表没食子酸儿茶素没食子酸酯在制备促进表皮修复和再生药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了表没食子酸儿茶素没食子酸酯（EGCG）激活表皮生长因子受体（EGFR）丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化的效果，该效果与表皮生长因子（EGF）类似，即EGCG可以作为植物来源的EGF应用于促进表皮修复和再生。提供EGCG在制备促进表皮修复和再生的药物和化妆品中的应用。本发明还提供用EGCG表没食子酸儿茶素没食子酸酯作为类表皮生长因子，作为表皮生长因子受体活化剂，以及作为表皮生长因子受体信号通路促进剂。
【专利说明】表没食子酸儿茶素没食子酸酯在制备促进表皮修复和再生药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于天然药物化学和药物开发应用领域，具体地，涉及表没食子酸儿茶素没食子酸酯及其制剂在活化EGFR、促进表皮修复和再生中的应用。
技术背景
[0002]茶叶是世界上最受欢迎的饮料之一，具有抗氧化、抗衰老、抗菌抗病毒、抗肿瘤、降低某些疾病发病率等多种功效。茶的成分很复杂，到目前为止茶叶中已分离鉴定的化合物有500余种，其中有机化合物有450余种，无机物营养素也有几十种。茶叶的水提取物中，儿茶素占25 — 40%，表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)占儿茶素的60%。EGCG被认为是茶叶鲜叶和绿茶中的主要活性成份。国内外对茶叶功效的研究也集中对EGCG的研究上。经过多年研究，人们发现EGCG对细胞、动物具有明显的生物效应，尤其是对肿瘤细胞和荷瘤小鼠具有明确的抗肿瘤效应。
[0003]表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor, EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，是鸟类成红细胞白血病病毒(avianerythroblastic leukemiaviral, v-erb-b)致癌基因同源体，为 HER/ErbB 家族的四个成员之一，故又名HERl或ErbB-1。EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的 级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化、凋亡，且与肿瘤的形成和恶化密切相关。
[0004]研究表明，EGFR能显著加速伤口表皮的再生；EGFR(酪氨酸激酶)抑制剂可抑制血管内皮生长因子、双调蛋白、角蛋白6和肝素结合的类EGF因子(HB-EGF)等有促进伤口愈合作用的因子的转录。几种外源性EGFR配体如转移生长因子(transforming growthfactor (TGF-α)能够促进伤口愈合。EGFR能促进鼠科动物皮肤癌的血管生成。在伤口愈合过程的早期阶段，EGFR是一种重要的调节因子。EGFR在伤口的整个愈合过程中是非常必要的，EGFR是通过调节水肿、炎症、细胞增殖和血管生成等促进伤口愈合的。
[0005]表皮生长因子EGF是EGFR的主要配体，EGF促进EGFR磷酸化，从而启动该信号通路，促进细胞增殖。EGF大量存在于人体上皮细胞内，它可刺激上皮细胞和内皮细胞生长，使新的表皮细胞不断长成，将死皮层推动并逐渐脱落，保持肌肤细嫩光滑。同时促进皮肤各种细胞的新陈代谢，增强细胞吸收营养物质。促使胶原及胶原酶合成，分泌胶原物质、透明质酸和糖蛋白，调节胶原纤维，具有滋润皮肤、增强皮肤弹性，减少皮肤皱纹和防止皮肤衰老的作用。在美容界有“美丽因子”之称。EGF的美容功效主要包括:(I)护肤、修复；(2)抗皱、防衰老；(3 )美白、祛斑；(4 )防粉刺、去疤痕；(5 )细致柔肤缩小毛孔等。
[0006]迄今，现有技术中没有涉及表没食子酸儿茶素没食子酸酯及其制剂在活化EGFR、促进表皮修复和再生中的应用的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供表没食子酸儿茶素没食子酸酯EGCG活化细胞表面的表皮生长因子受体EGFR、作为类表皮生长因子EGF的应用，即EGCG通过活化EGFR的信号调节细胞、机体的生命活动。本发明还提供了 EGCG以EGFR为作用靶点的具体应用对象和应用领域。
[0008]为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:
[0009]表没食子酸儿茶素没食子酸酯在制备促进表皮修复和再生药物中的应用。
[0010]表没食子酸儿茶素没食子酸酯在制备促进表皮修复和再生化妆品中的应用。
[0011]如所述的应用，所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通过促进表皮生长因子受体丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化来活化表皮生长因子受体信号通路。
[0012]如所述的应用，所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通过使细胞表面的表皮生长因子受体1046位、671位丝氨酸磷酸化增强从而促进表皮修复和再生。
[0013]如所述的应用，所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通过使细胞表面的表皮生长因子受体669位苏氨酸磷酸化增强从而促进表皮修复和再生。
[0014]如所述的应用，所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通过使细胞表面的表皮生长因子受体1068位、1086位、998位、1148位、845位、992位、1045位酪氨酸磷酸化增强从而促进表皮修复和再生。
[0015]本发明还提供用表没食子酸儿茶素没食子酸酯作为类表皮生长因子。
[0016]用表没食子酸儿茶素没食子酸酯作为表皮生长因子受体活化剂。
[0017]用表没食子酸儿茶素没食子酸酯作为表皮生长因子受体信号通路促进剂。
【专利附图】
【附图说明】:
[0018]图1为EGCG对EGFR磷酸化的影响，Ser:丝氨酸；Thr:苏氨酸；Tyr:酪氨酸；
[0019]图2为EGCG的结构式。
【具体实施方式】:
[0020]下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
[0021]实施例1:
[0022]表没食子酸儿茶素没食子酸酯EGCG对A431细胞膜表面表皮生长因子受体EGFR的作用:
[0023]A431是能够传代培养的人表皮癌细胞系。使用含10%胎牛血清(Hyclone)U1青链霉素的RPMI1640培养基培养。培养到最佳状态(死细胞少，可以明显的看出细胞呈明显的梭形)分40板，每板细胞接种500万。`
[0024]24小时后，将传代的A431细胞吸去培养液，用PBS洗后，用无血清培养基饥饿处理(至少达到16小时以上)，吸走培养液，PBS洗后，用pH6.5的酸性培养基处理30min，每个处理10板细胞，四个处理，对照加入等体积的无血清培养基pH6.5的酸性培养基10mL，实验组分别是在PH6.5的酸性培养基加入终浓度为0-200ug/ml表没食子酸儿茶素没食子酸酯EGCG, 20ng/ml 的表皮生长因子 EGF, 0-200ug/ml+20ng/ml EGCG+EGF, 30min 后，用通用蛋白裂解液和PMSF (100:1)裂解细胞.然后1350转/分离心8分钟收集细胞，收集细胞全蛋白，测定蛋白浓度。
[0025]使用40%的十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离细胞裂解液，每个处理的裂解液上样量60ug蛋白质。50伏恒压电泳30分钟。120伏恒压电泳lh，将电泳分离完毕的蛋白通过外加电场转移到硝酸纤维素膜上。200毫安恒流转移120分钟。在室温用5%牛血清白蛋白封闭蛋白转移完毕的硝酸纤维素膜30分钟，分别使用不同位点磷酸化的抗体(I: 1000)杂交过夜，然后用磷酸盐缓冲的生理盐水洗涤硝酸纤维素膜3次，每次10分钟。洗涤结束后，用过氧化物酶标记的兔抗体(1:5000)与硝酸纤维素膜室温杂交60分钟。反应结束后用磷酸盐缓冲的生理盐水洗涤硝酸纤维素膜3次，每次10分钟。洗涤结束后，参照说明书用ECL化学发光试剂盒处理(GE Healthcare)0在暗室用X光底片曝光。结果如图1所示。EGCG的结构式如图2所示。
[0026]实验结果图1证实表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)能使细胞表面的表皮生长因子受体(EGFR) 1046位、671位丝氨酸磷酸化增强；EGCG使细胞表面的EGFR669位苏氨酸磷酸化增强；EGCG使细胞表面的EGFR1068位、1086位、998位、1148位、845位、992位、1045位酪氨酸，从而活化EGFR，促进表皮修复和再生。
[0027]制剂实施例1:
[0028]从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
[0029]制剂实施例2:
[0030]从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
`[0031]制剂实施例3:
[0032]从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)，与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
[0033]制剂实施例4:
[0034]从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0035]制剂实施例5:
[0036]从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)按常规口服液制法制成口服液。
[0037]制剂实施例6:
[0038]从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
[0039]制剂实施例7:
[0040]从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
[0041]制剂实施例8:
[0042]含有表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)的美白霜配方(W%):
[0043]
【权利要求】
1.表没食子酸儿茶素没食子酸酯在制备促进表皮修复和再生药物中的应用。
2.表没食子酸儿茶素没食子酸酯在制备促进表皮修复和再生化妆品中的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通过促进表皮生长因子受体丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化来活化表皮生长因子受体信号通路。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通过使细胞表面的表皮生长因子受体1046位、671位丝氨酸磷酸化增强从而促进表皮修复和再生。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通过使细胞表面的表皮生长因子受体669位苏氨酸磷酸化增强从而促进表皮修复和再生。
6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通过使细胞表面的表皮生长因子受体1068位、1086位、998位、1148位、845位、992位、1045位酪氨酸磷酸化增强从而促进表皮修复和再生。
7.用表没食子酸儿茶素没食子酸酯作为类表皮生长因子。
8.用表没食子酸儿茶素没食子酸酯作为表皮生长因子受体活化剂。
9.用表没食子酸儿茶 素没食子酸酯作为表皮生长因子受体信号通路促进剂。
【文档编号】A61P17/00GK103432114SQ201310364356
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月20日 优先权日:2013年8月20日
【发明者】盛军, 郝淑美, 黄艳苹, 刘易凡, 王宣军 申请人:云南农业大学