一种与人源tlr2特异性结合的多肽，其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种与人源TLR2特异性结合的多肽，其制备方法和用途。具体而言，本发明的多肽其含有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列，或者含有该序列并在其他位置出现氨基酸替换，缺失或添加，且能与TLR2特异性结合。本发明提供了这种多肽序列的制备方法。本发明提供了这类多肽在制备预防和治疗TLR2相关疾病的药物中的应用。优选的TLR2相关疾病选自自身免疫病、慢性炎性疾病、肿瘤。优选的自身免疫病选自类风湿性关节炎；优选的慢性炎性疾病选自慢性阻塞性肺炎。本发明还提供了稳定表达TLR2的阳性细胞HEK293-TLR2/TLR1-luc，HEK293-TLR2/CD14-luc，HEK293-TLR2/TLR6-luc和本发明的多肽作为载体的应用。
【专利说明】一种与人源TLR2特异性结合的多肽，其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种能与人toll样受体2 (TLR2)结合并且能激活其下游信号通路的 多肽，其制备方法和制药用途，属于医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002] Toll 样受体 2 (TLR2)作为模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR) 中一类重要的受体，能特异地识别侵入体内的微生物病原相关模式分子（PAMPs)和体内的 危险信号相关模式分子（PAMPs)，激活固有免疫应答，在免疫系统中起关键作用。TLR2主要 识别微生物细胞壁的组成成分如细菌的脂肽，脂蛋白和磷壁酸等。研究发现在识别受体的 过程中TLR2主要以与⑶14、TLR1或TLR6等辅助性受体形成异源二聚体的形式；当特异性 配基与细胞膜表面的TLR2结合后，主要通过MyD88信号依赖性通路将信号传至NF-κ B诱 导激酶（ inducing kinase，NIK)，NIK的活化导致ΝΗ-κΒ激活，XF-κΒ激活后即 可启动细胞内炎症因子TNF-α、IFN-y、IL-6等的合成释放。本实验室前期研究发现TLR2 表达与肿瘤的发生发展密切相关，多种肿瘤细胞表面均能检测TLR2的表达，并且TLR2表达 量的高低与肿瘤的恶性程度成正相关，例如乳腺癌细胞表面均能检测到TLR2表达，而转移 能力高的乳腺癌细胞MDA-MB-231表面TLR2表达量是低转移能力乳腺癌细胞MCF7的十倍。 同时TLR2也参与到其他疾病的发生发展，例如TLR2信号通路与类风湿性关节炎，I型糖尿 病，炎性肠炎，慢性阻塞性肺炎，缺血再灌注损伤，动脉粥样硬化，红斑狼疮等多种自身免疫 病和慢性炎症密切相关。激活TLR2信号通路，可以促进下游细胞因子TNFa、IL-6、TGFi3 的释放，细胞因子参与以上疾病的进程。因此从新药研发的角度来看，TLR2可以作为许多 疾病的表面标志分子，靶向TLR2进行药物研发具有很好的前景。
[0003] 噬菌体随机肽库技术是以以噬菌体展示技术（phage display)为基础，通过基因 工程手段将外源多肽与噬菌体的次要外壳蛋白P III形成融合蛋白展示于噬菌体颗粒表面， 可保持相对独立的空间构象和生物活性，而不影响重组噬菌体对宿主菌的感染能力。与其 他基因表达系统相比较，噬菌体展示技术的最大特点就是它有效地将被展示多肽或蛋白质 和基因偶联起来，构成一个实体，因而在得到某种多肽结构的同时也就获得了它的基因。噬 菌体随机肽库技术是一项筛选并获得与靶抗原特异性结合肽的强有力、高通量的新技术， 其筛选过程是一个亲和纯化（affinity purification)的生物淘选（biopanning)过程，具 体过程是：先将噬菌体肽库与靶分子相互作用一段时间，洗涤除去非特异结合噬菌体，将特 异性结合噬菌体洗脱下来扩增，然后再投入下一轮的淘选。继续重复淘选、洗脱、扩增，最终 淘选出与靶分子特异结合的重组噬菌体克隆。现有噬菌体展示技术通常是对纯化的蛋白进 行筛选，得到与该靶蛋白特异性结合的寡肽或抗体，而对于细胞表面的受体而言，纯化的相 应蛋白会在空间结构上发生改变，筛选出的寡肽或抗体在体内的结合效应降低，基于此本 发明直接利用一对差异表达某种受体的细胞作为筛选的抗原，其中以不表达某种受体的细 胞作为阴性细胞，通过阴性筛选去除肽库中与阴性细胞表面相结合的噬菌体，剩余的噬菌 体再与表达相应受体的阳性细胞相结合，通过阳性筛选得到与受体相结合的噬菌体，此方 法即为"体外快速差减筛选（BRASIL) "噬菌体随机肽库技术，最终获得与相应受体特异性结 合的多肽。
[0004] 多肽D (klaklak)2是一段带正电并且具有α螺旋结构的14个氨基酸序列，能与 膜电位较高的细菌等原核微生物细胞膜相结合，提高细菌细胞膜的通透性，造成细胞内基 质外流，对细菌造成杀伤力；真核生物的细胞膜电位相比原核生物较低，多肽D (klaklak)2 不能与其结合，因此降低了对真核生物的毒性；而在真核生物细胞内线粒体的膜结构与原 核生物细胞膜相似，膜电位较高，因此D (klaklak)2可以与线粒体膜相结合，破坏线粒体膜 结构，引起线粒体肿胀，造成细胞色素 C的释放，进而引发下游caspase家族蛋白合成，使真 核细胞进入线粒体途径的凋亡。研究报道将多肽D (klaklak) 2其上游连接靶向肿瘤细胞 的细胞穿膜肽，将其带入肿瘤细胞内，可引发肿瘤细胞进行线粒体途径的凋亡，因此此肽段 具有较高的新药开发价值。
[0005] 本发明中使用的阴性细胞为细胞膜表面不表达TLR2受体的HEK293细胞系，阳性 细胞为本实验室构建的稳定表达TLR2及其辅助性受体CD14、TLR1或TLR6的HEK293细胞 系。同时又将TLR2信号通路的报告基因，即Ν? B荧光素酶报告基因也稳定表达到以上 阴性和阳性细胞系中，作为验证所筛选出的多肽是否具有激活TLR2信号通路功能的细胞 平台。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个实施方案提供了一种多肽，其含有SEQ ID Ν0 :1所不的氨基酸序列。 His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pr〇-Trp〇
[0007] 本发明的一个实施方案提供了一种多肽，含有SEQ ID NO :1所述氨基酸序列并在 其他位置出现氨基酸替换，缺失或添加，且能与TLR2特异性结合。
[0008] 本发明的一个实施方案提供了上述的多肽的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 4. 1经过对阴性细胞和阳性细胞进行有机溶剂法差异筛选，获得能与阳性细胞选 择性结合的重组噬菌体；
[0010] 4. 2噬菌体对阴性细胞，阳性细胞以及重组蛋白TLR2结合能力的测定；
[0011] 4. 3单克隆噬菌体的分离制备；
[0012] 4. 4喔囷体基因组单链DNA的提取和犾得募肤序列；
[0013] 4. 5固相多肽合成仪合成获得寡肽序列；
[0014] 4. 6荧光标记的寡肽序列对多种表达TLR2的细胞进行流式细胞术和免疫荧光法 测定。
[0015] 优选的阴性细胞选自不表达TLR2的HEK293细胞，优选的阳性细胞选自稳定表达 TLR2的HEK293细胞。所述的有机溶剂法差异筛选优选是经过四轮。
[0016] 本发明的一个实施方案提供了上述多肽在制备预防和治疗TLR2相关疾病的药物 中的应用。本发明的多肽能和TLR2特异性的结合，由于TLR2信号通路参与许多自身免疫 病(例如类风湿性关节炎)及慢性炎症疾病(例如慢性阻塞性肺炎）的发生及发展，激活TLR2 信号通路，促进相关细胞因子释放可以抑制以上疾病的进程，该多肽生物学功能在于激活 TLR2信号通路和促进相关细胞因子释放，因此其适应症在于治疗以上自身免疫病及慢性炎 症疾病。所述的预防和治疗TLR2相关疾病是通过激活TLR2信号通路，促进下游细胞因子 的释放实现的。优选的TLR2相关疾病选自自身免疫病、慢性炎性疾病、肿瘤。优选的自身 免疫病选自类风湿性关节炎；所述的慢性炎性疾病选自慢性阻塞性肺炎。
[0017] 本发明的一个实施方案提供了稳定表达TLR2的阳性细胞HEK293-TLR2/ TLRl-luc, HEK293-TLR2/CD14-luc, HEK293-TLR2/TLR6-luc。
[0018] 本发明的一个实施方案提供了本发明的多肽作为载体的应用。
[0019] 本发明的一个实施方案提供了一种物质，这种物质含有本发明的多肽和其他偶联 物。本发明的多肽作为载体，能将其他偶联物带入表达TLR2的细胞。优选的其他偶联物可 以是各种治疗剂，例如选自促进凋亡的多肽。本发明的多肽和促进凋亡的多肽偶联后能制 备预防和治疗肿瘤，尤其是通过靶向TLR2治疗肿瘤。
[0020] 本发明的一个实施方案提供了一种试剂盒，含有权利要求1-2中任一项的多肽。 本发明的肽段可以偶联于检测的物质。
[0021] 术语及简称
[0022] ELISA酶联免疫吸附试验
[0023] Western Blot蛋白免疫印迹
[0024] Blascidin杀稻瘟毒素
[0025] Confocal激光免疫共聚焦
[0026] BSA牛血清白蛋白
[0027] FITC异硫氰酸荧光素，一种绿色荧光素。
[0028] DAPI4'，6_ 二脉基 _2_ 苯基卩引哚（4,，6-diamidino_2-phenylindole)，是一种能够 与DNA强力结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。
[0029] Vigofect转染试剂的名称
[0030] Luc突光素酶luciferase的简称
[0031] MCF7 -种低转移乳腺癌细胞的简称
[0032] MDA-MB-231 -种高转移乳腺癌细胞的简称
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1 :构建稳定表达TLR2及其辅助性受体的阳性细胞模型。A为Western Blot的 方法验证所构建的阳性细胞系 HEK293-TLR2/CD14, HEK293-TLR2/TLR1，HEK293-TLR2/TLR6 中TLR2，CD14，TLR6的表达。B为细胞免疫荧光的方法验证阳性细胞系HEK293-TLR2/CD14， HEK293-TLR2/TLR1，HEK293-TLR2/TLR6 中 TLR2, CD14, TLR6 的表达。
[0034] 图2 :构建稳定表达TLR2信号通路NF-kB荧光素酶报告基因的细胞模型 HEK293-TLR2/CD14/luc，HEK293-TLR2/TLRl/luc，HEK293-TLR2/TLR6/luc，图 2 为以上细胞 系加入相应配基的量效曲线。
[0035] 图3 :噬菌体ELISA验证所筛选出的噬菌体克隆与阳性细胞的结合。其中左图为 阳性细胞ELISA的结果，右图为TLR2重组蛋白ELISA的结果。
[0036] 图4 :流式细胞术的方法验证所筛选肽段与阳性细胞的结合。从上往下依次为 FITC标记的多肽与阴性细胞HEK293,阳性细胞HEK293-TLR2/TLR1，低表达TLR2的MCF7,高 表达TLR2的MDA-MB-231 (MM231)细胞的结合图。
[0037] 图5 :细胞免疫荧光法验所筛选证肽段与表达TLR2细胞的结合。图5中第一排 为FITC标记的多肽F10与阴性细胞HEK293的结合图，第二排为与阳性细胞HEK293-TLR2/ TLR1的结合图。
[0038] 图6 :Confocal验证所筛选肽段时间依赖性进入TLR2表达量不同的细胞。图6第 一排为高表达TLR2的MDA-MB-231细胞，第二排为低表达TLR2的MCF7细胞。
[0039] 图7 :荧光素酶活性检测验证所筛选肽段对TLR2信号通路的激活效应。其中 左图为所筛选肽段对阴性细胞HEK293-1UC的激活效应，右图为所筛选肽段对阳性细胞 HEK293-TLR2/TLRl/luc 的激活效应。
[0040] 图8 :ELISA检测验证所筛选肽段对TLR2信号通路下游细胞因子的激活效应。以 多肽F10为例，其中A图为阴性细胞HEK293和阳性细胞HEK293-TLR2/TLR1细胞经所筛选 肽段刺激后培养基上清中细胞因子TNF a、IL-6的含量。B图为MCF7和MDA-MB-231细胞 经所筛选肽段刺激后培养基上清中细胞因子TNFα、IL-6、TGFβ的含量。图中 COn为空白 对照，Pam3为阳性对照Pam3csk4。
[0041] 图9 :细胞活力实验检测以所筛选肽段为基础加上多肽D(klaklak)2后对乳腺癌 细胞MCF7和MDA-MB-231细胞的毒性作用。
[0042] 图10 :流式细胞术检测以所筛选肽段为基础加上多肽D (klaklak) 2后对乳腺癌细 胞MCF7和MDA-MB-231细胞的促凋亡作用。
【具体实施方式】
[0043] 以下通过SEQ ID N0 :1多肽筛选，鉴定及应用优选实施例并结合附图具体说明本 发明的各个方面和特征。本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明目的，而不 限制本发明的范围。本发明的保护范围只受权利要求书的限制。在不背离权利要求书范围 的条件下。本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和 改进也属于本发明的保护范围。
[0044] 另外，需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本 领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员 公知的常规方法或按照厂商所建议的条件。
[0045] 实施例1构建稳定表达TLR2及其辅助性受体CD14、TLR1或TLR6的阳性细胞。
[0046] 构建方法如下：将TLR2及其辅助性受体CD14、TLR1或TLR6的表达质粒 PUN0-TLR2/CD14，PUN0-TLR2/TLR1, PUN0-TLR2/TLR6 用威格拉斯转染试剂 Vigofect 转染到 HEK293中，转染前24小时，接种适量HEK293细胞。至转染时细胞密度以40-60%为宜。转 染前1小时，更换新鲜的完全培养液，置37°C，5%C02培养。取5-8 μ g DNA加入稀释液中至 总体积为100 μ 1，轻轻混匀，室温放置。取VigoFect4 μ 1加入稀释液中至总体积为100 μ 1， 轻轻混匀，室温放置5分钟。将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所 得的转染工作液在室温放置15分钟。将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入5ml培养液中，轻 轻混匀培养液，置37°C，5%C02培养。48小时后，培养基中加入Blascidin抗生素，维持培养 两到三周，有限稀释法挑取单个细胞克隆。Western Blot和细胞免疫荧光的方法验证TLR2 及其辅助性受体CD14、TLR1或TLR6在HEK293的表达。所构建细胞系分别为HEK293-TLR2/ TLR1，HEK293-TLR2/TLR6，HEK293-TLR2/CD14,结果见图1，显示所构建的细胞系均成功表达 了 TLR2, TLR1，CD14 及 TLR6。
[0047] 实施例2构建稳定表达TLR2信号通路NF-kB荧光素酶报告基因的细胞。
[0048] 在实施例 1 中 HEK293-TLR2/TLR1, HEK293-TLR2/TLR6，
[0049] HEK293-TLR2/CD14细胞的基础上，转染TLR2信号通路NF-kB荧光素酶报告基因 质粒，转染24小时后培养基中加入抗生素 G418,筛选两周后挑选单克隆，化学发光法验证 TLR2特异性配基对其信号通路的激活作用。所构建细胞系分别为HEK293-TLR2/TLR1/1UC，
[0050] HEK293-TLR2/TLR6/luc，HEK293-TLR2/CD14/luc，分别加入不同浓度的特异性配 基刺激(横坐标)，相应激活信号通路值用荧光素酶百分比表示，绘制其量效曲线结果见图 2 〇
[0051] 实施例3体外快速差减筛选法（BRASIL)四轮筛选获得能与阳性细胞表面TLR2相 结合的重组噬菌体。
[0052] 1.主要试剂
[0053] 细胞培养用培养基頂DM，进口胎牛血清FBS，消化用胰酶均购自美国Gibco公司。
[0054] 有机溶剂邻苯二甲酸二甲酯、环己烷购自北京恒业中远化工有限公司，使用配比 为苯二甲酸二甲酯：环己烷(体积比）=9:1。
[0055] 叠氮钠 NaN3购自百灵威科技公司。
[0056] 溶液 A 由 1%BSA，MEM 培养基，0· l%NaN3 组成。
[0057] 随机7肽M13噬菌体展示文库试剂盒购自NEB公司。
[0058] 2.筛选方法
[0059] 2. 1先进行阴性筛选去除与之相结合的噬菌体，具体为将阴性细胞HEK293细胞 (1 X 108个）重悬到600ul溶液A中，2 X 1013噬菌体肽库重悬在lml溶液A中，噬菌体及细 胞混合液加至抗原管中，4°C环境下旋转过夜。
[0060] 2. 2次日将800ul噬菌体细胞混悬液加至等体积有机溶剂相之上，3000转4°C离心 2分钟，吸取上层水相中的噬菌体，与阳性细胞HEK293-TLR2/TLR1( 1 X 108个，重悬到600ul 溶液A)混合，4 °C旋转过夜。
[0061] 2. 3次日将1. 5ml噬菌体细胞混悬液加至等体积有机溶剂相之上，3000转4°C离心 2分钟，轻轻弃去上层未结合的水相噬菌体，将沉淀下的细胞用200ul溶液A重悬。
[0062] 2. 4用反复冻融法裂解细胞，释放与细胞表面结合的噬菌体。
[0063] 2. 5取50ul噬菌体裂解液，用琼脂叠层法测定释放出噬菌体的滴度。
[0064] 2. 6扩增噬菌体宿主菌ER2738,37°C摇床扩增至0D值为0. 5,将释放出的噬菌体加 至菌液中进行感染扩增。
[0065] 2. 7扩增后的噬菌体再与阴性细胞结合，进行下一轮筛选。一共经过四轮富集筛 选，每一轮从阳性细胞表面洗脱下来的噬菌体量与加入噬菌体量的比值逐渐升高，实现了 特异性的富集，结果见表1。
[0066]
【权利要求】
1. 一种多肽，其特征在于，其含有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2. -种多肽，其特征在于，含有权利要求1所述氨基酸序列并在其他位置出现氨基酸 替换，缺失或添加，且能与TLR2特异性结合。
3. 权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 4. 1经过对阴性细胞和阳性细胞进行有机溶剂法差异筛选，获得能与阳性细胞选择性 结合的重组噬菌体； 4. 2噬菌体对阴性细胞，阳性细胞以及重组蛋白TLR2结合能力的测定； 4. 3单克隆噬菌体的分离制备； 4. 4喔囷体基因组单链DNA的提取和犾得募肤序列； 4. 5固相多肽合成仪合成获得寡肽序列； 4. 6荧光标记的寡肽序列对多种表达TLR2的细胞进行流式细胞术和免疫荧光法测定。
4. 根据权利要求3的制备方法，，其特征在于，所述的阴性细胞选自不表达TLR2的 HEK293细胞，所述的阳性细胞选自稳定表达TLR2的HEK293细胞。
5. 有机溶剂法差异筛选是经过四轮。
6. 权利要求1-2中任一项的多肽在制备预防和治疗TLR2相关疾病的药物中的应用。
7. 根据权利要求6的应用，其特征在于，所述的预防和治疗TLR2相关疾病是通过激活 TLR2信号通路，促进下游细胞因子的释放。
8. 根据权利要求6的应用，其特征在于，所述的TLR2相关疾病选自自身免疫病、慢性炎 性疾病、肿瘤。
9. 根据权利要求8的应用，其特征在于，所述的自身免疫病选自类风湿性关节炎；所述 的慢性炎性疾病选自慢性阻塞性肺炎。
10. 稳定表达 TLR2 的阳性细胞 HEK293-TLR2/TLRl-luc，HEK293-TLR2/CD14-luc， HEK293-TLR2/TLR6-luc。
11. 权利要求1-2中任一项的多肽作为载体的应用。
12. -种物质，其特征在于，含有权利要求1-2中任一项的多肽和其他偶联物。
13. 根据权利要求12的药物，其特征在于，所述的其他偶联物选自促进凋亡的多肽。
14. 权利要求12的物质在制备预防和治疗肿瘤的药物中的应用。
15. -种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-2中任一项的多肽。
【文档编号】A61K47/48GK104098648SQ201310113133
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月2日 优先权日:2013年4月2日
【发明者】李珂, 吕晓希, 胡卓伟 申请人:中国医学科学院药物研究所