专利名称：一种维甲酸诱导蛋白16n端多肽及其抗体的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种一种维甲酸诱导蛋白16N端多肽及其抗体的制备方法和应用。
背景技术：
维甲酸诱导蛋白16 (Retinoic acid induced proteinl6, RAI16)的 NCBI 登录号为 ΝΡ_073586.5，Swissprot 登录号为 Q86V87，IPI 号为 ΙΡΙ00654780.2。RAI16 是维甲酸诱导产生的蛋白分子，其结构与功能目前尚未清楚。RAI16最初是在维甲酸诱导细胞分化时分离出来的，而维甲酸具有抑制细胞增殖、促进细胞调亡和促进细胞分化的作用，已被应用于急性淋巴细胞白血病、肺癌及肝癌等多种癌症的治疗(Okuno Μ, KojimaS，Matsushima—Nishiwaki R，Tsurumi H，MutoY，Friedman SLj Moriwaki H.Retinoids incancer chemoprevention.Curr Cancer Drug Targets.2004;4:285-98)。因此，维甲酸诱导蛋白RAI16很可能也参与一系列生理过程，在细胞增殖、分化、以及细胞凋亡等方面发挥重要作用。现有研究表明RAI16 在肝细胞再生(Wang G, Deng J, Yang J, Zheng JJ, WangHZj Hu Qj Zhang ZMj Chen Cj Wang Dj Li ZP.Analysis on the protein structure andfunction of retinoic acid inducedl6.World J Gastroenterol.2007;15:1342-1346)和促进肝细胞癌发生发展(Wen Wang, Lan-Juan Zhao, Yuan Yang, Ruo-Yu Wang, HaoRen，Ping Zhao，Wei—Ping Zhou, Zhong-Tian Q1.Retinoic acid induced16enhancestumorigenesis and serves as novel tumor marker in hepatocellular carcinoma.Carcinogenesis.20120ct7.[Epub ahead of print])中发挥重要作用
发明内容
本发明的目的在于提供一种维甲酸诱导蛋白16 (RAI16)N端多肽、相应抗体及其制备方法和应用。本发明的主要技术方案是，通过免疫实验特异性检测RAI16的表达和天然存在，并建立相应体外免疫分析所需基本生物制品的问题，继而提供的一种特异性针对RAI16N端的合成多肽、相应抗体及其制备方法和应用。本发明还解决了目前使用的RAI16价格昂贵，制备的抗体成本过高，而且抗体不能同时满足用于免疫印迹、免疫组织化学实验和免疫荧光实验的问题。本发明的第一方面，是提供一种维甲酸诱导蛋白16 (RAI16)N端多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示:Cys-Thr-Asp-Glu-Ser-Thr-Pro-Ala-Lys-Lys-Thr-Asp-1le-Pro-Trp-Arg本发明利用DNAStar软件分析RAI16N端抗原表位:确定RAI16蛋白N端的40-55位16个氨基酸抗原活性较好。
本发明的第二方面，是提供一种维甲酸诱导蛋白16 (RAIie)N端多肽的抗体，是将如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列免疫新西兰大白兔，获得抗维甲酸诱导蛋白16N端多肽的抗体。本发明的第三方面，是提供一种维甲酸诱导蛋白16 (RAIie)N端多肽的抗体的制备方法，包括以下步骤:(A)RAI16多肽的合成:多肽自动合成仪合成并纯化如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；⑶RAI16多肽与载体蛋白交联:RAI16多肽与载体蛋白一钥孔血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin, KLH)采用戍二醒连接法,然后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析8-12小时，交联形成RAI16-KLH;(C)制备兔抗RAI16N端多肽抗体:将乳化后的RAI16-KLH在兔背部皮下注射，并反复加强免疫，直至抗体效价等于或高于1:64000 ；(D)收集、分离得到含有兔抗RAI16多肽抗体的血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化RAI16多肽抗体，即得到抗RAI16N端多肽抗体。所述的步骤(B)中，RAI16多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)采用戊二醛连接法具体为:按重量份数比将4-6份经过纯化的RAI16多肽加入到6-8份载体蛋白KLH中，然后均匀、缓慢地加入0.5-1.5份浓度为3g/L的戊二醛溶液，室温环境下作用2小时。所述的步骤(C)中，取RAI16-KLH与等体积的完全福氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，首次免疫注射后第2周进行第一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，首次免疫注射剂量为1.2mg,每次加强免疫注射剂量为0.6mg ;加强免疫注射RAI16-KLH用不完全福氏佐剂乳化。
所述的步骤⑶中，采用辛酸-硫酸铵法纯化RAI16多肽抗体具体为:(a)将含有兔抗RAI16多肽抗体的血清用浓度为60mmol/L、pH值为4.0的醋酸钠缓冲液稀释3_4倍，再用浓度为0.lmol/L的NaOH调节pH值至4.5 ; (b)向步骤(a)的混合液中缓慢加入含量为98.5%的辛酸至混合液中辛酸浓度为25mol/L ； (c)室温条件下搅拌混合液30min，在4°C、IOOOOg的条件下离心30min，再用滤孔直径为0.22um的滤膜过滤上清液；(d)向滤液中加入滤液1/10体积的10XPBS，并用浓度为0.lmol/L的NaOH调节pH值至7.4，然后缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至滤液中硫酸铵饱和度为45% ； (e)加入硫酸铵的滤液在4°C环境下静置8-12h，然后在4°C、3000g的条件下离心30min，弃去上清夜；沉淀用浓度0.0lmol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液重悬，透析8-12h。本发明的第四方面，是提供一种维甲酸诱导蛋白16 (RAI16)N端多肽在制备免疫原中的应用。进一步地，提供一种维甲酸诱导蛋白16 (RAI16)N端多肽及其抗体在制备预防和治疗性急性淋巴细胞白血病、肺癌、肝癌等疫苗或诊断试剂盒中的应用。本发明中的RAI16N端多肽具有优异的亲水性结构、柔性区、抗原指数及表面概率结构。本发明制备的抗RAI16N端多肽抗体效价高，特异性好，可与天然人RAI16分子发生特异结合反应；本发明抗体制备成本低，而且能够满足免疫印迹、免疫组织化学实验和免疫荧光实验的要求，可用于建立体外免疫分析。本发明制备的抗RAI16N端多肽抗体，为RAI16分子的研究及相关疾病的研究(如诊断策略的制定、与疾病相关性分析、流行病学调查、预防和控制)提供一个有力工具，以及在生物医学研究中对靶蛋白的特性、含量的测定、分布情况的分析和蛋白的确证等方面都具有重要意义和价值。
图1是RAI16蛋白N端氨基酸序列采用DNAstar软件分析的结果。图2是合成的RAI16多肽通过HPLC纯化的结果。图3是抗RAI16抗体效价测定结果。图4是抗RAI16抗体与人肝癌细胞系H印G2、肝细胞肝癌组织中RAI16表达的免疫印记结果。图5是抗RAI16抗体用于检测人肝癌细胞系HepG2细胞中RAI16表达的免疫荧光结果。图6是抗RAI16抗体用于检测正常人多器官组织中RAI16表达和分布情况的免疫组织化学结果其中A为睾丸；B为肺；C为前列腺；D为肾。
具体实施例方式现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例1:抗RAI16N端多肽抗体的制备
抗RAI16N端多肽抗体按以下步骤制备:RAI16N端抗原表位的分析:利用DNAStar软件分析RAI16蛋白N端的氨基酸序列，分析结果如图1所示，RAI16蛋白N端的40-55位氨基酸(多肽)具有优异的亲水性结构、柔性区、抗原指数及表面概率结构。确定RAI16蛋白40-55位16个氨基酸作为合成多肽氮基酸序列:Cys-Thr-Asp-Glu-Ser-Thr-Pro-Ala-Lys-Lys-Thr-Asp-1le-Pro-Trp-ArgRAI16多肽的合成:多肽自动合成仪合成，采用常规C18的RP-HPLC柱进行纯化，纯化后纯度为95%，可作为抗原免疫动物，多肽合成及纯化质谱结果如图2所示。RAI16多肽与载体蛋白交联:RAI16多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法，按重量份数比将4-6份经过纯化的CW1A2多肽加入到6-8份载体蛋白KLH中，然后均匀、缓慢地加入0.5-1.5份浓度为3g/L的戊二醛溶液,室温环境下作用2h，然后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析8-12h，交联形成RAI16-KLH ；免疫动物:取RAI16-KLH与等体积的完全福氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射点为5点，每点注射lOOpg，首次免疫注射后第2周进行第一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同:加强免疫注射RAI16-KLH用不完全福氏佐剂乳化。反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1:64000 ；抗体纯化:采用颈动脉取血收集含有兔抗RAI16多肽抗体的兔血，得到含有兔抗RAI16多肽抗体的血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化RAI16多肽抗体:(I)将含有兔抗RAI16多肽抗体的血清用浓度为60mmol/L、pH值为4.0的醋酸钠缓冲液稀释3-4倍，再用浓度为0.lmol/L的NaOH调节pH值至4.5 ;(2)向步骤(I)的混合液中缓慢加入含量为98.5%的辛酸至混合液中辛酸浓度为25mol/L ；(3)室温条件下搅拌混合液30min，在4°C、IOOOOg的条件下离心30min，再用滤孔直径为0.22um的滤膜过滤上清液；(4)向滤液中加入滤液1/10体积的10XPBS，并用浓度为0.lmol/L的NaOH调节pH值至7.4，然后缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至滤液中硫酸铵饱和度为45% ；(5)加入硫酸铵的滤液在4°C静置8_12h，然后在4°C、3000g条件了离心30min，弃去上清液，沉淀用浓度0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲浓重悬，透析8_12h，即得到抗RAI16多肽抗体。实施例2 -M RAI16N端多肽抗体效价的确定本实施方式采用ELISA检测抗RAI16N端多肽抗体的效价=ELISA检测板用浓度为lmg/L的RAI16-BSA包被，每孔lOOul，在4°C条件下孵育8_12h，然后每孔加入200ul浓度为IOOul的牛血清，在37°C的条件下封闭2h，洗涤后加入倍比稀释的抗RAI16多肽抗体(对照组加入正常兔血清)，37°C条件下孵育60min，3次洗涤后每孔加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG100ul，37°C条件下孵育30min，洗涤3次后进行TMB显色，用酶标仪测定样品在A450的吸光值，计算抗体效价，本实施方式抗体效价为1:64000 (如图3所示)。实施例3 -M RAI16N端多肽抗体用于RAI16蛋白表达的检测1、免疫印记法(Western blotting)检测人肝癌细胞系H印G2细胞和肝细胞癌组织样本中RAI16的表达
HepG2细胞和肝细胞癌组织蛋白样本制备:lX107!fepG2细胞或IOOmg肝细胞癌组织(HCC，匀浆后)，加入裂解液(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA，蛋白酶抑制剂cocktail)在4°C裂解30min,4°C、IOOOOg的条件下离心20min,取上清液蛋白定量、分装后置于_80°C保存。本实施方式进行抗体的免疫印迹分析，采用合成多肽竞争法鉴定抗体的特异性。用5xSDS上样缓冲液悬浮制备的人IfepG2细胞或肝细胞癌组织，95°C加热lOmin，置于冰上冷却IOmin后上样；经SDS-PAGE胶分离后，以湿转法电转至PVDF膜上；经脱脂奶粉封闭(室温2h)后加入1:1000稀释的纯化后RAI16抗体和1:1000稀释纯化后抗体加等量合成多肽4°C过夜；PBST洗膜3次，然后加入1:2000HRP标记山羊抗兔IgG室温孵育lh，PBST洗膜3次，之后用化学发光剂试剂盒(ECL Plus)处理5min后，于暗室曝光到X光胶片上，显影、定影。本实施方式抗体免疫印迹结果如图4所示，HepG2细胞和HCC样本都检测到明显条带，而加入了 RAI16合成多肽的H印G2细胞样本未检测到任何条带，说明所制备的抗体可特异性的识别人HepG2细胞以及HCC样本中的RAI16蛋白。2、免疫荧光法(Immunostaining)检测人肝癌细胞系IfepG2细胞中RAI16的表达本实施方式进行抗体的免疫荧光染色，lX105!fepG2细胞用20%甲醇_20°C固定20min，PBS洗涤3次，用含有5%BSA的PBST室温封闭Ih,加入1:1000稀释的纯化后RAI16抗体，室温孵育lh，以含0.05% Tween-20的PBS洗涤3次，然后加入1:2000FITC标记山羊抗兔IgG室温孵育lh，PBST洗涤3次，使用细胞核染料DAPI染色IOmin后置于荧光显微镜下观察。本实施方式抗体免疫印迹结果如图5所示，HepG2细胞胞浆中有绿色荧光信号，说明所制备的抗体可特异性的识别人H印G2细胞RAI16蛋白，RAI16蛋白主要存在于细胞胞浆中。3、免疫组织化学法(Immunohistochemistry)检测人正常多器官组织样本中RAI16的表达本实施方式进行抗体的免疫组织化学染色，取出用丙酮固定的冰冻人正常多器官组织切片，滴加5% BSA，室温下5% BSA封闭20min，加入1:500稀释兔抗RAI16多肽抗体，4°C孵育过夜，再用PBS洗片后加入羊抗兔IgG，37°C孵育20min，PBS洗片后进行DAB显色，苏木素复染，返蓝后，脱水、透明、封片，镜检，放大100倍和400倍拍照记录结果。本实施方式抗体免疫组化染色实验结果如图6所示，免疫组化实验表明，RAI16多肽抗体可与正常人多个器官组织细胞胞浆中的RAI16蛋白结合(棕色染色)。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
权利要求
1.一种维甲酸诱导蛋白16N端多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.—种维甲酸诱导蛋白16N端多肽的抗体，其特征在于，是将如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列免疫新西兰大白兔，获得抗维甲酸诱导蛋白16N端多肽的抗体。
3.—种如权利要求2所述的维甲酸诱导蛋白16N端多肽的抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (A)RAI16多肽的合成:多肽自动合成仪合成并纯化如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； ⑶RAI16多肽与载体蛋白交联:RAI16多肽与载体蛋白一钥孔血蓝蛋白采用戊二醛连接法，然后用PH值为8.5的硼酸缓冲液透析8-12小时，交联形成RAI16-KLH ； (C)制备兔抗RAI16N端多肽抗体:将乳化后的RAI16-KLH在兔背部皮下注射，并反复加强免疫，直至抗体效价等于或高于1:64000 ； (D)收集、分离得到含有兔抗RAI16多肽抗体的血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化RAI16多肽抗体，即得到抗RAI16N端多肽抗体。
4.根据权利要求3所述的维甲酸诱导蛋白16N端多肽的抗体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(B)中，RAI16多肽与钥孔血蓝蛋白采用戊二醛连接法具体为:按重量份数比将4-6份经过纯化的RAI16多肽加入到6-8份载体蛋白KLH中，然后均匀、缓慢地加入0.5-1.5份浓度为3g/L的戊二醛溶液，室温环境下作用2小时。
5.根据权利要求3或4所述的维甲酸诱导蛋白16N端多肽的抗体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(C)中，取RAI16-KLH与等体积的完全福氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，首次免疫注射后 第2周进行第一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，首次免疫注射剂量为1.2mg，每次加强免疫注射剂量为0.6mg ;加强免疫注射RAI16-KLH用不完全福氏佐剂乳化。
6.根据权利要求3或4所述的维甲酸诱导蛋白16N端多肽的抗体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(D)中，采用辛酸-硫酸铵法纯化RAI16多肽抗体具体为:(a)将含有兔抗RAI16多肽抗体的血清用浓度为60mmol/L、pH值为4.0的醋酸钠缓冲液稀释3_4倍，再用浓度为0.lmol/L的NaOH调节pH值至4.5 ; (b)向步骤(a)的混合液中缓慢加入含量为98.5%的辛酸至混合液中辛酸浓度为25mol/L ； (c)室温条件下搅拌混合液30min，在4°C、IOOOOg的条件下离心30min，再用滤孔直径为0.22um的滤膜过滤上清液；(d)向滤液中加入滤液1/10体积的10XPBS，并用浓度为0.lmol/L的NaOH调节pH值至7.4，然后缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至滤液中硫酸铵饱和度为45% ； (e)加入硫酸铵的滤液在4°C环境下静置8-12h，然后在4°C、3000g的条件下离心30min，弃去上清夜；沉淀用浓度0.0lmol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液重悬，透析8-12h。
7.—种如权利要求1所述的维甲酸诱导蛋白16N端多肽在制备免疫原中的应用。
8.—种如权利要求1所述的维甲酸诱导蛋白16N端多肽在制备预防和治疗性急性淋巴细胞白血病、肺癌、肝癌的疫苗或诊断试剂盒中的应用。
9.一种如权利要求2所述的维甲酸诱导蛋白16N端多肽的抗体在制备预防和治疗性急性淋巴细胞白血病、肺癌、肝癌的疫苗或诊断试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医学技术领域，本发明提供了一种维甲酸诱导蛋白16(RAI16)N端多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，该多肽具有优异的亲水性结构、柔性区、抗原指数及表面概率结构。本发明还提供了RAI16N端多肽的抗体，及抗体的制备方法，本发明制备的抗RAI16N端多肽抗体效价高，特异性好，可与天然人RAI16分子发生特异结合反应。进一步地，本发明提供了RAI16N端多肽及其抗体在制备预防和治疗性急性淋巴细胞白血病、肺癌、肝癌等疫苗或诊断试剂盒中的应用。
文档编号A61P35/02GK103102392SQ20131003064
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者王文, 任浩, 许刚, 戚中田 申请人:中国人民解放军第二军医大学