专利名称：Erbin抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及Erbin抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。背景技术：
内皮生长因子(Epidermalgrowth factor receptor)家族的受体,包括 EGFR (又称 HERl，ErbBl)，ErbB2 (HER2, neu), ErbB3 (HER3)以及 ErbB4 (HER4)均参与肿瘤的生成和发展。其中ErbB2尤其引起关注，因为超25%的乳腺癌组织中检测到ErbB2的过量表达，而ErbB2过表达的乳腺癌病人往往具有高复发性，并容易转移和预后不良。除乳腺癌以外，ErbB2过表达还牵涉到卵巢癌，胃癌和子宫癌。ErbB2最开始就是作为一个致转化的原癌基因被发现的(an oncogene carcinogen-1nduced neuroblastoma，neu ;或者 an oncogeneof avian erythoblastosis virus,ErbB2)。作为内皮生长因子受体家族的一员，ErbB2不直接和任何已知配体结合，而是与其他被配体激活的内皮生长因子家族成员形成异源二聚体来转导信号。虽然是个孤儿受体，ErbB2却是其它被配体激活的ErbB受体最倾向去形成二聚体的成员，而且与ErbB2形成二聚体可以显著促进其它ErbB受体被激活的程度。更重要的是，在乳腺癌细胞中高表达的ErbB2可以不依赖于配体的刺激而直接形成异聚体或同聚体从而激活下游通路。这个机制加重了 ErbB2致癌和促癌的作用。ErbB2激活后可以激活的下游信号通路包括Ras，Src, P1-3K/Akt，GAB2,以及小G蛋白，这些通路的激活最终导致癌细胞的增殖、存活，上皮细胞向间质细胞的转化、迁移以及向基质层的侵蚀。
过表达的ErbB2具有使细胞癌化的能力已经得到各种离体和在体实验的证实。ErbB2过表达可以使小鼠成纤维细胞NIH3T3和NR6发生转化，可以使正常的人乳腺上皮细胞MCF-10A形成类似原位导管癌(DCIS)的实心的多腺泡结构。在小鼠乳腺上皮中特异性过表达ErbB2可以导致小鼠生成乳腺肿瘤并且转移至肺部。所有这些研究结果都表明抑制ErbB2的蛋白水平是治疗乳腺癌的重要途径。现在已开发的针对ErbB2的单克隆抗体trastuzumab和pertuzumab,以及抗ErbB2激酶活性的抑制剂Iapatinib已经应用于临床上。但是，这些药物往往会导致抗药性，治疗的病人也很容易复发。因而，如何找到新的针对ErbB2的治疗途径一直是科学研究者努力的方向。
ErbB受体在受配体刺激后会被内吞降解。但是，包含ErbB2的受体二聚体的内吞却受到抑制；与ErbB2 二聚化不但可以阻止其它ErbB受体的内吞失活，还可以促进它们转移回细胞膜。抑制ErbB2及与ErbB2 二聚的受体内吞的机制为与ErbB2结合的胞内分子。ErbB2的C-末端对其稳定性非常重要，去掉C-末端仅仅3个氨基酸残基就会显著降低ErbB2的蛋白稳定性而增加其降解。这几个C-末端氨基酸残基构成一个结合PSD95-Dlgl-zo-l (PDZ)结构的区域，暗示一个含PDZ结构片段的ErbB2结合蛋白对其稳定性特别关键。本发明以ErbB2的C-末端片段作为钓饵(Bait)，在酵母双杂交文库中筛选出 ErbB2 的结合蛋白 Erbin(ErbB2_Interacting protein)。Erbin 是个 LAP 蛋白，N-端含有16个亮氨酸富集重复序列(Leucine-rich repeats, LRR),而其C-末端为一 PDZ结构片段。Erbin通过PDZ结构特异 性地和ErbB2结合，而不结合其它ErbB家族受体。本申请发明人发现Erbin对ErbB2的蛋白稳定性非常重要,而且Erbin还能促进过表达的ErbB2 二聚化从而活化ErbB2激酶活性和下游致癌和促癌信号通路。本发明以细胞和动物模型证明Erbin对过表达ErbB2的致癌和促癌作用非常关键；以多种手段特异性干扰Erbin与ErbB2的结合都表现出抑制ErbB2致癌和促癌的作用。
发明内容
本发明提供了一种新型的癌症检测标记物——Erbin的蛋白或mRNA水平，并提供了 Erbin抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，为新的肿瘤药物研发提供了基础。
受ErbB2在乳腺癌发生和发展中起关键作用的启示，发明人研究了其结合蛋白Erbin对这些过程的影响。结果显示Erbin特异性表达在乳腺导管上皮细胞中，对ErbB2依赖性的乳腺癌细胞增殖起必要作用。在小鼠乳腺上皮中突变Erbin，使其不能与ErbB2相互作用，可以抑制ErbB2依赖性的乳腺癌动物模型MMTV-neu小鼠不能生成肿瘤。而ErbB2非依赖性的乳腺癌动物模型MMTV-PyVT小鼠的肿瘤生成不受影响。Erbin与ErbB2的相互作用对ErbB2的促癌和致癌作用非常关键，过表达Erbin的PDZ结构片段，或过量在细胞内给予ErbB2的C-末端多肽片段，都可以抑制ErbB2依赖性的癌细胞增殖或肿瘤的生长。在肿瘤细胞中以特异性shRNA以基因干扰的方式敲低Erbin的表达，也对ErbB2依赖性的癌细胞的增殖和肿瘤生长有显著抑制作用。这些结果显示Erbin对ErbB2依赖性的肿瘤生成和生长有关键的调节作用，也提供了新型的抑癌途径和药物形式。临床乳腺癌标本的研究和分析显示癌组织中Erbin的表达比癌旁组织显著升高，且Erbin的表达水平与肿瘤的病理分级和ErbB2的表达水平息息相关，提供了以检测Erbin的表达水平进行临床肿瘤诊断的可行性。
本发明采用的技术方案是:
Erbin抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤包括乳腺癌，卵巢癌，胃癌和子宫癌等。
具体的,所述抑制剂为降低Erbin的表达或干扰Erbin_ErbB2的相互作用的化合物。
优选的，所述抑制剂为SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3所示的多肽。
SEQ ID N0.1 序列如下:
EIRVRVEKDPELGFSISGGVGGRGNPFRPDDDGIFVTRVQPEGPASKLL
QP⑶KIIQANGYSFINIEHGQAVSLLKTFQNTVELIIVREV
SEQ ID N0.3 序列如下:
PTAENPEYLGLDVPV (注:肽链C末端最后四位氨基酸DVPV最为关键，凡C端最后四位氨基酸为DVPV的肽段均在本发明的保护范围内)
优选的，所述抑制剂为Erbin的shRNA。
本发明还涉及一种包含Erbin的PDZ结构片段，起显性负性作用的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
编码该多肽的基因序列， 其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示:
GAGATTCGAGTGAGGGTTGAAAAGGATCCAGAACTTGGATTTAGCATATCAGGTGGTGTCGGGGGTAGAGGAAACCCATTCAGACCTGATGATGATGGTATATTTGTAACAAGGGTACAACCTGAAGGACCAGCATCAAAATTACTGCAGCCAGGTGATAAAATTATTCAGGCTAATGGCTACAGTTTTATAAATATTGAACATGGACAAGCAGTGTCCTTGCTAAAAACTTTCCAGAATACAGTTGAACTCATCATTGTACGAGAAGTT
本发明还涉及一种干扰Erbin-ErbB2相互作用的多肽，其氨基酸序列如SEQ IDN0.3所示。
编码该多肽的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示:
CCTACGGCAGAGAACCCAGAGTACCTGGGTCTGGACGTGCCAGTG。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1和3所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ N0.2和4所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源 性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。
本发明的有益效果主要体现在:本发明Erbin抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，为肿瘤诊断和治疗提供了新的途径。
图1为Erbin对ErbB2依赖性乳腺癌细胞增殖的影响；A为以蛋白印迹法检测出的在不同乳腺癌细胞系中shErbin降低Erbin蛋白表达的能力和程度；B D为以MTS法检测的不同稳定细胞株的增殖情况；n=3，*P〈0.05，**P〈0.01 ；
图2为Erbin对乳腺癌肿瘤的在体生成和生长的影响；D0为注射日，DlO为注射后第10日；
图3为Erbin的PDZ结构片段显性负性破坏乳腺癌细胞中ErbB2的蛋白稳定性和激酶活性；A为以蛋白印迹法检测ErbB2的蛋白水平及代表激酶活性的酪氨酸磷酸化水平(pErbB2) ；B-C为实验A中的结果的量化统计分析；n=3，林P〈0.01 ；
图4为Erbin-PDZ结构区域对ErbB2依赖性肿瘤的影响；A为Kaplan-Meier无肿瘤分布图，Log-rank (Mantel-Cox)检测，Ρ〈0.0002 ;B 为 MMTV-neu; erbin c/ c 和MMTV-neu;erbin+/+小鼠经解剖暴露乳腺；C为小鼠乳腺或肺分离后固定切片、经苏木精-尹红(Η/E)染色照片；D为分离的未长肿瘤的小鼠乳腺固定后进行整体苏木精染色照片；E为Kaplan-Meier无肿瘤分布图；F为PDZ结构区域切除不影响MMTV-PyVT小鼠乳腺肿瘤的生长，n=8，P>0.05 ;G 为在 MMTV-PyVT;erbin+/+和 MMTV-PyVT; erbin c/ °小鼠中生成的乳腺瘤的组织学特征。
图5为ErbB2的C-末端多肽序列B2tail干扰Erbin和ErbB2的相互作用；A为免疫沉淀产物以蛋白印迹法检测结果为A中实验结果的量化统计分析，n=3, *P〈0.05 ；
图6为TAT_B2tail多肽片段降低乳腺癌细胞的ErbB2蛋白稳定性，激酶活性及细胞增殖；A为处理后的细胞被裂解进行蛋白印迹检测结果；B为A中实验结果的量化统计分析；C为多肽处理SKBR3或BT474细胞对增殖率的影响；
图7为TAT_B2tail多肽片段在体抑制肿瘤的生长的代表性实验结果；
图8为临床病例研究结果；A为代表性的Erbin在临床乳腺癌标本切片中的免疫组化染色结果；B为量化的Erbin的免疫组化结果在癌组织和癌旁组织中分布的箱图；C为Erbin组化染色的量化结果在不同肿瘤病理级别中的分布的箱图；D为代表性的Erbin和ErbB2在相邻的临床乳腺癌标本切片中的免疫组化染色结果；E*ErbB2的免疫组化量化结果在Erbin表达量不同的病例组中分布的箱图；F为新鲜癌组织和癌旁组织经组织匀浆裂解后，由蛋白印迹法检测Erbin和ErbB2的表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:以细胞模型和动物模型证实Erbin对ErbB2依赖性的乳腺癌生成和发展极其重要，提供以特异性shRNA敲低Erbin的表达来治疗ErbB2依赖性肿瘤的途径和手段
为了研究Erbin对乳腺癌细胞增殖的影响，选择了 ErbB2依赖性的乳腺癌细胞系BT474 (ATCC)和SKBR3 (ATCC)，以及不依赖与ErbB2的乳腺癌细胞系ZR751 (PublicHealth England)。当这些细胞被培养到满盘时，以慢病毒包装的特异性识别Erbin的shRNA (shErbin)(正链:5’ TGCAT CCCTC TAGAG AACAA CTTTC AAGAG AAGTT GTTCTCTAGAGGGAT GCTTT TTTC;反链:5’ TCGAG AAAAA AGCAT CCCTCTAGAG AACAA CTTCT CTTGA AAGTTGTTCT CTAGA GGGAT GCA.)和另一对照 shRNA (shCtrl) (pLL3.7 空载体)分别侵扰细胞(将滴度为8xl08IU/ml的病毒颗粒悬液I μ I加入含IOml培养液的IOOmm的细胞盘中，24小时后更换新鲜培养液)。shErbin或shCtrl的包装载体上携带绿色荧光蛋白(GFP)，因而以胰酶消化并悬浮细胞，以流式细胞仪分选出被shRNA侵染进的细胞并传代以建立稳定细胞株。
蛋白印迹结果显示，与shCtrl相对照，shErbin可以将三个细胞系中Erbin蛋白的水平分别降低70 90% (图1A)。
shErbin或者shCtrl整合的稳定细胞株以相同的接种密度在相同的条件下生长，并分别于1，2，3天后接受细胞增殖的MTS检测，结果见图1B D。非常有启示意义的是，细胞内Erbin被shRNA敲低的BT474 (图1B)和SKBR3 (图1C)的增殖显著减缓，而ErbB2非依赖性的ZR751 (图1D)的细胞增殖不受shErbin的影响。这个细胞模型证明Erbin特异性地促进ErbB2依赖性的乳腺癌细胞的增殖，降低Erbin的蛋白水平可以抑制ErbB2依赖性的乳腺癌细胞增殖。
为了进一步验证Erbin对ErbB2依赖性肿瘤的在体作用，将同样数量的已整合shErbin (右边箭头)或shCtrl (左边箭头)的BT474细胞(100 μ 1，3.0X IO5个细胞混悬于50%Matr1-gel中)分别注射入裸鼠的右侧或左侧第四对乳腺内部(D0，注射日)，构建了一个人源乳腺癌发生发展的动物 模型，10天以后观察成瘤大小(D10)，结果见图2。同一只裸鼠的左右侧第四对乳腺在接种了乳腺癌细胞，有意义的是，10天后左侧接种shErbin-BT474的肿瘤显著减小，而右侧的shCtrl-BT474所形成的肿瘤显著增大。这个实验证实了在体环境下，以基因干扰的方式降低Erbin的表达对ErbB2依赖的肿瘤的发生发展有抑制作用。
实施例2:以细胞模型和动物模型证实Erbin的PDZ结构片段对ErbB2依赖性的乳腺癌生成极其关键。过表达Erbin的PDZ片段可以干扰Erbin_ErbB2的相互作用从而降低ErbB2的蛋白水平和其激酶活化，从而提供针对Erbin的PDZ结构片段来治疗ErbB2依赖性肿瘤的治疗途径和手段
发明人早期的工作已揭示Erbin与ErbB2通过PDZ结构区域结合。Erbin的C-末端的PDZ结构片段及ErbB2的C-末端的PDZ结合序列对它们结合和相互作用很关键。为了研究Erbin与ErbB2的结合是否对Erbin调节ErbB2的蛋白稳定性和功能很重要,构建了仅表达Erbin的PDZ结构片段的质粒
(ATGGAGATTCGAGTGAGGGTTGAAAAGGATCCAGAACTTGGATTTAGCATATCAGGTGGTGTCGGGGGTAGAGGAAACCCATTCAGACCTGATGATGATGGTATATTTGTAACAAGGGTACAACCTGAAGGACCAGCATCAAAATTACTGCAGCCAGGTGATAAAATTATTCAGGCTAATGGCTACAGTTTTATAAATATTGAACATGGACAAGCAGTGTCCTTGCTAAAAACTTTCCAGAATACAGTTGAACTCATCATTGTACGAGAAGTTGAACAAAAACTTATTTCTGAAGAAGATCTGTAG以BamHl和EcoRl酶切位点构建入pRK5载体)，然后研究过表达Erbin的PDZ结构片段是否有显性负性(dominant-negative)的作用去干扰Erbin和ErbB2的结合，从而影响ErbB2的蛋白水平和功能。出于这个目的，将不同数量的Erbin-PDZ质粒与定量的Erbin和ErbB2转染进人胎肾细胞HEK293 (ATCC)中(不同的转染体系中转染的质粒总量由空白载体补足到相同)，然后以蛋白印迹法检测ErbB2的蛋白水平及磷酸化水平(pErbB2)。结果如图3所示，Erbin-PDZ的表达抑制了 ErbB2的蛋白水平，而且以更大的程度抑制了ErbB2的磷酸化水平，显示了对其激酶活性更大的影响。更有意思的是，Erbin-PDZ对ErbB2蛋白水平和磷酸化水平的抑制是剂量依赖性的，Erbin-PDZ质粒转染得越多，ErbB2蛋白和磷酸化下降得就越显著。这些实验以细胞模型证实了过量Erbin-PDZ片段的表达可以影响ErbB2的水平和激酶活化，提供了通过干扰Erbin-PDZ来干扰ErbB2功能的途径和手段。
为了进一步以动物模型验证，构建了 Erbin的突变小鼠系erbir^w。在这个突变鼠中，野生型的Erbin被一个C-端切除的Erbin的突变蛋白所替代(仅剩N-端1-693个氨基酸残基，野生型鼠源Erbin :
MTTKRSLFVRLVPCRCLRGEEETVTTLDYSHCSLEQVPKEIFTFEKTLE
ELYLDANQIEELPKQLFNCQSLHKLSLPDNDLTTLPASIANLINLRELD
VSKNGIQEFPENIKNCKVLTIVEASVNPISKLPDGFSQLLNLTQLYLND
AFLEFLPANFGRLTKLQILELRENQLKMLPKTMNRLTQLERLDLGSNE
FTEVPEVLEQLSGLREFWMDGNRLTFIPGFIGSLRQLTYLDVSKNNIEM
VEEGISTCENLQDFLLSSNSLQQLPETIGSLKNVTTLKIDENQLMYLPD
SIGGLRSIEELDCSFNEIEALPSSIGQLTNMRTFAADHNYLQQLPPEIGN
WKNITVLFLHCNKLETLPEEMGDMQKLKVINLSDNRLKNLPFSFTKLQ
QLTAMWLSDNQSKPLIPLQKETDTETQKMVLTNYMFPQQPRTEDVMF
ISDNESFNPALWEEQRKQRAQVAroCDEDKDEREAPPREGNLKRYPTP
YPDELKNMVKTVQTIVHRLKDEETNEESGRDLKQHEDQQVVNKDKC
权利要求
1.Erbin抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述抑制剂为降低Erbin的表达或干扰Erbin-ErbB2的相互作用的化合物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抑制剂为SEQID N0.1或SEQ ID N0.3所示的多肽。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抑制剂为Erbin的shRNA。
5.一种包含Erbin的PDZ结构片段、起显性负性作用的多肽，其氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示。
6.编码权利要求5所述多肽的基因序列，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
7.一种干扰Erbin-ErbB2相互作用的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
8.编码权利要求7所述多肽的基·因序列，其核苷酸序列如SEQID N0.4所示。
全文摘要
本发明提供了Erbin抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。所述抑制剂具体可为降低Erbin的表达或干扰Erbin-ErbB2的相互作用的化合物。Erbin与ErbB2的相互作用对ErbB2的促癌和致癌作用非常关键，过表达Erbin的PDZ结构片段，或过量在细胞内给予ErbB2的C-末端多肽片段，都可以抑制ErbB2依赖性的癌细胞增殖或肿瘤的生长。本发明提供了新型的治疗ErbB2阳性肿瘤的途径，即通过降低Erbin的表达，或干扰Erbin与ErbB2的结合来抑制ErbB2的蛋白稳定性和激酶活性，从而抑制ErbB2的致癌和促癌的效应。
文档编号A61K38/16GK103212077SQ20131012127
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月9日 优先权日2013年4月9日
发明者梅林 , 陶艳梅, 沈承勇, 熊文诚, 罗时文 申请人:梅林 , 陶艳梅, 沈承勇, 熊文诚, 罗时文