肌肉干细胞体外培养方法及其应用的制作方法

肌肉干细胞体外培养方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及肌肉干细胞体外培养方法及其应用。本发明的肌肉干细胞体外培养方法，为采用添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。本发明还进一步公开了所述肌肉干细胞体外培养方法所用培养基及其应用。采用本发明的方法，肌肉干细胞可以增殖十次以上。更重要的是，在本发明的培养基中，肌肉干细胞可以连续传代，并继续保持干性和分化潜能，并且扩增后的肌肉干细胞均保持干性和完整分化潜能，能够在体内修复肌肉损伤，这就使得利用体外培养的肌肉干细胞用于再生医学治疗的策略在临床上具有可行性。
【专利说明】肌肉干细胞体外培养方法及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术与医学领域，特别涉及肌肉干细胞相关的细胞培养与细胞治 疗领域。

【背景技术】
[0002] 肌肉干细胞负责出生后肌肉组织的生长和再生，且肌肉干细胞在体内没有致癌效 果，不存在应用胚胎干细胞时会碰到的伦理问题，因而在肌肉萎缩和重症肌无力等各种肌 肉退行性疾病的治疗方面有广阔的应用前景。肌肉干细胞临床应用的一个重要障碍是无法 在体外长期培养肌肉干细胞。和大多数成体干细胞一样，肌肉干细胞从体内分离之后，在体 外培养系统中只能再分裂2-4次，几乎无法传代。
[0003] 现有培养肌肉干细胞(卫星细胞）的方法几乎都来源于Bischoff博士在1986年 建立的方法，后经过Beauchamp等人的改进，形成现有的在FlO基础培养基中添加10ng/ml FGF进行培养的方法。在此培养条件下，肌肉干细胞可以增殖3-5次。在传代时，肌肉干细 胞会经过一个严重的危机时期，在这一危机时期，绝大多数细胞都会死去，残留的细胞则分 化为不具有干性的前体细胞。所以体外培养1-3代（3-12天）后，分离得到的肌肉干细胞 即全部分化为不具有干性的前体细胞，肌肉干细胞的分子标记在这些前体细胞中都无法检 测到。注射入小鼠体内后，这些前体细胞参与肌肉损伤修复的能力非常弱，不能在体内形成 有功能的干细胞，完全不能进行移植后二次损伤的修复。（Bischoff R. A satellite cell mitogen from crushed adult muscle. Dev Biol.,1986. 115(1):140-147. Beauchamp, J. R. , et al. , Expression of CD34and Myf5defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J Cell Biol, 2000. 151(6) :p. 1221-34.)也就是说， 采用现有的肌肉干细胞体外培养系统，培养后的肌肉干细胞传代后要经过一个危机期，危 机期后得到的可以增殖的细胞绝大多数已经分化为肌肉祖细胞，丧失了肌肉损伤修复的能 力。由于这一问题的存在，使得通过在肌肉干细胞中进行基因修复治疗遗传性的肌肉退行 性疾病的方法难以在临床治疗中使用。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的就是克服现有技术的缺陷，提供一种肌肉干细胞培养基及其应用。
[0005] 本发明第一方面提供了一种肌肉干细胞体外培养方法，为采用添加有血液细胞的 细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。本发明的肌肉干细 胞体外培养方法适合体外长期培养肌肉干细胞。
[0006] 本发明第二方面提供了一种肌肉干细胞培养基，为添加有血液细胞的细胞因子的 细胞培养基或血液细胞条件培养基。
[0007] 所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中所添加的血液细胞的细胞因子， 用于制备所述血液细胞条件培养基的血液细胞，均与待培养的肌肉干细胞来源于相同的动 物物种。
[0008] 当添加动物血清培养细胞时，本发明所述的添加有血液细胞的细胞因子的细胞培 养基中所添加的血液细胞的细胞因子并不包括所用动物血清中本就含有的细胞因子。
[0009] 所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基可由在通用细胞培养基中添加血 液细胞的细胞因子的方法制备获得。
[0010] 进一步的，所述血液细胞条件培养基为淋巴细胞条件培养基。更进一步的，为B细 胞条件培养基或T细胞条件培养基。
[0011] 所述添加的血液细胞的细胞因子选自以下细胞因子中的多种：GM-CSF (粒细胞集 落刺激因子)、sICAM-1 (人可溶性细胞间粘附分子I) ;IFN gamma ( γ干扰素)、ILl (白介 素 l)、IL_lalpha receptor (白介素 1 α 受体)、ILlalpha (白介素 I a )、IL_3 (白介素 3)、 IL2 (白介素2)、IL-10 (白介素10)、IL-16 (白介素16)、IL13 (白介素13)、IL-17 (白介素 17)、IP-10 (干扰素诱导蛋白10)、SCYA2(小诱导型细胞因子A2)、MIG(干扰素γ诱生单核 因子）、MIP-Ialpha (巨噬细胞炎性蛋白I α )、TGF-beta (转化生长因子β )、IL-4 (白介 素4)、TRAF6 (TNF受体相关因子6)、FGF(成纤维细胞生长因子）、IGF胰岛素样生长因子）、 TOGF(血小板衍生生长因子）、LIF(白血病抑制因子）、mT0R(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）、 1^3(细胞内毒素）、1'1^1(1'〇11-样受体1)、11^12(白介素12)、11^23(白介素23)、如？（神 经生长因子）、TNFalpha (α干扰素)、ILlbeta (白介素1β)。
[0012] 所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，所述 添加的血液细胞的细胞因子总浓度不低于6ng/ml，较佳地为50-4500ng/ml。
[0013] 进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养 基中，任一添加的血液细胞的细胞因子的浓度均在0. 5ng/ml以上，较佳的为lng/ml以上， 再佳的为l〇ng/ml以上，更佳的，25ng/ml以上，更进一步的，为50ng/ml以上。
[0014] 进一步的，所添加的述血液细胞的细胞因子至少包括IL1、IL4、IL13、TNF alpha、 IL2 和 IFN gamma。
[0015] 进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养 基中，IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma的浓度之和不低于6ng/ml，较佳地为 50_1250ng/ml。
[0016] 进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养 基中，所述IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma中任一种的浓度均不低于0. 5ng/ ml,较佳的为lng/ml以上，更佳为10ng/ml以上，一般可选择50_500ng/ml。
[0017] 本发明第三方面，提供了前述血液细胞的细胞因子或血液细胞条件培养基在肌肉 干细胞体外培养中的用途。
[0018] 所述血液细胞的细胞因子或血液细胞条件培养基可促进肌肉干细胞在体外的增 殖并使体外增殖的肌肉干细胞保持干性。
[0019] 本发明第四方面，提供了一种用于治疗肌肉退行性疾病的制剂，为以采用本发明 的肌肉干细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分的制剂。
[0020] 进一步的，所述制剂以来源于病人本体的肌肉干细胞采用本发明的肌肉干细胞体 外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分。
[0021] 进一步的，所述制剂为注射剂、手术植入剂。
[0022] 所述制剂一般包含常用的制剂辅料。
[0023] 本发明第五方面，提供了一种对病人的肌肉退行性疾病细胞治疗方法，包括下列 步骤：
[0024] 1)收集病人的肌肉干细胞；
[0025] 2)采用本发明的肌肉干细胞培养基体外扩增培养步骤1)收集的肌肉干细胞至得 到足够多的肌肉干细胞；
[0026] 3)将获得的肌肉干细胞给药至病人肌肉损伤部位。
[0027] 其中步骤3)所述给药方式可采用注射剂的方式将肌肉干细胞肌肉注射至病人肌 肉损伤部位。
[0028] 肌肉干细胞的注射剂可将扩增后的肌肉干细胞经胰酶消化从培养皿中取下后，重 悬在生理盐水中获得。
[0029] 采用本发明的肌肉干细胞体外培养、传代方法，使得肌肉干细胞可以在体外大量 扩增并保持干性，从而大大提高了可以用于再生医学治疗的干细胞的数量，使得由患者提 供少量肌肉组织，分离肌肉干细胞，进行基因修复，体外扩增后将携带正确遗传信息的肌肉 干细胞注射如体内实现对多种遗传性肌肉退行性疾病的细胞治疗的策略成为可能。
[0030] 现有的肌肉干细胞培养方法无法在体外长期培养具有分化潜能的肌肉干细胞，无 法传代，培养时间超过12天后全部细胞都分化为祖细胞，丧失在体内修复肌肉损伤的能 力。在现有培养条件下，肌肉干细胞只能分裂3-5次，即最多扩增为原始细胞数的32倍，即 丧失分裂能力，因而要得到足够多的肌肉干细胞用于治疗，就必须取非常大的肌肉组织用 来分离纯化肌肉干细胞，在临床上基本不具有可行性。在本发明的培养基中，肌肉干细胞可 以增殖十次以上，即在每一代均可以扩增为原始细胞数的1000倍以上。更重要的是，在本 发明的培养基中，肌肉干细胞可以连续传代，并且继续保持干性和分化潜能。这样最终得到 的肌肉干细胞数目是起始分离纯化的肌肉干细胞数目的2 mx2n倍，m为每代分裂次数，η为 传代数目。采用本发明的方法得到的m值至少为12, η值至少为40,即肌肉干细胞数目至 少可以扩增为原始分离纯化的肌肉干细胞数目的4. 5χ1015倍，并且扩增后的肌肉干细胞均 保持干性和完整分化潜能，能够在体内修复肌肉损伤。注射入小鼠体内后，这些干细胞可以 较高效地参与肌肉损伤的修复，也可以补充体内的干细胞储备，具有移植后二次损伤的修 复能力。这就使得通过微创手术，提取少量肌肉组织(克级)，分离纯化少量肌肉干细胞，然 后在体外扩增获得足够量的肌肉干细胞用于再生医学治疗的策略在临床上具有可行性。

【专利附图】

【附图说明】
[0031] 图1添加细胞因子的FlO培养基中培养的PO代肌肉干细胞（Pax7染色）
[0032] 图2添加细胞因子的FlO培养基中培养的对照成纤维细胞（Pax7染色）
[0033] 图3添加细胞因子的FlO培养基中培养的P8代肌肉干细胞（Pax7染色）
[0034] 图4添加细胞因子的FlO培养基中培养的P22代肌肉干细胞（Pax7染色）
[0035] 图5在添加细胞因子的FlO培养基中培养的PO代细胞的分化结果
[0036] 图6在添加细胞因子的FlO培养基中培养的P22代细胞的分化结果
[0037] 图7在添加细胞因子的FlO培养基中培养的表达RFP的肌肉干细胞在体内参与肌 肉损伤修复结果
[0038] 图8.在添加细胞因子的FlO培养基中培养的RFP标记的肌肉干细胞能够参与肌 肉损伤的修复结果。
[0039] 体外培养的RFP标记的肌肉干细胞注射入没有荧光标记的损伤的肌肉7天后，切 片观察红色细胞的整合情况，发现在损伤部位有来源于注射的表达RFP的肌肉干细胞的红 色肌纤维形成。
[0040] 图A为注射加入细胞因子培养的肌肉干细胞的修复情况；
[0041] 图B为注射用T细胞条件培养基培养的肌肉干细胞的修复情况。

【具体实施方式】
[0042] 本发明发现，与血细胞共培养后可以促进肌肉干细胞的增殖，且这一促进作用不 依赖于血细胞与肌肉干细胞之间的细胞接触。血细胞条件培养基即可以促进肌肉干细胞的 增殖。经过进一步细分，B细胞和T细胞条件培养基均可以促进肌肉干细胞的增殖。肌肉 干细胞在T细胞条件培养基中培养后，每代可连续分裂10次以上，并可在体外培养系统中 至少连续传代40代。经过一系列分离纯化步骤后，分离到T细胞所分泌出的细胞因子，这 些细胞因子的组合可以促进肌肉干细胞在体外的增殖。经细胞因子处理过后的肌肉干细胞 表达肌肉干细胞所应表达的分子标记，其增殖能力显著提高，可以连续传代40代以上。传 代后的每一代细胞均表达肌肉干细胞的分子标记，具有较强的增殖能力，可以高效分化为 成熟肌管。更重要的是，当这些用T细胞条件培养基或细胞因子培养的肌肉干细胞注射入 诱导肌肉损伤后的小鼠时，注射的肌肉干细胞可以修复肌肉损伤，形成新的肌纤维，表明本 发明得到的是真正的肌肉干细胞。
[0043] 本发明的肌肉干细胞体外培养方法，为采用添加有血液细胞的细胞因子的细胞培 养基或血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。
[0044] 本发明的关键在于对体外培养肌肉干细胞的培养基进行了改进，体外培养肌肉干 细胞的其他方面与常规细胞培养一致。
[0045] 最佳培养条件：C02培养箱中37°C培养。CO2培养箱中CO2浓度较佳为5%(v/v)。
[0046] 所述肌肉干细胞的体外培养是贴壁培养。
[0047] 本发明所采用的肌肉干细胞培养基，为添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基 或血液细胞条件培养基。
[0048] 所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中所添加的血液细胞的细胞因子 与所述待培养的肌肉干细胞应当来源于相同的动物物种。用于制备所述血液细胞条件培养 基的血液细胞与所述待培养的肌肉干细胞也应当来源于相同的动物物种。如培养鼠肌肉 干细胞，则采用添加了鼠血液细胞细胞因子的细胞培养基或鼠血液细胞条件培养基，如培 养人肌肉干细胞，则采用添加人血液细胞的细胞因子的细胞培养基或人血液细胞条件培养 基，其余类推。
[0049] 所述物种（Species)，为生物分类学的基本单位。进一步的，所述动物物种选自哺 乳动物。更进一步的，所述物种选自哺乳动物中的啮齿目、偶蹄目、奇蹄目、兔形目、灵长目 等的物种，如鼠、兔、羊、猪、猴、人等。
[0050] 当添加动物血清培养细胞时，本发明所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养 基中所添加的血液细胞的细胞因子并不包括加入培养基的动物血清中本就含有的细胞因 子。亦即，当添加动物血清培养细胞时，本发明还需额外添加与所培养的肌肉干细胞同物种 的血液细胞的细胞因子。
[0051] 本发明所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基是指除常规细胞培养所需 组分外，还额外添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基。
[0052] 本发明所述肌肉干细胞培养基中除添加的血液细胞的细胞因子外的其他组分及 含量均与常规细胞培养基一致。常规细胞培养基成分一般选自：平衡盐水、PH调节液、抗 生素、动物血清、细胞生长必须的氨基酸、维生素、葡萄糖、PH指示剂等。所述平衡盐水成分 如氯化钙、硝酸铁、硫酸镁、氯化钾、氟化钠、氯化钠、磷酸钠等；所述pH调节液如3. 7%碳酸 氢钠、HEPES溶液(二羟乙基哌嗪乙烷磺酸)、丙酮酸钠等；所述抗生素如青霉素、链霉素、等； 常用的动物血清主要有牛血清和马血清。维生素如氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、泛酸钙、 盐酸吡哆醛、维生素B6、核黄素、硫胺素等。
[0053] 所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基可由在通用细胞培养基中添加血 液细胞的细胞因子的方法制备获得。其中，所述通用细胞培养基可选自各种常规细胞培养 基，如 DMEM、RPMI 1640、MEM、DEME/F12、F10、CD293、medium 231、medium 106。本发明实施 例具体列举了在FlO培养基中添加各种血液细胞的细胞因子的肌肉干细胞培养基。
[0054] 所述血液细胞条件培养基是指为：培养过血液细胞的细胞培养基。进一步的，所述 血液细胞为淋巴细胞。最佳的，所述血液细胞为B细胞和/或T细胞。
[0055] 所述血液细胞条件培养基可由在通用细胞培养基中培养血液细胞后分离获得。在 通用细胞培养基中培养B细胞后分离获得B细胞条件培养基，在通用细胞培养基中培养T 细胞后分离获得T细胞条件培养基。
[0056] 所述添加的血液细胞的细胞因子选自以下细胞因子中的多种：GM-CSF、sICAM-1 ; IFN gamma、ILl、IL_1 alpha、IL-I alpha receptor、IL_3、IL2、IL-10、IL-16、IL13、IL-17、 IP-10、SCYA2、MIG、MIP-I alpha、TGF-beta、IL-4、TRAF6、FGF、IGF、PDGF、LIF、mTOR、LPS、 TLR1、IL12、IL23、NGF、TNFalpha、ILlbeta。
[0057] 所有上述细胞因子可以在淋巴细胞条件培养基中检测到，尤其均存在于T细胞条 件培养基中。
[0058] 更佳的，所述血液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中的至少六种；或者，所述血 液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中的至少七种；或者，所述血液细胞的细胞因子选自 上述细胞因子中的至少八种；或者，所述血液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中的至少 九种；或者，所述血液细胞的细胞因子选自上述细胞因子中的至少十种。
[0059] 为了维持肌肉干细胞的增殖并使其传代细胞保持干性，所述添加有血液细胞的细 胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，所述血液细胞的细胞因子总浓度不能过 低，一般不应低于6ng/ml，较佳地为50-4500ng/ml。
[0060] 所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，任 一添加的血液细胞的细胞因子的浓度均在0. 5ng/ml以上，较佳的为lng/ml以上，更佳为 10ng/ml以上，一般可选在50-500ng/ml的范围内。上述描述并非指细胞因子的浓度不能高 于500ng/ml，而是认为在此浓度范围内细胞因子可以较好地发挥积极效果，浓度过低效果 不明显，浓度过高造成浪费。
[0061] 经试验，六种血液细胞的细胞因子：ILl、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma 对肌肉干细胞的增殖与干性的保持关系密切。在本发明优选的技术方案中，这6种血液细 胞的细胞因子必须添加，而其余血液细胞的细胞因子可添加也可以不添加。
[0062] 进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养 基中，IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma的浓度之和不低于6ng/ml，较佳地为 50_1250ng/ml。
[0063] 进一步的，所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养 基中，所述 IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2 和 IFN gamma 中任一种的浓度均在 0. 5ng/ml 以 上，较佳的为lng/ml以上，更佳为10ng/ml以上，一般可选50-500ng/ml。所述细胞因子的 浓度高于500ng/ml并不会对肌肉干细胞的增殖构成严重的负面影响，但考虑到成本因素， 无需添加过多的细胞因子。
[0064] 添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中，上述各细胞因子的浓度均指：在添 加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中，来源于与所培养的肌肉干细胞同物种的血液细 胞的细胞因子的终浓度。
[0065] 本发明揭示了血液细胞的细胞因子或血液细胞条件培养基可用于肌肉干细胞体 外培养，可促进肌肉干细胞在体外的增殖并使体外增殖的肌肉干细胞保持干性。
[0066] 本发明还提供了一种用于治疗肌肉退行性疾病的制剂，为以采用本发明的肌肉干 细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分的制剂。
[0067] 所述制剂以来源于病人本体的肌肉干细胞采用本发明的肌肉干细胞体外培养方 法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分。
[0068] 根据本发明的试验，用于人体，推荐的给药剂量约为3xl06个肌肉干细胞/次。可 单次给药，也可以根据病人的肌肉恢复情况多次给药。一般的给药方式为通过肌肉注射的 方式给药。但本发明并不排除其他可能的给药方式。
[0069] 所述制剂一般包含常用的制剂辅料。
[0070] 常用的制剂辅料包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、多元 醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的制剂优选被制成针剂形式，例如用 生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。其他可能的制剂形式 可通过常规方法进行制备。本发明的制剂宜在无菌条件下制造。此外，本发明的制剂还可 与其他治疗剂一起使用。
[0071] 本发明进一步提供了一种对病人的肌肉退行性疾病细胞治疗方法，包括下列步 骤：
[0072] 1)收集病人的肌肉干细胞；
[0073] 病人肌肉干细胞的收集可通过微创手术从病人机体中提取少量肌肉样品，而后从 肌肉样品中将肌肉干细胞分离纯化获得。该技术为本领域技术人员熟知。
[0074] 2)采用本发明的肌肉干细胞培养基体外扩增培养步骤1)收集的肌肉干细胞至得 到足够多的肌肉干细胞；
[0075] 基于本发明的肌肉干细胞培养技术，收集了病人的肌肉干细胞后，可以进一步利 用已知的基因工程手段对肌肉干细胞进行基因工程改造，修复缺陷基因或进行基因优化， 并进一步扩增改造后的肌肉干细胞，以达到克服一些遗传或突变相关的肌肉疾病或进一步 优化肌肉组织的目的。
[0076] 3)将获得的肌肉干细胞给药至病人肌肉损伤部位。
[0077] -般可采用注射剂的方式将肌肉干细胞肌肉注射至病人肌肉损伤部位。注射后应 当让病人进行适度锻炼，促进肌肉干细胞的整合。4-8周后检查修复效果。
[0078] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0079] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001 ;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY, Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds. ),Academic Press,San Diego, 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols (P.B. Becker, ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0080] 实施例I
[0081] 鼠T细胞条件培养基的制备：
[0082] 将野生型C57/B6小鼠处死，取出脾脏，置于70um滤网中，加入2-3毫升PBS湿润 后，使用辗磨棒辗磨脾脏，加适量PBS过滤，收集细胞悬液。IOOOrpm离心5分钟，弃上清， 使用5毫升红细胞裂解液重悬细胞，加入5毫升RPMI-1640培液，并用滤网再次过滤去除细 胞碎片，IOOOrpm离心5分钟收集细胞。使用RPMI-1640培液洗涤细胞两次，调整细胞密度 为I xIO9ceIls每升，接种于细胞培养瓶，加入ConA (终浓度为5mg/L)，于37度CO2培养箱 培养48小时后补加等倍RPMI-1640培液，24小时后3000rpm离心5分钟，将细胞上清转移 至新离心管中，于-80摄氏度保存。
[0083] 经检测，获得的T细胞条件培养基中含有下列浓度的细胞因子：
[0084] 检测方法：ELISA 检测，参见 R&D 公司 Mouse Cytokine Array, Panel A(Catalog#ARY006)
[0085]

【权利要求】
1. 一种肌肉干细胞体外培养方法，为采用添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或 血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。
2. 如权利要求1所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述添加有血液细胞的 细胞因子的细胞培养基中所添加的血液细胞的细胞因子，或用于制备所述血液细胞条件培 养基的血液细胞，均与待培养的肌肉干细胞来源于相同的动物物种。
3. 如权利要求2所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述血液细胞条件培养 基为淋巴细胞条件培养基。
4. 如权利要求3所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述血液细胞条件培养 基为B细胞条件培养基或T细胞条件培养基。
5. 如权利要求2所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述添加的血液细胞 的细胞因子选自以下细胞因子中的多种：GM-CSF、sICAM-1 ;IFN gamma、IL1、IL-Ialpha receptor、ILlalpha、IL-3、IL2、IL-10、IL-16、IL13、IL-17、IP-10、SCYA2、MIG、MIP-lalpha、 TGF-beta、IL-4、TRAF6、FGF、IGF、PDGF、LIF、mT0R、LPS、TLRl、IL12、IL23、NGF、TNFalpha 和 ILlbeta0
6. 如权利要求2所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述添加有血液细胞的 细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，所述添加的血液细胞的细胞因子总浓 度不低于6ng/m 1，较佳地为50-4500ng/ml。
7. 如权利要求2所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述添加有血液细胞的 细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，任一添加的血液细胞的细胞因子的浓 度均在0.5ng/ml以上，较佳的为lng/ml以上，再佳的为10ng/ml以上，更佳的，25ng/ml以 上，更进一步的，为50ng/ml以上。
8. 如权利要求2所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所添加的述血液细胞的 细胞因子至少包括 ILl、IL4、IL13、TNF alpha、IL2 和 IFN gamma。
9. 如权利要求8所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述添加有血液细胞的 细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，添加的IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2 和IFN gamma的浓度之和不低于6ng/ml，较佳地为50_1250ng/ml。
10. 如权利要求8所述肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述添加有血液细胞的 细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，所述IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2 和IFN gamma中任一种的浓度均不低于0. 5ng/ml，较佳的为lng/ml以上，更佳为10ng/ml 以上，一般可选择50_500ng/ml。
11. 一种肌肉干细胞培养基，为添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞 条件培养基。
12. 如权利要求11所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述添加有血液细胞的细 胞因子的细胞培养基中所添加的血液细胞的细胞因子，或用于制备所述血液细胞条件培养 基的血液细胞，均与待培养的肌肉干细胞来源于相同的动物物种。
13. 如权利要求12所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述血液细胞条件培养基 为淋巴细胞条件培养基。
14. 如权利要求13所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述血液细胞条件培养基 为B细胞条件培养基或T细胞条件培养基。
15. 如权利要求12所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述添加的血液细胞 的细胞因子选自以下细胞因子中的多种：GM-CSF、sICAM-1 ;IFN gamma、IL1、IL-Ialpha receptor、ILlalpha、IL-3、IL2、IL-10、IL-16、IL13、IL-17、IP-10、SCYA2、MIG、MIP-lalpha、 TGF-beta、IL-4、TRAF6、FGF、IGF、PDGF、LIF、mTOR、LPS、TLRl、IL12、IL23、NGF、TNFalpha 和 ILlbeta0
16. 如权利要求12所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述添加有血液细胞的细 胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，所述添加的血液细胞的细胞因子总浓度 不低于6ng/m 1，较佳地为50_4500ng/ml。
17. 如权利要求12所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述添加有血液细胞的细 胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，任一添加的血液细胞的细胞因子的浓度 均在0· 5ng/ml以上，较佳的为lng/ml以上，再佳的为10ng/ml以上，更佳的，25ng/ml以上， 更进一步的，为50ng/ml以上。
18. 如权利要求12所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所添加的述血液细胞的细 胞因子至少包括 IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2 和 IFN gamma。
19. 如权利要求18所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述添加有血液细胞的细 胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，添加的IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2 和IFN gamma的浓度之和不低于6ng/ml，较佳地为50_1250ng/ml。
20. 如权利要求18所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述添加有血液细胞的细 胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基中，所述ILl、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和 IFN gamma中任一种的浓度均不低于0. 5ng/ml，较佳的为lng/ml以上，更佳为10ng/ml以 上，一般可选择50_500ng/ml。
21. 血液细胞的细胞因子或血液细胞条件培养基在肌肉干细胞体外培养中的用途。
22. 如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述血液细胞的细胞因子或血液细胞条 件培养基用于促进肌肉干细胞在体外的增殖并使体外增殖的肌肉干细胞保持干性。
23. -种用于治疗肌肉退行性疾病的制剂，是以权利要求1-10任一权利要求所述的肌 肉干细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分的制剂。
24. 如权利要求23所述的制剂，其特征在于，所述制剂以来源于病人本体的肌肉干细 胞经所述的肌肉干细胞体外培养方法培养获得的肌肉干细胞为主要活性成分。
【文档编号】A61P21/00GK104212760SQ201310205059
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年5月29日 优先权日:2013年5月29日
【发明者】胡苹, 傅鑫, 肖俊, 郭恒江, 李升 , 刘燕, 王红艳 申请人:中国科学院上海生命科学研究院