T细胞活化性双特异性抗原结合分子的制作方法

T细胞活化性双特异性抗原结合分子的制作方法
【专利摘要】本发明一般涉及用于T细胞活化和对特定靶细胞重定向的新颖双特异性抗原结合分子。另外，本发明涉及编码这类双特异性抗原结合分子的多核苷酸，和包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明双特异性抗原结合分子的方法，以及在疾病治疗中使用这些双特异性抗原结合分子的方法。
【专利说明】T细胞活化性双特异性抗原结合分子
发明领域
[0001]本发明一般涉及用于活化T细胞的双特异性抗原结合分子。另外，本发明涉及编码这类双特异性抗原结合分子的多核苷酸，以及包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明双特异性抗原结合分子的方法，以及在疾病治疗中使用这些双特异性抗原结合分子的方法。
[0002]发明背景
[0003]在多种临床背景中经常期望选择性破坏个别细胞或特定细胞类型。例如，特异性破坏肿瘤细胞而使健康细胞和组织保持完整且未受损是癌症治疗的首要目的。
[0004]实现这点的一种有吸引力的方式是通过诱导针对肿瘤的免疫应答，使得免疫效应细胞如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击并破坏肿瘤细胞。CTL构成免疫系统最有力的效应细胞，然而它们不能通过由常规治疗性抗体的Fe域介导的效应器机制来激活。
[0005]在此方面，双特异性抗体在最近数年已变得感兴趣，其设计为用一个“臂”结合靶细胞上的表面抗原，而用第二个“臂”结合T细胞受体(TCR)复合物的活化性、不变的组分。这类抗体对其两种靶物的同时结合将迫使靶细胞与T细胞之间的暂时相互作用，从而导致任何细胞毒性T细胞的活化和靶细胞的随后裂解。因此，免疫应答被重定向(re-direction)于靶细胞，且并不依赖于靶细胞的肽抗原呈递或T细胞的特异性，如对于CTL的正常MHC限制性激活会相关的。在此背景中，CTL仅在靶细胞向其呈递双特异性抗体时被激活，即模拟免疫突触是至关重要的。特别期望的是不需要淋巴细胞预条件化或共刺激以引发靶细胞的有效裂解的双特异性抗体。
[0006]已开发出数种双特异性抗体形式并研究了其对研究的T细胞介导的免疫疗法的适宜性。其中，已非常好地表征了所谓的BiTE(双特异性T细胞衔接物(engager))分子，而且其在临床中已显示出一些前景(综述于Nagorsen和Biiuerle, Exp Cell Res317, 1255-1260(2011))。BiTE 是串联 scFv 分子，其中两个
scFv分子通过柔性接头融合。针对T细胞衔接评估的其他双特异性形式包括双抗体(Holliger 等，Prot Eng9, 299-305 (1996))及其衍生物，如串联双抗体(Kipriyanov等，J Mol Biol293，41-66 (1999))。一项最近的进展是所谓的DART (双重亲和力重新革巴向)分子，其基于双抗体形式但特征在于实现额外的稳定化的C端二硫桥(Moore等，Bloodll7，4542-51 (2011))。所谓的triomab (其为完整杂合小鼠/大鼠IgG分子且目前亦在临床试验中评估)代表了尺寸更大的形式(综述于Seimetz等，Cancer TreatRev36, 458-467(2010))。
[0007]正在开发的多种形式显示免疫疗法中归因于T细胞重定向和活化的极大潜力。然而，生成对此合适的双特异性抗体的任务绝不是微不足道的，而是牵涉到许多必须满足的与抗体功效、毒性、适用性和生产能力有关的挑战。
[0008]小构建体如例如BiTE分子(尽管能够有效交联效应器和靶细胞)具有非常短的血清半衰期，从而需要通过连续输注对患者施用它们。在另一方面，IgG样形式(尽管具有长半衰期的极大益处)受制于与IgG分子固有的天然效应器功能有关的毒性。它们的免疫原性潜力构成了成功治疗性开发的IgG样双特异性抗体(特别是非人形式)的另一个不利特征。最后，双特异性抗体的一般开发中的一项主要挑战是以临床充足的量和纯度生产双特异性抗体构建体，这是由于具有不同特异性的抗体重链和轻链在共表达后的错配所致，其降低了正确装配的构建体的产率且导致许多无功能的副产物，而期望的双特异性抗体可能难以与之分离。
[0009]鉴于与目前可获得的双特异性抗体有关的关于T细胞介导的免疫疗法的难点和缺点，仍然存在对这类分子的新的改进形式的需要。本发明提供设计用于T细胞活化和重定向的双特异性抗原结合分子，其组合了良好的功效和生产能力与较低毒性和有利的药动学特性。
[0010]发明概述
[0011]在第一方面，本发明提供了一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含第一和第二抗原结合模块以及由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fe域，所述抗原结合模块中一种是能够特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子，所述抗原结合模块中另一种是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子；其中所述第一抗原结合模块是(a)单链Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链由肽接头连接,或(b)交换(crossover)Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区是交换的。
[0012]在一个具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子中存在不超过一个能够特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块(即T细胞活化性双特异性抗原结合分子提供对活化性T细胞抗原的单价结合)。在具体的实施方案中，第一抗原结合模块是交换Fab分子。在甚至更具体 的实施方案中，第一抗原结合模块是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的恒定区是交换的。
[0013]在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合模块彼此融合，任选地经由肽接头融合。在一个这类实施方案中，第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在另一个这类实施方案中，第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在又一个这类实施方案中，第二抗原结合模块在Fab轻链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab轻链的N端。在其中第一抗原结合模块是交换Fab分子且其中(i)第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端或(ii)第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端的实施方案中，另外，第一抗原结合模块的Fab轻链和第二抗原结合模块的Fab轻链可以彼此融合，任选地经由肽接头融合。
[0014]在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至Fe域的第一或第二亚基的N端。在另一个实施方案中，第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fe域的第一或第二亚基的N端。
[0015]在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fe域的亚基之一的N端。
[0016]在某些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含第三抗原结合模块，其为能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子。在一个这类实施方案中，所述第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fe域的第一或第二亚基的N端。在一个具体的实施方案中，所述活化性T细胞抗原结合分子的第二和第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fe域的亚基之一的N端，且所述第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在另一个具体的实施方案中，所述活化性T细胞抗原结合分子的第一和第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fe域的亚基之一的N端，且所述第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述第一抗原结合模块的Fab重链的N端。所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分可直接融合或经由合适的肽接头融合。在一个实施方案中，所述第二和第三抗原结合模块和Fe域是免疫球蛋白分子的一部分。在一个具体的实施方案中，所述免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更具体的实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。
[0017]在一个具体的实施方案中，Fe域是IgG Fe域。在一个特定的实施方案中，所述Fe域是IgG1Fc域。在另一个特定的实施方案中,所述Fe域是IgG4Fc域。在一个甚至更特定的实施方案中，所述Fe域是IgG4Fc域，其包含氨基酸取代S228P (Kabat编号)。在具体的实施方案中，所述Fe域是人Fe域。
[0018]在具体的实施方案中，所述Fe域包含促进第一和第二 Fe域亚基联合的修饰。在一个特定的这类实施方案中，在所述Fe域的第一亚基的CH3域中，氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在所述第一亚基的CH3域内生成隆起，其可安置于所述第二亚基的CH3域内的空穴中，而且在所述Fe域的第二亚基的CH3域中，氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在所述第二亚基的CH3域内生成空穴，其中可安置所述第一亚基的CH3域内的隆起。
[0019]在一个具体的实施方案中，相比于天然IgGlFc域,所述Fe域展现出降低的对Fe受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在某些实施方案中，相比于非工程化Fe域，所述Fe域被工程化为具有 降低的对Fe受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个实施方案中，所述Fe域包含一处或多处氨基酸取代，其降低对Fe受体的结合和/或效应器功能。在一个实施方案中，所述Fe域中一处或多处降低对Fe受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代在选自下组的一个或多个位置处:L234、L235和P329(Kabat编号方式)。在具体的实施方案中，所述Fe域的每个亚基包含三处降低对Fe受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为L234A、L235A和P329G。在一个这类实施方案中，所述Fe域是IgG1Fc域，具体为人IgG1Fc域。在其他实施方案中，所述Fe域的每个亚基包含两处降低对Fe受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为L235E和P329G。在一个这类实施方案中，所述Fe域是IgG4Fc域，具体是人IgG4Fc域。
[0020]在一个实施方案中，所述Fe受体是Fe Y受体。在一个实施方案中，所述Fe受体是人Fe受体。在一个实施方案中,所述Fe受体是活化性Fe受体。在一个特定的实施方案中，所述Fe受体是人Fe Y RIIa, Fe Y RI和/或Fe Y RIIla。在一个实施方案中，所述效应器功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
[0021]在一个具体的实施方案中，双特异性抗原结合分子能够结合的活化性T细胞抗原是CD3。在其他实施方案中，双特异性抗原结合分子能够结合的靶细胞抗原是肿瘤细胞抗原。在一个实施方案中，所述靶细胞抗原选自下组:黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CD 19、CD20 和 CD33。
[0022]依照本发明的另一个方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段。本发明还涵盖由本发明多核苷酸编码的多肽。本发明还提供包含本发明的分离的多核苷酸的表达载体，以及包含本发明的分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞，具体为哺乳动物细胞。
[0023]在另一个方面，提供一种生成本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其包括以下步骤:a)在适合于表达所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞和b)回收所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子。本发明还涵盖由本发明的方法生成的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
[0024]本发明进一步提供一种药物组合物，其包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和药学可接受载体。
[0025]本发明还涵盖使用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和药物组合物的方法。在一个方面，本发明提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或药物组合物，其用作药物。在一个方面，提供依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或药物组合物，其用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个特定的实施方案中，所述疾病是癌症。
[0026]还提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在制备用于治疗有此需要的个体中疾病的药物的用途；以及一种治疗个体中疾病的方法，包括对所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学可接受形式的依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个特定的实施方案中，所述疾病是癌症。在任一个上文实施方案中，个体优选为哺乳动物，特别是人。
[0027]本发明还提供用于诱导靶细胞特别是肿瘤细胞裂解的方法，其包括在存在T细胞(特别是细胞毒性T细胞)的情况`下使靶细胞与本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子接触。
[0028]附图简述
[0029]图1。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的例示性构造。㈧“1+lIgGscFab，l个臂”和(B) “1+lIgG scFab，I个臂倒转”分子的示图。在“1+lIgG scFab, I个臂”分子中，T细胞靶向性Fab的轻链通过接头融合至重链，而“1+lIgG scFab, I个臂倒转”分子具有在肿瘤靶向性Fab中的接头。(C) “2+lIgG scFab”分子的示图。(D) “1+lIgGscFab” 分子的示图。(E) “1+lIgG Crossfab” 分子的示图。(F) ^2+1 IgG Crossfab” 分子的示图。(G) ^ 2+1 IgG Crossfab”分子的示图，其具有Crossfab和Fab组分(“倒转”)的交替(alternative)次序。(H) “1+lIgG Crossfab轻链(LC)融合”分子的示图。(I) “Ι+lCrossMab”分子的示图。(J) ^2+1 IgG Crossfab，连接的轻链”分子的示图。(K) “1+lIgG Crossfab，连接的轻链”分子的示图。(L) “2+lIgGCrossfab，倒转、连接的轻链”分子的示图。(M) “1+lIgG Crossfab，倒转、连接的轻链”分子的示图。黑点:Fe域中促进异二聚化的任选修饰。
[0030]? 2o "1+lIgG scFab，l 个臂”(抗 MCSP/抗 huCD3)(见 SEQ ID N01, 3,5)，非还原性(A)和还原性(B)，以及“ 1+lIgG scFab, I个臂倒转”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ IDN07, 9，11)，非还原性(C)和还原性(D)的 SDS PAGE (4-12%Bis/Tris, NuPage Invitrogen,考马斯染色)。
[0031]图3。“1+lIgG scFab, I 个臂”(抗 MCSP/ 抗 huCD3)(见 SEQ ID N01, 3，5) (A)和“1+lIgG scFab，l个臂倒转”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID N07, 9, 11) (B)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare; 2mMM0PS ρΗ7.3, 150mM NaCl, 0.02%(w/v)NaCl ;注射50yg样品)。
[0032]图40“l+lIgG scFab，I 个臂”(抗 EGFR/抗 huCD3)(见 SEQ ID N043, 45，57)，非还原性(A)和还原性(B)，以及“1+lIgG scFab, I个臂倒转”(抗EGFR/抗huCD3)(见SEQ ID N011, 49，51)，非还原性(C)和还原性(D)的 SDS PAGE(4-12%Bis/Tris, NuPageInvitrogen,考马斯染色)。
[0033]图5。“1+1砂 scFab，l个臂”(抗EGFR/抗huCD3)(见 SEQ ID N043, 45, 47) (A)和^ 1+1 IgG scFab，l个臂倒转”(抗EGFR/抗huCD3)(见SEQ ID N011,49, 51) (B)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare; 2mM MOPS ρΗ7.3，150mM NaCl, 0.02% (w/v)NaCl ;注射 50yg 样品)。
[0034]图6。(A, B) “1+lIgG scFab, I 个臂倒转”(抗 FAP/ 抗 huCD3)(见 SEQID N011, 51, 55),非还原性(A)和还原性(B)的 SDS PAGE (4-12%Bis/Tris，NuPageInvitrogen,考马斯染色)。(C) “1+lIgG scFab, I 个臂倒转”(抗 FAP/抗 huO)3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare; 2mM MOPS pH7.3, 150mMNaCl，0.02%(w/v)NaCl ; 注射 50 μ g 样品)。
[0035]图 7。(A) ^2+1 IgG scFab, P329G LALA” (抗 MCSP/ 抗 huCD3)(见 SEQ IDN05，21，23)，非还原性(第 2 道)和还原性(第 3 道);(B)“2+lIgG scFab，LALA”(抗 MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID N05, 17，19)，非还原性(第2道)和还原性(第3道)；(C) “2+1 IgGscFab, wt”(抗 MCSP/ 抗 huCD3)(见 SEQ ID N05, 13，15)，非还原性(第 2 道)和还原性(第 3道);以及(D) ^ 2+1 IgG scFab, P329G LALA N297D”(抗 MCSP/抗 huCD3)(见 SEQ IDN05，25，27)，非还原性(第 2道)和还原性(第 3 道)的 SDS PAGE (4-12%B i s/Tr i s, NuPageInvitrogen,考马斯染色)。
[0036]图 8。(A) ^2+1 IgG scFab, P329G LALA” (抗 MCSP/ 抗 huCD3)(见 SEQ IDN05, 21，23) ； (B) ^2+1 IgG scFab, LALA，，(抗 MCSP/ 抗 huCD3)(见 SEQ ID N05, 17，19)；(C) ^2+1IgG scFab, wt” (抗 MCSP/ 抗 huCD3)(见 SEQ ID N05, 13，15) ； (D) ^2+1IgGscFab, P329G LALA N297D”(抗 MCSP/抗 huCD3)(见 SEQ ID N05, 25, 27)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare; 2mM MOPS ρΗ7.3，150mM NaCl, 0.02%(w/v)NaCl ;注射50yg样品)。
[0037]图 9。(A, B) “2+lIgG scFab, P329G LALA” (抗 EGFR/ 抗 huCD3)(见 SEQID N045, 47, 53),非还原性(A)和还原性(B)的 SDS PAGE (4-12%Bis/Tris，NuPageInvitrogen,考马斯染色)。(C) “2+1 IgG scFab, P329G LALA，，(抗 EGFR/ 抗 huCD3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare; 2mM MOPS pH7.3, 150mMNaCl，0.02%(w/v)NaCl ;注射 50 μ g 样品)。
[0038]图 10。(A, B) “2+lIgG scFab, P329G LALA” (抗 FAP/ 抗 huCD3)(见 SEQID N057, 59, 61),非还原性(A)和还原性(B)的 SDS PAGE (4-12%Bis/Tris，NuPageInvitrogen,考马斯染色)。(C) “2+1 IgG scFab, P329G LALA” (抗 FAP/ 抗 huCD3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare; 2mM MOPS pH7.3, 150mMNaCl，0.02%(w/v)NaCl ;注射 50 μ g 样品)。
[0039]图 11。(A，B)“l+lIgG Crossfab, Fe (孔)P329G LALA/Fc (突出)wt”(抗 MCSP/抗huCD3)(见 SEQ ID N05, 29，31，33)，非还原性(A)和还原性(B)的 SDS PAGE (4_12%Tris_ 乙酸盐(A)或 4-12%Bis/Tris (B), NuPage Invitrogen,考马斯染色)。(C) “1+lIgGCrossfab, Fe (孔)P329G LALA/Fc (突出)wt”(抗MCSP/抗huCD3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GEHealthcare;2mM MOPS pH7.3, 150mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl ;注射50 μ g样品)。[0040]图 12。(A，B)“2+lIgG Crossfab”(抗MCSP/抗huCD3)(见 SEQ ID N03, 5，29，33)，非还原性(A)和还原性(B)的 SDS PAGE (4-12%Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯蓝染色)。(C)^2+1IgG Crossfab”(抗MCSP/抗huCD3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GLGE Healthcare ;2mM MOPS ρΗ7.3, 150mM NaCl, 0.02%(w/v) NaCl ;注射 50yg 样品)。
[0041]图 13。(A，B)“2+lIgG Crossfab”(抗MCSP/抗 cyCD3)(见 SEQ ID N03, 5，35，37)，非还原性(A)和还原性(B)的 SDS PAGE (4-12%Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。(C)^2+1IgG Crossfab”(抗MCSP/抗cyCD3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GLGE Healthcare ;2mM MOPS ρΗ7.3，150mM NaCl, 0.02%(w/v) NaCl ;注射 50 μ g 样品)。
[0042]图14。(A, B) “2+lIgG Crossfab,倒转的”(抗 CEA/ 抗 huCD3)(见 SEQIDN033, 63，65，67)，非还原性(A)和还原性(B)的 SDS PAGE (4-12%Bis/Tris，NuPageInvitrogen,考马斯染色)。(C) ^2+1 IgG Crossfab,倒转的”(抗 CEA/ 抗 huO)3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare; 2mM MOPS pH7.3, 150mMNaCl，0.02%(w/v) NaCl ;注射 50 μ g 样品)。
[0043]图15。(A) “(ScFv)2-Fc ” 和 “(dsscFv)2-Fc，，(抗 MCSP (LC007)/抗 huCD3(V9))的热稳定性。动态光散射，其在25-75°C以0.05°C/min爬升的温度中测量。黑色曲线:“(scFv)2-Fc” ；灰色曲线:“(dsscFv)2-Fc”。(B) ^2+1 IgG scFab”(见 SEQID N05, 21, 23)和 “2+1 IgG Crossfab” (抗 MCSP/ 抗 huCD3)(见 SEQ ID N03, 5，29，33)的热稳定性。动态光散射，其在25-75°C以0.05°C/min爬升的温度中测量。黑色曲线:“2+lIgG scFab”；灰色曲线:“2+lIgG Crossfab”。
[0044]图16。用于㈧测定各种Fe突变体与人Fe Y RIIIa的相互作用，以及用于(B)T细胞双特异性构建体与肿瘤靶物和人⑶3 Y (G4S) #D3 ε -AcTev-Fc (突出)-Avi/Fe (孔)的同时结合的Biacore测定设置。
[0045]图17。T细胞双特异性构建体对人MCSP的D3域和人CD3y (G4S)5CD3 ε-AcTev-Fc(突出)-Avi/Fe(孔)的同时结合。(A)“2+lIgGCrossfab”(见SEQ ID N03, 5，29，33)，(B) ^2+1 IgG scFab”(见 SEQ ID N05, 21，23)。
[0046]图18。T细胞双特异性构建体对人EGFR和人CD3 Y (G4S) 5CD3 ε -AcTev-Fc (突出)-Avi/Fc (孔)的同时结合。(A)“2+lIgGscFab”(见 SEQ ID N045, 47, 53), (B) ^ 1+1 IgGscFab，I 个臂”(见 SEQ ID NO 43，45，47)，(C) “1+lIgG scFab，I 个臂倒转”(见 SEQ IDN011, 49，51)，和(D) “1+lIgG scFab”(见 SEQ ID N047, 53，213)。
[0047]图19。通过FACS测量的“(scFv) 2”分子(50nM)对Jurkat细胞上表达的CD3 (A)或Colo-38细胞上的MCSP (B)的结合。绘出了相比于未处理细胞和仅用二抗染色的细胞的均值荧光强度。
[0048]图20。通过 FACS 测量的 ^2+1 IgG scFab, LALA，，(见 SEQ ID N05, 17，19)构建体(50nM)对Jurkat细胞上表达的CD3 (A)或Colo-38细胞上的MCSP (B)的结合。绘出了相比于用参照抗CD3IgG(如指示的)处理的细胞、未处理细胞和仅用二抗染色的细胞的均值荧
光强度。
[0049]图21。通过 FACS 测量的“1+lIgG scFab，I 个臂”(见 SEQ ID N01, 3，5)和“ 1+lIgGscFab, I个臂倒转”(见SEQ ID N07, 9，11)构建体(50nM)对Jurkat细胞上表达的CD3 (A)或Colo-38细胞上的MCSP (B)的结合。绘出了相比于用参照抗⑶3或抗MCSP IgG(如指示的)处理的细胞、未处理细胞和仅用二抗染色的细胞的均值荧光强度。
[0050]图22。^2+1 IgG scFab, LALA” (见 SEQ ID N05, 17，19)双特异性构建体和相应的抗MCSP IgG对Colo-38细胞上MCSP的剂量依赖性结合，如通过FACS测量的。 [0051]图23。在存在或缺乏Colo-38肿瘤靶细胞(如指示的(PBMC与肿瘤细胞的E:T 比率=10:1))的情况下在与 InM ^2+1 IgG scFab, LALA，，(见 SEQ ID N05, 17，19)或“(ScFv)2”OT3-MCSP双特异性构建体温育后，人T细胞上不同活化标志物的表面表达水平。绘出的是分别在15或24小时温育后，CD8+T细胞上早期活化标志物CD69 (A)或后期活化标志物⑶25 (B)的表达水平。
[0052]图24。在存在或缺乏Colo-38肿瘤靶细胞(如指示的(E:T比率=5:1))的情况下在与 InM ^2+1 IgG scFab, LALA” (见 SEQ ID N05, 17，19)或“(scFv) 2” CD3-MCSP 双特异性构建体温育后，人T细胞上后期活化标志物CD25的表面表达水平。绘出的是在5天温育后，⑶8+T细胞(A)或⑶4+T细胞(B)上后期活化标志物⑶25的表达水平。
[0053]图25。在存在或缺乏人MCSP表达MV-3肿瘤靶细胞(E:T比率=3:1)的情况下在与指定浓度的“2+lIgG Crossfab”双特异性构建体(靶向猕猴CD3和人MCSP ;见SEQ IDN03, 5, 35, 37)温育43小时后，来自两只不同动物(cyno Nestor, cyno Nobu)的称猴⑶8+T细胞上后期活化标志物⑶25的表面表达水平。作为对照，使用参照IgG(抗猕猴⑶3IgG、抗人 MCSP IgG)或非生理(unphysiologic)刺激物 PHA-M。
[0054]图26。由人泛T细胞分泌的IFN-Y水平，所述人泛T细胞在U87MG肿瘤细胞(E:T比率=5:1)的存在下通过“2+lIgG scFab，LALA”CD3-MCSP双特异性构建体(见SEQ IDN05, 17，19)活化18.5小时。作为对照，施用相应的抗CD3和抗MCSP IgG0
[0055]图27。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养并通过不同浓度的“2+lIgGscFab”(见 SEQ ID N05, 21，23)、“2+lIgG Crossfab”(见 SEQ ID N03, 5，29，33)和“ (ScFv)2"双特异性分子和相应IgG活化20小时后对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0056]图28。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养并通过不同浓度的双特异性构建体和相应IgG活化20小时后对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。比较其Fe域有所不同(具有野生型Fe域(见SEQ ID N05, 13，15)，或经过突变以消除(NK)效应细胞功能的 Fe 域:P329G LALA (见 SEQ ID N05, 21，23)、P329G LALA N297D (见 SEQ IDN05, 25, 27))的 “2+lIgG scFab” 构建体和 “2+1 IgG Crossfab”(见 SEQ ID N03, 5，29，33)构建体。[0057]图29。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，用⑶3-MCSP双特异性“2+lIgGscFab, LALA” (见 SEQ ID N05, 17，19)构建体、“(scFv)2”分子或相应 IgG 处理 18.5 小时后对Colo-38肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0058]图30。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，用⑶3-MCSP双特异性“2+lIgGscFab, LALA” (见SEQ ID N05, 17，19)构建体、“(scFv)2”分子或相应IgG处理18小时后对Colo-38肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0059]图31。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，并通过不同浓度的⑶3-MCSP双特异性“2+lIgG scFab, LALA” (见 SEQ ID N05, 17，19)构建体、“(scFv)2”分子或相应 IgG活化23.5小时后对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0060]图32。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，并通过不同浓度的⑶3-MCSP双特异性“1+lIgG scFab，I 个臂”(MSEQ ID N01，3，5)、“ 1+lIgG scFab，I 个臂倒转”(见SEQ ID N07, 9，11)或“(scFv)2”构建体或相应IgG活化19小时后对Colo-38肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0061]图33。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，用“1+lIgG scFab”CD3_MCSP双特异性构建体(见SEQ ID N05, 21，213)或“(ScFv)2”分子处理20小时后对Colo-38肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0062]图34。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，并通过不同浓度的双特异性构建体和相应IgG活化21小时后对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。比较0)3-]\?^?双特异性“2+1186 Crossfab”(见 SEQ ID NO 3, 5, 29, 33)和“1+lIgGCrossfab” (见 SEQ ID N05, 29，31，33)构建体、“(scFv)2”分子和相应 IgG0
[0063]图35。通过用 135ng/ml 或 1.35ng/ml ^2+1 IgG Crossfab”CD3_MCSP 双特异性构建体(见SEQ ID N03, 5, 29, 33) (E: T`比率=25:1)活化人T细胞诱导的对不同靶细胞(MCSP阳性Colo-38肿瘤靶细胞、源自骨髓或脂肪组织的间充质干细胞、或来自胎盘的周细胞；如指示的)的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0064]图36。在与人PBMC和不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+lIgGscFab，LALA”(见SEQ ID N05，17，19)和 “(scFv)2”)或糖工程化抗 MCSP IgG (GlycoMab)共培养后，在过夜温育21h后测量的对Colo-38肿瘤靶细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。效应细胞与靶细胞比率固定在25:1(A)，或如绘出的那样变化(B)。PBMC自新鲜血液(A)或血沉棕黄层(Buffy Coat) (B)分离。
[0065]图37。靶向猕猴 CD3 和人 MCSP 的 “2+1 IgG Crossfab” 构建体(见 SEQ IDN03, 5, 35, 37)的时间依赖性细胞毒性效应。绘出的是在与原代猕猴PBMC(E:T比率=3:1)共培养24h或43h后来自表达MCSP的人MV-3细胞的LDH释放。作为对照，以相同的摩尔浓度使用参照IgG (抗猕猴⑶3IgG和抗人MCSP IgG)。PHA-M充当(非生理)T细胞活化的对照。
[0066]图38。在与人PBMC (E: T比率=10:1)共培养，并用不同⑶3-MCSP双特异性构建体Ci2+1 IgG Crossfab”(见 SEQ ID N03, 5，29，33)和“(scFv)2”)处理约 26 小时后对 huMCSP阳性MV-3黑素瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0067]图39。在与人泛T细胞(E: T比率=5:1)共培养，并用不同⑶3-EGFR双特异性构建体 Ci2+1 IgG scFab”(见 SEQ ID N045, 47，53)、“ 1+lIgG scFab”(见 SEQ ID N047, 53, 213)和“ (ScFv)2")或参照IgG处理18小时后对EGFR阳性LS-174T肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0068]图40。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，并用不同⑶3-EGFR双特异性构建体(“1+lIgG scFab，I 个臂”(见 SEQ ID N043, 45，47)、“ 1+lIgG scFab，I 个臂倒转”(见SEQ ID N011, 49，51)、“l+lIgG scFab”(见 SEQ ID N047, 53, 213)和 “(scFv)2”)或参照IgG处理21小时后对EGFR阳性LS-174T肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0069]图41。在与人泛T细胞(A)或人未处理T细胞⑶共培养，并用不同⑶3-EGFR双特异性构建体(“1+lIgG scFab，I 个臂”(见 SEQ ID N043, 45，47)、“ 1+lIgG scFab，I 个臂倒转”(见SEQ ID N011, 49，51)和“(scFv)2” )或参照IgG处理16小时后对EGFR阳性LS-174T肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。效应细胞与靶细胞比率为5:1。
[0070]图42。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，并用不同⑶3-FAP双特异性构建体(“1+lIgG scFab，I 个臂倒转”(见 SEQ ID N011, 51，55)、“ Ι+lIgGscFab”(见 SEQ IDN057, 61，213)、“2+lIgG scFab” (见 SEQ ID N057, 59，61)和“ (scFv)2，，)处理约 18 小时后对FAP阳性GM05389成纤维细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0071]图43。对已经在存在㈧或缺乏⑶靶细胞的情况下用不同⑶3-MCSP双特异性构建体(^2+1 IgG scFab, LALA，，(见 SEQ ID N05, 17，19)和“(scFv)2”)或相应对照 IgG处理6h的CD8+T细胞中CD107a/b表达水平以及穿孔蛋白(perforin)水平的流式细胞术分析。在存在或缺乏Colo-38肿瘤靶细胞的情况下将人泛T细胞与9.43nM不同分子以5:1的效应器与靶物比率温育。在温育第I小时后加入莫能菌素(Monensin)以通过阻止蛋白质运输来提高胞内蛋白质水平。对所有⑶107a/b阳性、穿孔蛋白阳性或双重阳性细胞设置门，如绘出的。
[0072]图44。在存在或缺乏Colo-38肿瘤靶细胞的情况下在与InM不同⑶3-MCSP双特异性构建体(^2+1 IgG scFab，LALA” (见 SEQ ID N05, 17，19)或“(scFv)2”)或相应对照IgG以5:1的效应细胞与靶细胞比率温育后⑶8+(A)或⑶4+(B)人T细胞的相对增殖。通过FACS表征经CFSE标记的人泛T细胞。相对增殖水平通过围绕非增殖细胞设门并相对于总测量细胞数使用该门的细胞数作为参照来测定。
[0073]图45。在存在(A)或缺乏(B) Colo-38肿瘤靶细胞的情况下在用InM不同CD3-MCSP双特异性构建体(^2+1 IgG scFab，LALA” (见 SEQ ID N05, 17，19)或“(scFv)2”)或相应对照IgG处理24小时后，人PBMC上清液中测量的不同细胞因子水平。效应细胞与靶细胞比率为10:1。
[0074]图46。在存在(A，B)或缺乏(C，D)Colo_38肿瘤细胞的情况下在用InM不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+lIgG scFab”、“2+lIgG Crossfab”(见SEQ ID N03, 5，29，33)或“(scFv)2”)或相应对照IgG处理24小时后，全血上清液中测量的不同细胞因子水平。双特异性构建体中有不同的“2+lIgG scFab”构建体，其具有野生型域(见SEQ IDN05, 13，15)，或经突变以消除(NK)效应细胞功能的Fe域(LALA(见SEQ ID N05, 17，19)、P329G LALA (见 SEQ ID N05, 2, 23)和 P329G LALA N297D (见 SEQ ID N05，25，27))。
[0075]图47。CE-SDS 分析。显示为 2+lIgG Crossfab，连接的轻链(见 SEQ ID NO3，5，29，179)的SDS PAGE的电泳图(第I道:还原性，第2道:非还原性)。
[0076]图48。2+lIgG Crossfab，连接的轻链(见 SEQ ID N03, 5，29，179)(终产物)的分析性大小排阻层析。注射20 μ g样品。
[0077]图49。在通过人PBMC (E: T比率=10:1)共培养，并用不同⑶3-MCSP双特异性构建体(^2+1 IgG Crossfab” (见 SEQ ID N03, 5，29，33)和 “2+lIgGCrossfab，连接的 LC” (见SEQ ID N03, 5，29，179))处理约44小时后对MCSP阳性MV-3肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。人PBMC自健康志愿者的新鲜血液分离。
[0078]图50。在通过人PBMC (E: T比率=10:1)共培养，并用不同⑶3-MCSP双特异性构建体(^2+1 IgG Crossfab” (见 SEQ ID N03, 5，29，33)和 “2+lIgGCrossfab，连接的 LC” (见SEQ ID N03, 5，29，179))处理约22小时后对MCSP阳性Colo-38肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。人PBMC自健康志愿者的新鲜血液分离。
[0079]图51。在通过人PBMC (E: T比率=10:1)共培养，并用不同⑶3-MCSP双特异性构建体(^2+1 IgG Crossfab” (见 SEQ ID N03, 5，29，33)和 “2+lIgGCrossfab，连接的 LC” (见SEQ ID N03, 5，29，179))处理约22小时后对MCSP阳性Colo-38肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。人PBMC自健康志愿者的新鲜血液分离。
[0080]图52。在通过人PBMC (E: T比率=10:1)共培养，并用不同⑶3-MCSP双特异性构建体(^2+1 IgG Crossfab”(见 SEQ ID N03, 5，29，33)和“2+lIgG Crossfab，连接的 LC”(见SEQ ID N03, 5，29，179))处理约22小时后对MCSP阳性WM266-4细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。人PBMC自健康志愿者的新鲜血液分离。
[0081]图53。在存在或缺乏表达MCSP的人Colo_38肿瘤靶细胞(E:T比率=10:1)的情况下在与10nM、80pM或3pM的不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+lIgG Crossfab” (见SEQ ID N03, 5，29，33)和“2+lIgG Crossfab，连接的 LC，，(见 SEQ ID N03, 5，29，179))温育22小时后人⑶8+T细胞上早期活化标志物⑶69 (A)和后期活化标志物⑶25 (B)的表面表达水平。
[0082]图54。CE-SDS 分析。⑷显示为 1+lIgG Crossfab ;VL/VH 交换(LC007/V9)(见SEQ ID N05, 29，33，181)的SDS-PAGE的电泳图:a)非还原性，b)还原性。(B)显示为1+lCrossMab ；CL/CH1 交换(LC007/V9)(见 SEQ ID N05, 23，183，185)的 SDS-PAGE 的电泳图:a)还原性，b)非还原性。(C)显示为2+lIgGCrossfab，倒转的；CL/CH1交换(LC007/V9)(见SEQ ID N05, 23，183，187)的SDS-PAGE的电泳图:a)还原性，b)非还原性。(D)显示为2+lIgG Crossfab ；VL/VH 交换(M4-3ML2/V9)(见 SEQ ID N033, 189，191，193)的 SDS-PAGE的电泳图:a)还原性，b)非还原性。(E)显示为2+lIgG Crossfab ；CL/CH1交换(M4-3ML2/V9)(见 SEQ ID N0183, 189，193，195)的 SDS-PAGE 的电泳图:a)还原性，b)非还原性。(F)显示为 2+lIgG Crossfab，倒转的;CL/CH1 交换(CH1A1A/V9)(见 SEQ ID N065, 67, 183，197)的SDS-PAGE的电泳图:a)还原性，b)非还原性。(G)显示为2+lIgG Crossfab ；CL/CH1交换(M4-3ML2/H2C)(见 SEQ ID N0189, 193，199，201)的 SDS-PAGE 的电泳图:a)还原性，b)非还原性。(H)显示为 2+lIgG Crossfab，倒转的；CL/CH1 交换(431/26/V9)(见 SEQ IDN0183, 203，205，207)的SDS-PAGE的电泳图:a)还原性，b)非还原性。(I)显示为“2+lIgGCrossfab 轻链融合” (CH1A1A/V9)(见 SEQ ID N0183, 209，211，213)的 SDS-PAGE 的电泳图:a)还原性，b)非还原性。(J) “2+1 IgGCrossfab” (抗 MCSP/ 抗 huCD3)(见 SEQ IDN05, 23，215，217)，非还原性(左)和还原性(右)的 SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPageInvitrogen,考马斯染色)。(K)显示为 “2+lIgG Crossfab,倒转的”(抗 MCSP/抗 huO)3)(见 SEQ ID N05, 23,215,219)的 SDS-PAGE 的电泳图:a)还原性，b)非还原性。(L)“l+lIgGCrossfab” (抗 CD33/ 抗 huCD3)(见 SEQ ID N033, 213，221，223)的 SDS PAGE (4-12%Bis/Tris, NuPage Invitrogen,考马斯染色)，还原性(左)和非还原性(右)。(M) ^ 2+1 IgGCrossfab” (抗 CD33/ 抗 huCD3)(见 SEQ ID N033, 221，223，225)的 SDS PAGE (4-12%Bis/Tris, NuPage Invitrogen,考马斯染色)，还原性(左)和非还原性(右)。(N) ^ 2+1 IgGCrossfab” (抗 CD20/ 抗 huCD3)(见 SEQ ID NO 33，227，229，231)的 SDS PAGE (4-12%Bis/Tris, NuPage Invitrogen,考马斯染色),非还原性。
[0083]图55。双特异性构建体(CEA/CD3“2+lIgG Crossfab，倒转的(VL/VH) ”(见 SEQ IDN033, 63，65，67)和 “2+lIgG Crossfab，倒转的(CL/CH1) 2 (见 SEQ ID N065, 67, 183，197))对由Jurkat细胞表达的人⑶3(A)，或由LS-174T细胞表达的人CEA(B)的结合，如通过FACS测定的。作为对照，亦评估等同最大浓度的参照IgG和由于经标记二抗(缀合有FITC的山羊抗人 AffiniPure F(ab，)2 片段，Fe Y 片段特异性，Jackson Tmmuno ResearchLab#109-096-098)所致的背景染色。
[0084]图56。双特异性构建体(MCSP/CD3“2+lIgG Crossfab”(见 SEQ ID N03, 5，29，33)和 “2+lIgG Crossfab，倒转的”(见 SEQ ID N05, 23，183，187))对由 Jurkat 细胞表达的人⑶3 (A)，或由丽266-4肿瘤细胞表达的人MCSP (B)的结合，如通过FACS测定的。
[0085]图 57,1+lIgG Crossfab 轻链融合”(见 SEQ ID N0183, 209，211，213)对由 Jurkat细胞表达的人⑶3(A)，或由LS-174T细胞表达的人CEA(B)的结合，如通过FACS测定的。
[0086]图 58。^2+1 IgG Crossfab”(见 SEQ ID N05, 23，215，217)和“2+lIgGCrossfab，倒转的”(见SEQ ID N05, 23, 215, 219)构建体对由Jurkat细胞表达的人CD3 (A)，或由WM266-4肿瘤细胞表达的人MCSP (B)的结合，如通过FACS测定的。
[0087]图59。在与指定浓度的 CD3/MCSP“l+lCrossMab”(见 SEQ ID N05, 23，183，185)、^ 1+1 IgG Crossfab”(见 SEQ ID N05, 29，33，181)和 “2+lIgG Crossfab”(见 SEQ IDN03, 5，29，33)构建体温育24小时后人⑶4+或⑶8+T细胞上早期活化标志物⑶69 (A)或后期活化标志物⑶25 (B)的表面表达`水平。该测定法在存在或缺乏MV-3靶细胞的情况下进行，如指示的。
[0088]图60。在存在或缺乏huMCSP阳性MV_3肿瘤细胞的情况下与猕猴PBMC (E: T比率=3:1，相对于CD3+数目标准化)共培养，并用“2+lIgG Crossfab” (见SEQ IDN05, 23，215，217)和 “2+lIgG Crossfab，倒转的”(见 SEQ ID N05, 23，215，219)温育约 41小时后，来自两只不同猕猴(A和B)的CD4+或CD8+T细胞上早期活化标志物CD25的表面表达水平。
[0089]图61。在与人？81?:伍:1'比率=10:1)共培养并通过不同浓度的“2+1186 Crossfab,倒转的(VL/VH) ”(见 SEQ ID N033, 63，65，67)或“2+lIgG Crossfab，倒转的(CL/CH1)”(见SEQ ID N065, 67, 183，197)构建体活化28小时后，对MKN-45 (A)或LS_174T(B)肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0090]图62。在与人？81?:伍:1'比率=10:1)共培养并通过不同浓度的“2+1186Crossfab(VL/VH)” (见 SEQ ID N033, 189，191，193)或“2+lIgG Crossfab(CL/CH1)” (见SEQ ID N0183, 189，193，195)构建体活化26小时后，对WM266-4肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。[0091]图63。在与人？81^伍:1'比率=10:1)共培养并通过不同浓度的“2+1186Crossfab(VH/VL)” (见 SEQ ID N033, 189，191，193)或“2+lIgG Crossfab(CL/CH1)” (见SEQ ID N0183, 189，193，195)构建体活化27小时后，对MV-3肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH
释放测量)。
[0092]图64。在与人？81?:伍:1'比率=10:1)共培养并通过不同浓度的“2+1186Crossfab”(见 SEQ ID N03, 5，29，33)、“Ι+lCrossMab”(见 SEQ ID N05, 23，183，185)和^ 1+1 IgG Crossfab”(见 SEQ ID N05, 29，33，181)活化21 小时后，对人MCSP 阳性WM266-4 (A)或MV-3(B)肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)，如指示的。
[0093]图65。在与人？81?:伍:1'比率=10:1)共培养并通过不同浓度“1+1186 CrossfabLC 融合”(见 SEQ ID N0183, 209, 211, 213)活化 28 小时后，对MKN-45 (A)或 LS_174T(B)肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0094]图66。在与人？81?:伍:1'比率=10:1)共培养并通过不同浓度的“1+1186 CrossfabLC 融合”(见 SEQ ID N0183, 209, 211, 213)或非靶向性“2+lIgG Crossfab”参照活化 24 小时后，对MC38-huCEA肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0095]图67。在与人？81?:伍:1'比率=10:1)共培养，并用“2+1186 Crossfab (V9) ”(见SEQ ID N03, 5，29，33)和“2+lIgG Crossfab，倒转的(V9) ”(见 SEQ ID NO 5，23，183，187)、^2+1 IgG Crossfab (抗 CD3) ”(见 SEQ ID N05, 23, 215, 217)和 “2+lIgG Crossfab，倒转的(抗CD3) ” (见SEQ ID N05, 23，215，219)构建体处理后，对人MCSP阳性MV-3 (A)或WM266-4 (B)肿瘤细胞的 杀伤(如通过LDH释放测量)。
[0096]发明详述
[0097]定义
[0098]除非在下文另外定义，术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用。
[0099]如本文中使用的，术语“抗原结合分子”在其最广义上指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是免疫球蛋白及其衍生物，例如片段。
[0100]术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原性决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两种抗原结合位点，其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。
[0101]如本文中使用的，术语“价”指抗原结合分子中规定数目的抗原结合位点的存在。因而，术语“对抗原的单价结合”指抗原结合分子中一个(且不超过一个)特异于抗原的抗原结合位点的存在。
[0102]“抗原结合位点”指抗原结合分子上提供与抗原相互作用的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基。天然的免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
[0103]如本文中使用的，术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原性决定簇的多肽分子。在一个实施方案中，抗原结合模块能够将与其附接的实体(例如第二抗原结合模块)引导至靶部位，例如至特定类型的肿瘤细胞或携有抗原性决定簇的肿瘤基质。在另一个实施方案中，抗原结合模块能够经由其靶抗原例如T细胞受体复合物抗原来激活信号传导。抗原结合模块包括如本文中另外定义的抗体及其片段。具体的抗原结合模块包括抗体的抗原结合域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中，抗原结合模块可以包含抗体恒定区，如本文中另外定义和本领域中已知的。可用的重链恒定区包括以下5种同种型中的任意一种:α、δ、ε、Y或μ。可用的轻链恒定区包括以下2种同种型中的任意一种:K和λ。 [0104]如本文中使用的，术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且指多肽大分子上与抗原结合模块结合，从而形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区构成的构象性构造)。可用的抗原性决定簇可以在例如肿瘤细胞表面上、病毒感染的细胞的表面上、其它患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中找到。除非另外指示，本文中称为抗原的蛋白质(例如MCSP、FAP、CEA、EGFR、⑶33、⑶3)可以是来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然形式蛋白质。在一个具体的实施方案中，抗原是人蛋白。在对本文中的特定蛋白质进行提述的情况下，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质以及起因于细胞中加工的蛋白质的任何形式。该术语还涵盖蛋白质的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。可用作抗原的例示性人蛋白包括但不限于:黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，亦称为硫酸软骨素蛋白聚糖4(UniPix)tn0.Q6UVK1 (版本 70)，NCBI RefSeq n0.NP_001888.2);成纤维细胞活化蛋白(FAP)，亦称为 Seprase (Uni Prot n0.Q12884、Q86Z29、Q99998, NCBI 登录号 NP_004451);癌胚抗原(CEA)，亦称为癌胚抗原相关细胞粘着分子5 (UniProt n0.P06731 (版本119)，NCBI RefSeqn0.NP_004354.2) ;CD33，亦称为 gp67 或 Siglec-3 (UniProt n0.P20138, NCBI 登录号ΝΡ_001076087,ΝΡ_001171079);表皮生长因子受体(EGFR)，亦称为 ErbB-1 或Herl (UniProtn0.P0053，NCBI登录号册_958439、册_958440)，和0)3，特别是03的ε亚基(对于人序列，参见 UniProt n0.Ρ07766 (版本 130)、NCBI RefSeq n0.NP_000724.USEQ ID N0:265;或对于称猴[食蟹猴(Macaca fascicularis)]序列，参见 UniProt n0.Q95LI5 (版本 49)、NCBIGenBank n0.BAB71849.1、SEQ ID NO:266) ?在某些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合在来自不同物种的活化性T细胞抗原或靶抗原间保守的活化性T细胞抗原或祀细胞抗原的表位。
[0105]“特异性结合”意指结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合模块结合特定抗原性决定簇的能力能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振技术(在BIAcore仪上分析)(Liljeblad等，Glyco J17，323-329 (2000))，以及传统的结合测定法(Heeley, Endocr Res28, 217-229(2002))来测量。在一个实施方案中，抗原结合模块对无关蛋白的结合程度是该抗原结合模块对抗原结合的小于约10%，如例如通过SPR测量的。在某些实施方案中，结合抗原的抗原结合模块，或包含该抗原结合模块的抗原结合分子具有(ΙμΜ、≤ ΙΟΟηΜ、≤ ΙΟηΜ、≤ InM、≤ 0.1nM、≤ 0.01nM、或≤ 0.0OlnM(例如 KT8M 以下，例如10_8M至10_13M，例如IO-9M至I(T13M)的解离常数(Kd)。
[0106]“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗原结合模块和抗原，或受体及其配体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(Kd)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为Kws和Kgg)的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量，包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振(SPR)。
[0107]“降低的结合”，例如降低的对Fe受体的结合，指相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为了清楚，该术语还包括亲和力降低至O (或低于分析方法的检测限)，即完全消除相互作用。相反，“升高的结合”指相应相互作用的亲和力升高。
[0108]如本文中使用的，“活化性T细胞抗原”指在T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的表面上表达的抗原性决定簇，其在与抗原结合分子相互作用后能诱导T细胞活化。特定地，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可诱导T细胞活化，其通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联进行。在一个具体的实施方案中，所述活化性T细胞抗原是CD3。
[0109]如本文中使用的，“T细胞活化”指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答，其选自:增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够诱导T细胞活化。合适的测量T细胞活化的测定法是本文中所述【技术领域】中已知的。
[0110]如本文中使用的，“靶细胞抗原”指靶细胞表面上呈现的抗原性决定簇，所述靶细胞例如肿瘤中的细胞如癌细胞或肿瘤基质的细胞。
[0111]如本文中使用的，术语“第一”和“第二”就抗原结合模块等而言为了在有超过一个每类模块时便于区分而使用。除非明确如此陈述，这些术语的使用不意图赋予T细胞活化性双特异性抗原结合分子的 特定次序或取向。
[0112]“Fab分子”指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CHl域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL域组成的蛋白质。
[0113]“融合”意指组分(例如Fab分子和Fe域亚基)直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。
[0114]如本文中使用的，术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施方案中，抗原结合模块之一是单链Fab分子，即其中通过肽接头连接Fab轻链和Fab重链以形成单一肽链的Fab分子。在一个具体的这类实施方案中，在单链Fab分子中Fab轻链的C端连接于Fab重链的N端。
[0115]“交换”Fab分子(亦称为“Crossfab”)意指其中交换Fab重链和轻链的可变区或恒定区的Fab分子，即交换Fab分子包含由轻链可变区和重链恒定区构成的肽链，和由重链可变区和轻链恒定区构成的肽链。为了清楚，在其中交换Fab轻链和Fab重链的可变区的Fab分子中，包含重链恒定区的肽链在本文中称为交换Fab分子的“重链”。相反，在其中交换Fab轻链和Fab重链的恒定区的Fab分子中，包含重链可变区的肽链在本文中称为交换Fab分子的“重链”。
[0116]术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重域或重链可变域，接着是3个恒定域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻(CL)域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称为a (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、Y (IgG)或μ (IgM)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如 Y1(IgG1), Y2 (IgG2)、Y 3 (IgG3) > Y4 (IgG4)、Q1(IgA1)和a2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称为卡帕(K)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fe域组成。
[0117]术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
[0118]“抗体片段”指完整抗体外的分子，其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、和单域抗体。对于某些抗体片段的综述,参见Hudson等，NatMed9, 129-134 (2003)。对于 scFv 片段的综述，参见例如 Pliickthun,于 The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg 和 Moore 编,Springer-Verlag, NewYork, pp.269-315 (1994);亦参见 W093/16185 ;和美国专利 N0.5，571，894 和 5，587，458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’ )2片段的论述，参见美国专利N0.5，869，046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如 EP404，097;TO1993/01161;Hudson 等，Nat Med9, 129-134(2003)；和 Hollinger 等，Proc Natl Acad Sci USA90, 6444-6448 (1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等，Nat Med9, 129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域、或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis, Inc., Waltham, MA;参见例如美国专利N0.6, 248, 516B1)。可以通过各种技术来制备抗体片段，包括但不 限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中描述的。
[0119]术语“抗原结合域”指包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的抗体部分。抗原结合域可由例如一个或多个抗体可变域(也称为抗体可变区)提供。具体地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
[0120]术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL) —般具有类似的结构，每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR) ο参见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版，W.H.Freeman and C0.,第91页(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。
[0121]如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中序列中高度可变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常，天然的四链抗体包含六个HVR ;三个在VH中(Η1、Η2、Η3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包含来自高变环和/或来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。除了 VH中CDRl外，CDR —般包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补性决定区”(⑶R)，并且在述及形成抗原结合区的可变区部分时，这些术语在本文中可交换使用。此特定区域已由 Kabat 等，U.S.Dept, of Health and Human Services, Sequences of Proteins ofImmunological Interest (1983)及由 Chothia等，J Mol Bioll96:901_917(1987)描述,其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表1中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数将随着CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定⑶R。
[0122]表1:CDR 定义1
[0123]
【权利要求】
1.一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含第一抗原结合模块和第二抗原结合模块以及由能够稳定联合的第一亚基和第二亚基构成的Fe域,所述抗原结合模块中一种是能够特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子，而所述抗原结合模块中另一种是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子； 其中所述第一抗原结合模块是 (a)单链Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链由肽接头连接，或 (b)交换Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区是交换的。
2.权利要求1的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含不超过一个能够特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块。
3.权利要求1或2的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合模块和所述第二抗原结合模块彼此融合，任选地经由肽接头融合。
4.权利要求1至3中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述第一抗原结合模块的Fab重链的N端。
5.权利要求1至3中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述第二抗原结合模块的Fab重链的N端。
6.权利要求4或5的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合模块是交换Fab分子，且所述第一抗原结合模块的Fab轻链与所述第二抗原结合模块的Fab轻链彼此融合，任选地经由肽接头融合。
7.权利要求1至3中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的所述第二抗原结合模块在Fab轻链的C端融合至所述第一抗原结合模块的Fab轻链的N端。
8.权利要求1至3、5或7中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的所述第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fe域的第一亚基或第二亚基的N端。
9.权利要求1至4中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fe域的第一亚基或第二亚基的N端。
10.权利要求1或2的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合模块和所述第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fe域的亚基之一的N端。
11.权利要求1至10中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含第三抗原结合模块，所述第三抗原结合模块为能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子。
12.权利要求11的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fe域的第一亚基或第二亚基的N端。
13.权利要求11或12的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第二抗原结合模块和所述第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fe域的亚基之一的N端，且所述第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述第二抗原结合模块的Fab重链的N端。
14.权利要求11或12的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合模块和所述第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fe域的亚基之一的N端，且所述第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述第一抗原结合模块的Fab重链的N端。
15.权利要求13的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第二抗原结合模块和所述第三抗原结合模块和所述Fe域是免疫球蛋白分子，特别是IgG类免疫球蛋白的一部分。
16.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fe域是IgG Fe域，具体为IgGl或IgG4Fc域。
17.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fe域是人Fe域。
18.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fe域包含促进所述Fe域的第一亚基和第二亚基联合的修饰。
19.权利要求18的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在所述Fe域的第一亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成可安置于第二亚基的CH3域内的空穴中的隆起，且在所述Fe域的第二亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成可安置第一亚基的CH3域内的隆起的空穴。
20.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中相比于天然IgGlFc域,所述Fe域展现出降低的对Fe受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。
21.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fe域包含一处或多处降低对Fe受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代。
22.权利要求21的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述一处或多处氨基酸取代在选自下组的一个或多个位置处:L234、L235和P329。
23.权利要求22的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fe域的每个亚基包含三处降低对活化性Fe受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为 L234A, L235A 和 P329G。
24.权利要求20至23中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fe受体是Fe Y受体。
25.权利要求20至23中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述效应器功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
26.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述活化性T细胞抗原是CD3。
27.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述靶细胞抗原选自下组:黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、⑶19、CD20、CD33、癌胚抗原(CEA)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。
28.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至27中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段。
29.—种多肽,其由权利要求28的分离的多核苷酸编码。
30.一种包含权利要求28的分离的多核苷酸的载体，具体为表达载体。
31.一种宿主细胞,其包含权利要求28的分离的多核苷酸或权利要求30的表达载体。
32.—种生成权利要求1至27中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其包括以下步骤: a)在适合于表达所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的条件下培养权利要求31的宿主细胞，并 b)回收所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
33.一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其由权利要求32的方法生成。
34.一种药物组合物，其包含权利要求1至27中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和药学可接受载体。
35.权利要求1至27中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或权利要求34的药物组合物，其用作药物。
36.权利要求1至27中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或权利要求34的药物组合物，其用于治疗有此需要的个体中的疾病。
37.权利要求36的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或药物组合物，其中所述疾病是癌症。
38.权利要求1至27中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在制备用于治疗有此需要的个体中疾病的药物的用途。
39.一种治疗个体中疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学可接受形式的权利要求1至27中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
40.权利要求38的用途或权利要求39的方法，其中所述疾病是癌症。
41.一种用于诱导靶细胞裂解的方法，其包括在存在T细胞的情况下使靶细胞与权利要求I至27中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子接触。
42.如说明书所述的发明。
【文档编号】A61P35/00GK103748114SQ201280040620
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年8月21日 优先权日:2011年8月23日
【发明者】O.阿斯特, P.布鲁恩克, T.福蒂, A.弗莱莫瑟-格伦德乔伯, C.耶格, C.克莱恩, E.莫斯纳, P.尤马纳 申请人:罗切格利卡特公司