶74特异性HuMab抗体的解离速率的确定。显示了一次代表性实验。所示数据是将三个复孔的细胞与Alexa Fluor 488?染料标记的⑶74HuMab抗体温育，随后用未标记的⑶74HuMab抗体温育指定的时间间隔，而确定的平均荧光强度(MFI)。
[0027]图15 -M -⑶74HuMab抗体的时间依赖性内化和积累。每个细胞系显示了一次典型的实验结果。所示的数据是用Alexa-488-标记的抗⑶74HuMab抗体温育的三个复孔的细胞的平均荧光强度(MFI)。Daudi细胞在4°C (A)或37°C⑶用Alexa-488-标记的抗⑶74HuMab抗体温育。Raji细胞(C)和M4A4细胞⑶在37°C下温育。
[0028]图16:抗_CD74HuMab抗体预防性治疗SCID小鼠体内的Daudi Iuc异种移植物的体内功效。在对小鼠静脉内接种Daudi Iuc肿瘤后I小时内，用抗CD74HuMab抗体处理小鼠。所示数据是每组的平均BLI信号土S.E.M.(每组n=7只小鼠)。
[0029]发明详细说明`
[0030]定义
[0031 ] 术语“⑶74”和“⑶74抗原”在这里可以互换使用。除非特别指出，该术语包含人CD74的任何变体、异构体和种属同源体，其是细胞自然表达的或者在被CD74基因转染的细胞上表达。已知存在至少4种人类同种型:p43, p41, p35和pp33 (Borghese F et al., ExpertOpin Ther Targets2011; 15 (3): 237-251)。这些来自于可变转录本剪接和两个翻译起始位点。p43(也称作CD74同种型I,同种型a,或“长”;见UniProt条目P04233-1和NCBI参考序列NP001020330)含有296个氨基酸，其中残基73-296形成细胞外部分。具有同种型I的胞外部分的⑶74蛋白构建体在这里称作“变体I”或“⑶74vl”。ρ35 (也称作⑶74同种型2，同种型b或“短”;见Uniprot条目P04233-2和NCBI参考序列NP004346)由于可变剪接而缺少细胞外部分的残基209-272。具有同种型2的细胞外部分的CD74蛋白构建体在这里称作“变体2”或“⑶74v2”。p41和p33来自于一个替代翻译起始位点(下游48bp ;短16个氨基酸的蛋白)，导致变体缺少存在于这16个氨基酸内的内质网滞留信号，但是具有分别与P43和p35相同的细胞外部分。NP001020329提供了另一个同种型(也称作同种型3和同种型c)的序列，其中残基148-160被取代，残基161-296缺失。在例如NCBI参考序列XP_001099491.2和NCBI参考序列XP_002804624.1中提供了食蟹猴CD74同源体的序列。
[0032]术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的糖蛋白，由两对多肽链构成，一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链，所有四条链都通过二硫键交叉连接。免疫球蛋白的结构已经被良好表征。见例如 Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, ff., ed., 2nd ed.RavenPress, N.Y.(1989))。简而言之，每条重链通常包含一个重链可变区(这里简写为Vh或VH)和一个重链恒定区(Ch*CH)。重链恒定区通常包括三个结构域:Ch1，Ch2，和Ch3。每条轻链通常包括一个轻链可变区(这里简写为'或VL)和一个轻链恒定区。轻链恒定区通常包含一个结构域从或称CL。典型地，恒定区内氨基酸残基的编号根据Kabatet al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealthServicej National Institutes of Health, Bethesdaj MD.(1991)所述中的 EU-索引实施。VH和VL区可以进一步再分成超变性区(或超变区，其在序列上和/或结构上限定的环的形式方面具有高度可变性)，也称作互补决定区(CDR)，中间被称作框架区(FR)的更保守的区域隔开。每个Vh和\通常由三个CDR和四个FR构成，以如下的次序从氨基端向羧基端排列:FR1, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (另见 Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196，901917(1987))。
[0033]术语“抗体”或“ Ab ”，在本发明的上下文中，是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子片段或其任一个的衍生物，其能够在通常的生理条件下特异结合抗原，并具有显著的半衰期,例如至少大约30分钟，至少大约45分钟，至少大约I小时，至少大约2小时，至少大约4小时，至少大约8小时，至少大约12小时，大约24小时或更长，大约48小时或更长，大约
3、4、5、6、7或更多天，或者任何其它相关的功能限定的周期(例如足以诱导、促进、提高和/或调节与结合于抗原的抗体有关的生理响应，和/或足以使抗体招募效应器活性的时间)。免疫球蛋白分子重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体(Abs)的恒定区可以介导免疫球蛋白与 宿主组织或因子的结合，宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和补体系统的组分,例如Clq——经典补体激活途径中的第一个组分。抗体还可以是多特异性的，对两个或多个不同表位，通常是不重叠的表位，具有特异性。多特异性抗体的实例包括双特异性抗体、二价抗体和类似的抗体分子。如上所示，除非另外指出或者在上下文中明显地存在矛盾，否则这里的术语“抗体”包括抗体的保持与抗原特异结合能力的片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段，例如Fab和F(ab’ )2片段，来发挥。还应当理解，除非特别指出，否则术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、抗体样多肽如嵌合抗体和人源化抗体。所产生的抗体可以具有任何同种型。
[0034]如这里所使用的，术语“人抗体”、“人Ab ”或“HuMab ”意图包括具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点突变或者通过体内的体细胞突变引入的突变)。然而，如这里所使用的，术语“人抗体”并不意图包括如下的抗体:其中来自另一哺乳动物物种，例如小鼠，的CDR序列被嫁接到人框架序列上。
[0035]如这里所使用的，如果人抗体是从使用人免疫球蛋白序列的系统，例如通过免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或通过筛选人免疫球蛋白基因文库而获得的，并且其中所选人抗体的氨基酸序列与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，或者例如至少99%相同，则人抗体“来源于”的种系序列。典型地，在重链⑶R3之外，来源于特定人种系序列的人抗体与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列显示不超过20个氨基酸的差异，例如不超过10个氨基酸差异，例如不超过9、8、7、6或5个氨基酸差异，例如不超过4、3、2或I个氨基酸差异。
[0036]如这里所使用的，术语“单克隆抗体”、“单克隆Ab”、“单克隆抗体组合物”、“mAb”等是指具有单一分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。人单克隆抗体可以通过杂交瘤产生，其包括从转基因或转染色体非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，该B细胞具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组，并与永生细胞融合。
[0037]当在本文中使用时，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如 IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE,或 IgM)。[0038]当在本文中使用时，术语“全长抗体”是指含有在该同种型抗体中通常发现的全部重链和轻链恒定域和可变域的抗体。
[0039]当在本文中使用时，除非在上下文中有矛盾，否则术语“Fab-臂”或“臂”是指一个重链-轻链对。
[0040]当在这里使用时，除非在上下文中有矛盾，否则术语“Fe区”是指包含至少一个铰链区、一个Ch2区和一个Ch3区的抗体区域。
[0041]“缺少效应功能的抗体”或“效应功能缺陷抗体”是指这样的抗体，它激活一种或多种效应机制(例如补体活化或Fe受体结合)的能力显著降低或者没有该能力。因此，效应功能缺陷抗体介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒(CDC)的能力显著降低或者没有这些能力。这种抗体的一个实例是IgG4同种型抗体或其铰链稳定化(hinge-stabilized)形式。另一个实例是在Fe区中引入突变,其会强烈减少补体蛋白与 Fe 受体之间的相互作用。见例如 Bolt S et al., Eur J Immunol 1993, 23:403-411; Oganesyan, Acta Crys.2008, D64, 700 - 704;and Shields et al.，JBC2001, 276:6591 - 6604。
[0042]如这里所使用的，术语“效应细胞”是指如下的免疫细胞，其参与免疫响应的效应期，而不是免疫响应的认知期或活化期。实例免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(如B细胞和T细胞，包括细胞毒T细胞(CTLs))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞和粒细胞，例如中性粒细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞。一些效应细胞表达特异的Fe受体(FcRs)并进行特定的免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞能够诱导ADCC，例如自然杀伤细胞。例如，表达FcRs的单核细胞、巨噬细胞参与特异杀伤靶细胞，并向免疫系统的其它组分呈递抗原。在一些实施方案中，效应细胞可能吞噬靶抗原或靶细胞。效应细胞上特定FcR的表达可以受到体液因子例如细胞因子的调节。效应细胞能够吞噬靶抗原，或者吞噬或裂解靶细胞。
[0043]在本发明的上下文中，“ADC”是指抗体-药物缀合物，在本发明的上下文中，特别指CD74特异性抗体，其与另 一个基团缀合，如本专利申请中所述。
[0044]“CD74 抗体”、“抗-CD74 抗体'“CD74Ab，，、“CD74 特异性抗体”或“抗 _CD74Ab” 是一种如上所述的抗体，其特异结合抗原CD74。
[0045]在一个优选实施方案中，本发明的抗体是分离的。如这里所使用的，“分离的Ab ”意图指示如下的抗体，其基本上没有其它具有不同抗原特异性的抗体(例如特异结合CD74的分离抗体基本上没有特异结合除CD74之外抗原的抗体)。然后，特异结合人CD74的表位、同种型或变体的分离抗体可以和其它相关抗原，例如来自其它物种(例如CD74物种同源体)的相关抗原具有交叉反应性。而且，分离抗体可以基本上没有其它细胞材料和/或化学物。在本发明的一个实施方案中，两个或多个“分离的”具有不同抗原结合特异性的单克隆抗体被组合在良好限定的组合物中。
[0046]当在本文中使用时，在两个或多个抗体的上下文中，术语“与……竞争”或“与……交叉竞争”是指两个或多个抗体竞争结合CD74，例如结合CD74变体I和/或2。例如，实施例I中所述的构建体能够在这种测定中使用。在一个示例类型的测定中，CD74被涂布在平板上，并让其与第一抗体结合，之后添加第二种已标记抗体。如果第一抗体的存在会减少第二抗体的结合，则抗体相互竞争。当在本文中使用时，术语“彼此竞争”还意图涵盖抗体的组合，其中一种抗体会减少另一种抗体的结合，但是当抗体以相反顺序添加时则观察不到竞争。
[0047]术语“表位”的意思是能够特异结合抗体的蛋白决定簇(determinant)。表位通常由分子的表面集团构成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构型和非构型表位的区别在于，在去污剂的存在下，前者的结合消失而后者不会消失。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基和其它不直接参与结合的氨基酸残基，例如被特定抗原结合肽效果上封闭或覆盖的氨基酸残基(换言之，氨基酸残基位于特定抗原结合肽的足迹(footprint)内。
[0048]如这里所使用的，在抗体与预定抗原或表位结合的上下文中，术语“结合”是指，当通过例如表面等离子体共振(SPR)技术在BIAcOre3000装置内使用抗原的可溶形式作为配体、以抗体作为分析物进行测定时，以相当于大约10_7M或更小，例如大约10_8M或更小，例如大约10_9M或更小，大约ΙΟ,Μ或更小，或者大约10_ηΜ或更小的Kd的亲和力结合。通常，抗体与预定抗原的结合亲和力所对应的Kd值比与和预定抗原不同的或不紧密相关的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合所对应的Kd值至少低10倍，例如至少低100倍，例如至少低1，000倍，例如至少低10，000倍，例如至少低100，000倍。当抗体的Kd值非常低(即抗体具有高亲和力)时，其结合抗原的Kd值通常比对非特异性抗原的Kd值低至少10，000倍。
[0049]如这里所使用的，术语“kd”(sec—1)，是指特定Ab-抗原相互作用的解离速率常数。所述数值还称作koff值。
[0050]如这里所使用的，术语“ka” (M-1X sec—1)，是指特定Ab-抗原相互作用的结合速率常数。
[0051]如本文中所使用的，术语“KD” (M)是指指特定Ab-抗原相互作用的解离平衡速率常数。
[0052]如本文中所使用的，术语“!(/’(Μ—1)是指指特定Ab-抗原相互作用的结合平衡速率常数，并通过ka除以kd获得。
[0053]如本文中所使用的，当在CD74抗体的上下文中使用时，“内化”包括抗体从细胞表面被内化到表达CD74的细胞内部的任何机制。抗体的内化可以在间接测定中评估，所述测定通过预温育测量内化的Ab-毒素缀合物或特异与抗体特异结合的毒素的效果(例如实施例14的抗-κ-ΕΤΑ’测定)。
[0054]如本文中所使用的，术语“抑制生长”(例如指细胞，如肿瘤细胞)意图包括，与CD74抗体或ADC接触的细胞与不和CD74抗体或ADC接触的相同细胞的生长相比，生长的任何可测量的降低，例如抑制细胞培养物生长至少大约10%，20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,99%,或100%。这种细胞生长降低可以通过各种机制发生，例如内化、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)、补体依赖性细胞毒(CDC)、药物介导的细胞杀伤和/或细胞凋亡。
[0055]本发明还提供了如下的抗体，其包含实施例的抗体八区、Vl区或一个或多个⑶R的功能性变体。在CD74抗体上下文中使用的Vu Vh,或CDR的功能变体仍允许抗体保留亲本抗体至少相当比例(至少大约50%，60%, 70%, 80%, 90%, 95%或更多)的亲和力/结合力和/或特异性/选择性，在一些情况下，这种CD74抗体可能有比亲本Ab更大的亲和力、选择性和/或特异性。
[0056]这些功能变体通常与亲本Ab保持显著的序列同一性。两个序列之间的百分比同一性，是在考虑为实现两个序列最优比对而需要引入的缺口的数目和每个缺口的长度的条件下，序列所共享的相同位置的数目的函数(即％同源性=#相同位置/总#位置xlOO)。两个序列之间序列的比较和百分比同一性的确定可以使用数学算法加以实现，如下面的非限制性实例所述。
[0057]两个核苷酸序列的百分比同一性可以使用GCG软件包中的GAP程序(可以在http:"www.gcg.com 获得)确定，使用 NWSgapdna、CMP 矩阵，缺口权重为 40, 50, 60, 70,或80，长度权重为1，2，3，4，5，或6。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性还可以使用 E.Meyers 和 ff.Miller (Comput.Appl.Biosci4, 11-17 (1988))所述的算法加以确定，其已经整合在ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一'I"生可以使用Needleman和Wunsch算法(Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol.48，444-453 (1970))加以确定，其被包含在 GCG 软件包的GAP程序(可以在http://www.gcg.com获得)中，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16，14，12，10,8,6,或4，长度权重为1,2, 3,4, 5,或6。
[0058]CDR变体的序列可以基于大体保守的替换而与亲本抗体序列的CDR序列不同；例如变体中的替换有至少大约35%，大约50%或更多，大约60%或更多，大约70%或更多，大约75%或更多，大约80%或更多，大约85%或更多，大约90%或更多，(例如大约65_90%，例如大约92%，93%或94%)是保守的氨基酸替换。
[0059]CDR变体的序列可以基于大体保守的替换而与亲本抗体序列的CDR序列不同；例如变体中的替换有至少10个，例如至少9，8，7，6，5，4，3，2或I个是保守的氨基酸替换。
[0060]术语“稳定化非人IgG4抗体”是指已被修饰从而减少半分子交换(half-moleculeexchange)的IgG4抗体(见例如国际专利申请公开W02008145142,或van der NeutKolfschoten M et al.(2007) Sciencel4; 317 (5844)及其中的参考文献)。
[0061]在本发明的上下文中，保守替换可以由下面三个表中的一个或多个所反映的氨基酸类被内的替换来限 定:
[0062]用于保守替换的氨基酸类别
[0063]
【权利要求】
1.一种分离抗体，其与至少一种选自下组的抗体结合相同的人⑶74变体I和2上的表位: (a)包括含有SEQID NO: 19序列的VH区和含有SEQ ID NO:26序列的VL区的抗体[011]； (b)包括含有SEQID NO:7序列的VH区和含有SEQ ID NO:23序列的VL区的抗体[005]； (c)包括含有SEQID NO: 11序列的VH区和含有SEQ ID NO:26序列的VL区的抗体[006];和 (d)包括含有SEQID NO: 15序列的VH区和含有SEQ ID NO:26序列的VL区的抗体[008]。
2.一种抗体，其结合⑶74变体I和2，并包含选自下组的Vh⑶R3区:SEQ IDNO:22, 10，14，或 18。
3.前述任一权利要求的抗体，当如实施例11所述地测定时，该抗体 (a)以小于大约500ng/mL,小于大约400ng/mL,小于大约350ng/mL,或小于大约330ng/mL的EC5tl值与⑶74变体I的胞外域结合； (b)以小于大约400ng/mL,小于大约300ng/mL,小于大约250ng/mL,或小于大约220ng/mL的EC5tl值与⑶74变体2的胞外域结合；或
(c)(a)和(b)。
4.前述任一权利要求的抗体，当如实施例11所述进行测定时，该抗体以小于大约400ng/mL,小于大约300ng/mL,小于大约250ng/mL,或小于大约200ng/mL的EC5tl值与Raji细胞上的⑶74结合。
5.前述任一权利要求的抗体，其与食蟹猴CD74结合。
6.前述任一权利要求的抗体，其在与细胞表面上表达的CD74结合之后被内化。
7.权利要求6的抗体，其中所述细胞是Raji细胞。
8.前述任一权利要求的抗体，其在如实施例14所述进行测定时,在抗kappaETA’测定中诱导杀伤Raji细胞的EC5tl值小于大约60ng/mL,小于大约40ng/mL,小于大约30ng/mL,或大约25ng/mL或者更低。
9.前述任一权利要求的抗体，其在O°C下的解离速率为0.02-1.0mirT1, 0.03-大约0.30min_1, 0.04-0.10 或者 0.15-0.SOmirT1。
10.前述任一权利要求的抗体，其包括:包含⑶Rl、2和3序列SEQID NO: 24、AAS和SEQ ID NO:25 的 Vl 区，以及 a)包含CDRU2 和 3 序列 SEQ ID N0:20、21 和 22 的 Vh 区(011)； b)包含CDRl、2 和 3 序列 SEQ ID NO:8、9 和 10 的 Vh 区(005)；
c)包含CDRU2 和 3 序歹Ij SEQ ID NO: 12、13 和 14 的 Vh 区(006)； d)包含CDRl、2 和 3 序列 SEQ ID NO: 16、17 和 18 的 Vh 区(008);或 e)任一所述抗体的变体，该变体优选在Vh和/或\区中具有最多1、2或3个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如所述序列中的保守氨基酸替换。
11.根据前述任一权利要求的抗体，其包含这样的Vh区，所述Vh区 a)与选自SEQ ID NOS: 7, 11，15和19的Vh区序列具有至少80%同一性，例如至少90%，至少95%，或至少98%，或100%同一性，或者 b)与选自SEQ ID NOS: 7, 11，15和19的Vh区序列相比，具有最多20个，例如15或10或5、4、3、2或I个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
12.根据前述任一权利要求的抗体，其包含这样的\区，所述\区 a)与选自SEQID N0S: 23和26的\区序列具有至少80%同一性，例如至少90%，至少95%，或至少98%，或100%同一性，或者 b)与选自SEQID N0S:23和26的Vl区序列相比，具有最多20个，例如15或10或5、4、3、2或I个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
13.一种抗体，其结合⑶74变体I和2，并且包括: (a)包含SEQID NO: 19序列的Vh区和包含SEQ ID N0:26序列的Vl区[011]； (b)包含SEQID NO:7序列的Vh区和包含SEQ ID N0:26序列的Vl区[005/011]； (c)包含SEQID NO:7序列的Vh区和包含SEQ ID NO:23序列的Vl区[005]； (d)包含SEQID NO: 11序列的Vh 区和含有SEQ ID NO:26序列的Vl区[006];或 (e)包含SEQID NO: 15序列的VHg和含有SEQ ID N0:26序列的八区[008]。
14.前述任一权利要求的抗体，其是人单克隆抗体。
15.前述任一权利要求的抗体，其具有选自IgGl和IgG4的同种型。
16.前述任一权利要求的抗体，其与治疗模块缀合。
17.权利要求16的抗体，其通过附接于该抗体中的巯基残基的接头与所述治疗模块缀合，所述巯基残基是该抗体的至少部分还原获得的。
18.权利要求16和17中任一项的抗体，其中所述治疗模块是细胞毒性模块、放射性同位素、化疗剂、裂解肽或细胞因子。
19.权利要求18的抗体，其与细胞毒性模块缀合。
20.权利要求19的抗体，其中细胞毒性模块选自下组:紫杉醇；细胞松弛素B;短杆菌肽D ;溴化乙锭；依米丁 ；丝裂霉素；依托泊苷；替尼泊苷；长春新碱；长春碱；秋水仙碱；多柔比星；柔红霉素；二羟基炭疽菌素二酮；美登素或其类似物或衍生物；auriStatin或其功能性肽类似物或衍生物如单甲基auristatin E(MMAE)或F(MMAF);多拉司他汀10或15或其类似物；伊立替康或其类似物；米托蒽醌；光神霉素；放线菌素D ；1-脱氢睾酮；糖皮质激素；普鲁卡因；地卡因；利多卡因；普萘洛尔；嘌呤霉素；卡里奇霉素或其类似物或衍生物；抗代谢药物如氨甲喋呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷，氟达拉滨，5-氟尿喃唳，氮烯咪胺，羟基脲，天冬酰胺酶，吉西他滨，或克拉屈滨；烧化剂如氮芥，thioepa,苯丁酸氮芥，美法仑，卡莫司汀(BSNU)，洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链唑霉素，达卡巴嗪(DTIC)，丙卡巴肼，丝裂霉素C ;钼衍生物如顺钼或卡钼；duocarmycinA (duocarmycin A)，duocarmycin SA (duocarmycin SA)，rachelmycin (CC-1065)，或其类似物或衍生物；抗生素如放线菌素D，博莱霉素，柔红霉素，多柔比星，伊达比星，光神霉素，丝裂霉素，米托蒽醌，普卡霉素，氨茴霉素(AMC);吡咯并[2，l-c][l，4]_苯并二氮卓类药物(PDB);白喉毒素及相关分子如白喉毒素A链及其活性片段和杂交分子，蓖麻毒蛋白毒素例如蓖麻毒蛋白A或去糖基化的蓖麻毒蛋白A链毒素,霍乱毒素,志贺样毒素如SLT I, SLTII，SLT IIV, LT毒素，C3毒素,志贺毒素，百日咳毒素，破伤风毒素，大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂，假单胞菌外毒素，alorin，皂草素，蒴莲根毒素，gelanin，相思豆毒蛋白A链，蒴莲根毒素A链，α-帚曲霉毒素，油桐蛋白，石竹素蛋白，美洲商陆蛋白如PAPI，PAPII和PAP-S,苦瓜抑制物,麻疯树毒蛋白，巴豆毒蛋白，肥阜草(sapaonaria officinali)抑制物，白树毒素，mitogellin,局限曲菌素,酹霉素,和依诺霉素毒素；核糖核酸酶(RNA酶);DNA酶I，葡萄球菌肠毒素A ;商陆抗病毒蛋白；白喉毒素毒素和假单胞菌内毒素。
21.权利要求19的抗体，其与选自下组的细胞毒模块缀合:蒽环类抗生素，吡咯并[2, 1-c] [1, 4]-苯并二氮卓类药物，美登素，卡里奇霉素，duocarmycin, rachelmycin(CC-1065),多拉司他汀10或15,伊立替康,单甲基auristatin E和单甲基auristatin F,或其类似物、衍生物或前药。
22.权利要求19的抗体，其中细胞毒性模块是auristatin或其功能肽类似物或衍生物，其任选地通过附接于该抗体中一个或多个半胱氨酸残基的接头与该抗体缀合。
23.权利要求19的抗体，其与MMAE(式I)缀合。
24.权利要求19的抗体，其与vcMMAE(式IV)缀合。
25.权利要求19的抗体，其与MMAF(式II)缀合。
26.权利要求19的抗体，其与vcMMAF(式III)或mcMMAF(式V)缀合。
27.权利要求16-26中任一项的抗体，其在如实施例18所述进行测定时，诱导杀伤Raji, Daudi或M4A4细胞的IC5tl值小于大约0.5 μ g/mL,小于大约0.3 μ g/mL,小于大约0.2 μ g/mL,或小于大约 0.1 μ g/mL。
28.权利要求18的抗体，其与选自下组的细胞因子缀合:IL-2、IL-4、IL_6、IL-7、IL-10、 IL-12、 IL-13、 IL-15、 IL-18、 IL-23、 IL-24、 IL-27、 IL_28a、 IL_28b、 IL-29、 KGF、IFNa、IFNβ、IFN gamma、GM-CSF、CD40L、Flt3 配体、干细胞因子、安西司亭、和 TNFa。
29.前述任一权利要求的抗体，其是多特异性抗体，包括如前述任一权利要求定义的抗体的第一抗原结合区，和至少一个具有不同结合特异性的第二抗原结合区。
30.权利要求29的抗体，其是一种双特异性抗体，任选地，其中第二抗原结合区对人效应细胞例如人T细胞上的抗原具有结合特异性。
31.权利要求29和30中任一项的抗体，其是双特异性抗体，其中 第一抗原结合区与第一 Fe区连接，所述第一 Fe区在选自下组的位置处具有氨基酸替换:366，368，370，399，405，407和409，第二抗原结合区与第二 Fe区连接，所述第二 Fe区在选自下组的位置处具有氨基酸替换:366，368，370, 399，405, 407和409，并且 所述第一和第二 Fe区不在相同的位置具有替换。
32.—种抗独特型抗体，其针对前述任一权利要求的抗体，任选地针对根据权利要求13的抗体。
33.一种表达载体,其包含编码一种或多种选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列:SEQID NOS:7, 11，15，19，23 和 26，或其任意组合。
34.根据权利要求34的表达载体，其还包含编码人抗体轻链恒定区、人抗体重链恒定区、或两者的核苷酸序列。
35.一种重组真核或原核宿主细胞,其产生权利要求1-16或18-32中任一项的抗体。
36.一种药物组合物，其包括权利要求1-32中任一项的抗体和药学可接受的载体。
37.权利要求1-32中任一项的抗体，供用作药物。
38.权利要求1-32中任一项的抗体，供用于癌症治疗。
39.权利要求1-32中任一项的抗体，其用于癌症预防。
40.用于权利要求39的抗体，其中所述癌症预防包括如下的一种或多种:减少癌症发生的风险，减少癌症进展的风险，和/或减少缓解过程中癌症复发的风险。
41.用于权利要求37-40中任一项的抗体，其中所述癌症选自下组:乳腺癌，结直肠癌，子宫内膜/宫颈癌，胃癌，头颈癌，肺癌，恶性胶质瘤，恶性黑色素瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肾癌，肝癌，胸腺癌，恶性纤维组织肉瘤，听神经鞘瘤，垂体腺瘤和腺瘤。
42.用于权利要求37-40中任一项的抗体，其中所述癌症选自下组:恶性淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)，急变期的慢性粒细胞白血病(CML)，非何杰金氏淋巴瘤(NHL),多发性骨髓瘤(丽)，单核细胞样B细胞淋巴瘤(MBCL)，毛细胞白血病(HCL)，和T细胞淋巴瘤。
43.用于权利要求42的抗体，其中所述癌症是NHL。
44.用于权利要求42的抗体，其中所述癌症是MM。
45.用于权利要求41的抗体，其中所述癌症是卵巢癌。
46.用于权利要求41的抗体，其中所述癌症是乳腺癌。
47.用于权利要求41的抗体，其中所述癌症是胰腺癌。
48.用于权利要求41的抗体，其中所述癌症选自前列腺癌、胃癌和结直肠癌。
49.用于权利要求37的抗体，其供用于治疗自身免疫性疾病。
50.用于权利要求37-49中任一项的抗体，其与至少一种其他治疗剂组合。
51.权利要求50的抗体，其中该至少一种其他治疗剂选自下组:第二种抗体或ADC;化疗剂；血管发生、新生血管化和/或其它血管化的抑制剂；抗癌免疫原；细胞因子或趋化因子；细胞周期控制或细胞凋亡调节剂；激素调节剂；抗无反应性剂；含肿瘤抑制基因的核酸或载体；抗癌核酸；病毒或病毒蛋白；免疫系统细胞；分化诱导剂；CD74上调剂；抗炎、免疫抑制和/或免疫调节剂；或其任何组合。
52.用于权利要求51的抗体，其中至少一种治疗剂选自下组:⑶20特异性抗体、⑶138特异性抗体、CD38特异性抗体、抗VEGF-A抗体、美法仑、来那度胺、硼替佐米、氟尿嘧啶、吉西他滨、伊立替康、顺钼，或其衍生物或类似物。
53.权利要求1-32中任一项的抗体用于制造治疗癌症的药物的用途。
54.权利要求53的用途，其包含权利要求36-52中任一项的附加特征。
55.一种用于诱导表达CD74的细胞的死亡、抑制其生长和/或抑制其增殖的方法，包括施用权利要求16-29中任一项的抗体。
56.—种用于治疗权利要求37-52中任一项的疾病的方法,所述方法通过向有需要的个体施用有效量的根据权利要求1-32中任一项的抗体，任选地与根据权利要求51和52中任一项的其他治疗剂组合来进行。
【文档编号】A61P35/00GK103458930SQ201280015984
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年2月1日 优先权日:2011年2月1日
【发明者】S.弗普洛根, M.奥弗迪克, R.V.迪杰库伊曾, W.K.布里克, P.v.伯克尔, P.帕伦, S.里斯比 申请人:根马布股份公司