小分子rna作为免疫抑制剂的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小分子RNA作为免疫抑制剂的应用。碱基序列为SEQ?ID?NO:1的小分子RNA作为免疫抑制剂在制备由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病的药物中的应用。本发明的小分子RNA以NFAT为靶点，通过抑制NFAT信号通路中的关键因子而抑制NFAT信号通路，能够显著抑制NFAT的活性，可作为一种新的免疫抑制剂用于治疗器官移植排斥反应和自身免疫性疾病。本发明的小分子RNA是人体的内源性RNA，对人体的毒性较小。
【专利说明】小分子RNA作为免疫抑制剂的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域,更具体地,本发明涉及一种microRNA (miRNA)的应用，特别是涉及miR-124a作为免疫抑制剂在制备由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]免疫抑制剂(immunosuppressant)是一类通过抑制细胞及体液免疫反应而使组织损伤得以减轻的化学或生物物质，可抑制机体异常的免疫反应，主要应用于器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、风湿热、胶原病、系统性红斑狼疮、皮肤真菌病、强直性脊柱炎、膜肾球肾炎、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病和自身免疫性溶血性贫血等)的治疗。
[0003]microRNAs CmiRNAs)是一类长约22个核苷酸(nt)、非编码的小分子单链RNA，广泛存在于动物、植物和病毒中，对基因表达起负调控作用。成熟的单链miRNA与Dicer和 Argonaute2 等蛋白一起形成 RNA 介导沉默复合物(RNA-1nduced silencing complex,RISC)，特异性地结合靶基因mRNA的:V -非翻译区(Un-translated Region, UTR)，抑制靶基因mRNA的翻译或促进其降解，从而起到在转录后水平的调节作用。
[0004]自1993年在线虫中发现首个miRNA以来,现已证实miRNA参与调节细胞生长、分化、凋亡、胚胎发育、器官形成和疾病发生等许多生物学过程。迄今，在miRBase (Ver: 18)登录的成熟miRNA序列有21634条，来源于168个物种，其中人有2154条，预测调控60%的人类基因。目前认为，miRNA的表达被精确的调控，具有严格的时空特异性；每个miRNA可以有多个潜在的靶基因，对多条信号通路都具有潜在的调控作用；同时，同一个基因又有可能受到多个miRNA协同调节。
[0005]T 细胞核因子(nuclear factor of activated T, NFAT)是一组在哺乳动物细胞内广泛表达的转录调控因子。迄今已发现的NFAT蛋白可分为5个:NFATcl、NFATc2、NFATc3、NFATc4和NFAT5，其中，NFATc 1-4的激活均依赖于胞内钙信号途径。细胞内NFAT的活化分三个阶段:脱磷酸、入核和对DNA亲和力的提升，其功能的发挥主要受钙调磷酸酶calcineurin (CaN)的调节。CaN是唯一受Ca2+/ 钙调蛋白(calmodulin, CaM)调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，其体内主要的底物是NFAT家族蛋白。静息状态下，NFAT以高度磷酸化无活性状态存在于细胞质；在刺激条件下，胞内Ca2+水平升高，激活CaN，使NFAT迅速脱磷酸，暴露出核定位序列，向核移位；入核后的NFAT与靶基因启动子上的特定序列结合，从而诱导这些基因的表达。因此，NFAT主要通过Ca2+/CaN信号路径被激活，NFAT的激活和核质穿梭主要是通过CaN与组成型激酶的动力学相互作用来调控的。
[0006]NFAT在免疫系统的发育、成熟和功能中起着关键性的作用，它们在多数免疫细胞中均有表达，并作为转录因子调节许多细胞因子(如IL22、IL24、IL23、IL210、IL213、IFN2 Y和GM2CSF等)、细胞表面配体(如⑶40L和⑶95L等)的表达。因此，NFAT信号转导障碍会引起多种细胞因子的缺乏和严重的免疫缺陷。NFAT缺陷小鼠、NFATl和NFAT2双敲除小鼠和NFATl和NFAT4双敲除小鼠的免疫表型都证明了 NFAT在T细胞活化和发育过程中发挥重要作用。此外，最新的研究显示，活化的NFAT能促进乳腺癌细胞和直肠癌细胞的浸润、转移。在心肌细胞中，活化的NFATs结合转录因子GATA-4，激活心肌肥厚基因的转录。研究证实，NFATc3基因在介导钙神经素下游的心肌肥厚反应中发挥了重要作用。NFAT的激活或异常表达与自身免疫性疾病、肿瘤转移、心肌肥大等众多疾病的发生有着密切关系。因此，抑制NFAT激活已成为开发新型免疫抑制剂的靶点。
[0007]环孢霉素(cyclosporin A, CsA)和FK506是以NFAT为靶点的药物，它们分别结合其胞内受体免疫嗜素(immunophilin):环孢亲和素(cyclophilin A, CyPA)和12kD的FK506结合蛋白(FK506binding protein, FKBP12)，然后与CaN形成三聚体复合物，最终抑制了 NFAT的活化及下游靶基因的表达。这2种药物是目前临床使用的最为有效的免疫抑制药物，为器官移植迎来了革命性时代。但是，由于这类药物直接抑制了 CaN的磷酸酶活性，具有严重的副反应(如肾毒性、神经毒性、高血压、糖尿病、胃肠道紊乱等)。鉴于此，人们迫切需要效能更高、毒性更低的新型免疫抑制剂。
【发明内容】
[0008]基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种小分子RNA作为免疫抑制剂的新应用。
[0009]为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案:
[0010]小分子RNA作为免疫抑制剂在制备由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病的药物中的应用，所述小分子RNA的碱基序列为SEQ ID NO:1所示。
[0011]在其中一个实施例中，所述由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病为肿瘤转移、心肌肥大、自身免疫性疾病或器官移植排斥反应。
[0012]在其中一个实施例中，所述小分子RNA为化学修饰的小分子RNA。
[0013]在其中一个实施例中，所述小分子RNA为单链RNA、双链RNA或插于质粒载体中的双链DNA。
[0014]本发明的发明人通过广泛而深入的研究，构建了 300个miRNA过表达载体，结合NFAT荧光素酶报告载体(pNFAT-Luc)和内参phRL_TK质粒，共转染293A细胞，在静止和PMA/1nomycin激活钙离子通路后分别检测荧光素酶的活性。最终发现了在两种条件下均显著抑制NFAT活性的miRNA为miR_124a。
[0015]本发明利用miRanda及Targetscan等软件预测miR_124a的祀分子,在上百个预测的靶基因中，其中有NFATcl,CAMTAl (钙调蛋白结合转录激活因子I)和PTBPl (多嘧啶序列结合蛋白1)，而CAMTAl和PTBPl也参与NFAT活性的调控。经:V -UTR实验及蛋白质水平检测均证明过表达miR-124a对NFATcl，CAMTAl和PTBPl具有抑制作用，验证了 NFATcl，CAMTAl 和 PTBPl 是 miR_124a 的靶基因。
`[0016]本发明发现人骨肉瘤细胞系(U2-0S)在刺激状态下，过表达miR_124a可以有效抑制共转染的cMyc-NFATc2的激活(去磷酸化)以及AcGFP-NFATcl的入核。在刺激状态下，稳转miR-124a的Jurket T细胞中NFAT的下游靶基因IL2的生成显著降低。
[0017]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0018]1、本发明发现小分子RNA miR-124a以NFAT为靶点，通过抑制NFAT信号通路中的关键因子而抑制NFAT信号通路，能够显著抑制NFAT的活性，可作为一种新的免疫抑制剂用于治疗由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病。
[0019]2、本发明的小分子RNA是人体的内源性RNA，对人体的毒性较小。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1 显示了 miR-124a 直接调控 NFATcl;其中 A 为 miR_124a 与 NFATcl 的 UTR 的结合位点为过表达miR-124a或其突变体对NFATcl_UTR荧光素酶报告质粒的影响；C、D为分别突变两个预测的结合位点后，验证miR-124a可能的结合位点；E、F、G为过表达miR-124a后对内源NFATcl的蛋白质表达水平的影响；
[0021]图2为本发明实施例3中过表达miR_124a对C-myC-NFATC2在激活状态下去磷酸化的抑制作用结果图；
[0022]图3为本发明实施例4中过表达miR_124a对AcGFP-NFATcl在激活状态下入核的抑制作用结果图；
[0023]图4为本发明实施例5中Jurkat T细胞过表达miR_124a对NFAT下游基因IL2在激活状态下的生成的抑制作用结果图。
【具体实施方式】
[0024]以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
[0025]如无特别说明，以下实施例中所采用的各种原料均来源于市售。所采用的方法均为常规技术手段。
[0026]实施例1小分子RNA miR-124a的制备
[0027]miR_l24a 的成熟序列为` 5，-uaaggcacgcggugaaugcc-3，(20bp, SEQ ID N0:1),可通过以下方式制得。
[0028]1.化学合成
[0029]miR_124a的模拟物(miRNA mimic)由广州锐博生物科技有限公司合成，为双链RNA,能模拟内源性成熟miR-124a高水平表达；标准纯化，于_20°C保存。用无RNA酶的水溶解配制成25 μ M的储存液，置_80°C备用，用时稀释成所需的浓度。
[0030]2.DNA载体或病毒载体介导miR_124a的表达
[0031](I)表达pr1-miR_124a载体的制备
[0032]在miRBase(http://www.mirbase.0rg/)数据库中得到人的 miR_124a 的成熟序列和前体序列(pre-miRNA)信息。分析表明，miR_124a的成熟序列在人类基因组中有三个前体序列:miR-124a-l、miR-124a-2和miR-124a_3，它们从人类基因组不同位置转录，并表达出具有相同成熟序列的miR-124a分子。以前体序列miR-124a-2为例，在人类基因组数据库中找到在成熟序列两侧各约200~300bp的侧翼序列，依据侧翼序列设计一对引物，并分别加上XhoI及EcoRI的酶切位点和相应的保护碱基，上游引物为5’-TCAGCTCGAGAGGCGTGTGCTGTAAATGGC-3 ’，下游引物为 5 ’ -TGCGAATTCCTGGAATATTTGCACAGGCG-3 ’。以人基因组 DNA 为模板，通过设计的引物进行PCR扩增，PCR反应条件为95°C预热4分钟，95°C 40秒、55°C 50秒、72°C 2分40秒进行35个循环，72度延伸10分钟。将扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，按胶回收试剂盒(Ε.Z.N.A Gel Extration Kit, Omega)操作说明进行回收。然后用适当的限制性内切酶(TAKARA)进行双酶切，将酶切后的PCR片段按DNA纯化试剂盒(E.Z.N.ACycle-Pure Kit, Omega)操作说明进行回收后作为插入片段。表达载体有两种,分别为DNA载体pENTR/CMV-EGFP及慢病毒载体pLVX-CMV_EGFP-ccdb (均由本申请的发明人所在实验室通过常规方法构建得到，本领域技术人员可以通过常规方法构建)。载体均以XhoI和EcoRI (TAKARA)进行双酶切后，利用与回收PCR产物相同的步骤进行纯化，插入位点均为EGFP (增强型绿色荧光蛋白)终止子之后。将插入片段与载体片段(摩尔比=3:1~10:1)利用T4连接酶(Promega)于16°C水浴连接过夜。然后将连接产物转化感受态大肠杆菌细胞STBL3，37°C培养过夜后挑取生长情况良好的单菌落在含有载体相应抗生素的LB培养液中进行扩增。提取质粒(Plasmid Mini Kit 1100, Omega)后进行测序验证(Invitrogen)。
[0033]制得的DNA载体可转染入细胞，瞬时表达miR_124a，进行相关功能研究；而制得的慢病毒载体需通过以下步骤发挥作用。[0034](2)慢病毒的包装和感染
[0035]慢病毒包装所需细胞系为293T细胞系，所需质粒包括慢病毒表达载体pLVX-miRNA和病毒包装质粒(5质粒体系的第四代包装质粒，Clontech)，在接种细胞及包装病毒的整个过程中，293T培养所用血清必须为不含四环素的血清(FBS-tet-off，FTEU/0828812，Biontex)。细胞转染采用 PEI 转染试剂(Polysciences)，用 IOmM NaCl 溶液分别稀释质粒和PEI溶液至相应的体积，将质粒部分和PEI部分混合后室温静置约10分钟，缓慢逐滴加入含有细胞培养液中，轻轻转动几次使液体分布均匀。转染6小时后移走含有转染试剂的培养液，更换新鲜利用Tet-ofT血清配制的培养液。
[0036]转染48-72小时后，收集含有病毒颗粒的细胞培养液，4000rpm室温离心10分钟以去除沉底的细胞碎片，将上清液分装后，置于_80°C备用。
[0037]包装好的慢病毒可用于感染所选的细胞，通过抗生素的筛选，杀死没有感染成功的细胞，存活的细胞均可稳定过表达miR-124a。
[0038]实施例2miR_124a的靶基因的验证
[0039]细胞培养:293A细胞(购自 ATCC, Manassas, VA), 10%FBS_DMEM 培养基(FBS 购自Gibco, DMEM购自Hyclone)培养。收集生长状态良好的细胞，离心计数，以6 X IO4/孔接种于24孔板内，37 °C，5%C02培养24h。
[0040]转染:待细胞的密度达60-70%时用PEI转染细胞，共转染3’ -UTR报告载体或突变的 3’ -UTR 报告载体(50ng)、miRNA 过表达载体 pENTR/CMV-EGFP_miR-124a 或 pENTR/CMV-EGFP-controI (500ng)和内参载体phRL-TK (IOng),每组实验做3个复孔。转染两天后，弃去培养液，PBS清洗2次后用SOyLlXPassive Lysis Buffer裂解细胞。
[0041]突光素酶检测:利用Dual-Luciferase Reporter Assay System(E1910, Promega)试剂盒参考其说明书进行荧光素酶活性检测，用萤火虫荧光素酶数值除以内参海肾荧光素酶读值，即可得到校正的NFAT活性数值。将NFAT活性数值与pENTR/CMV-EGFP-control对照组相比较。
[0042]如图1B所示，与对照相比，过表达miR_124a组(包括miR-124a-l，miR-124a_2，和miR-124a-3)的NFAT活性明显降低，说明该基因有可能为miR_124a的靶基因。在此基础上针对预测的结合位点构建3’-UTR的突变载体NFAT-UTR BS1-mu t和NFAT-UTR BS2_mut，利用突变载体再次进行双荧光素酶报告系统实验，如图1C所示，相比野生型的UTR，每个结合位点的突变均引起荧光素酶活性的恢复，表明两个位点均可结合，但第二个位点更重要。进一步实验验证表明，过表达miR-124a可直接通过靶向NFATcl的3’ -UTR抑制NFATcl蛋白的表达(图1E)，也可抑制内源性NFATclmRNA和蛋白的表达水平(图1F、G)。
[0043]结果表明:miR-124a通过靶向NFATcl的3’ -UTR抑制NFATcl的表达。
[0044]实施例3miR_124a对人胚肾上皮细胞系(293T) NFAT活性的抑制
[0045]细胞培养:293T细胞(购自 ATCC, Manassas, VA), 10%FBS_DMEM 培养基(FBS 购自Gibco，DMEM购自Hyclone)培养。收集生长状态良好的细胞，离心计数，以3 X IO5每孔接种于六孔板内，37 0C，5%C02培养24h。
[0046]转染:将293T细胞(3X IO5/孔)接种于6孔板，培养过夜后待细胞的密度达60-70%时用 PEI 转染细胞，同时转染质粒 pLVX-cMyc-NFATc2(300ng)和 pENTR/CMV-EGFP_miR-124a(1500ng)，对照组共转染 pLVX-cMyc-NFATc2 和 pENTR/CMV-EGFP-control。转染两天后用终浓度为I μ M的1nomycin (Sigma)和终浓度为ImM的CaCl2处理细胞，时间分别为0、20、40和60分钟。
[0047]Western-blot检测:收集细胞总蛋白，经蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳，用ant1-cMyc抗体检测磷酸化和去磷酸化的NFATc2 (图2),在静止状态下，c_Myc_NFATc2主要以磷酸化状态(高分子量带)分布在细胞中；而在1nomycin刺激下,磷酸化的NFAT迅速去磷酸化变为活化态的NFAT (分子量变小)。
[0048]如图2所示，细胞在激活60min时，对照组去磷酸化的NFATc2显著多于磷酸化的NFATc2(比值约为4.17)，在过表达miR-375组(作为阴性对照)中，去磷酸化的NFATc2也明显多于磷酸化的NFATc2(比值约为1.791)，而在过表达miR-124a组中，去磷酸化的NFATc2依然少于磷酸化NFATc2 (比值为0.64)。
[0049]结果表明:miR-124a对NFATc2的去磷酸化具有显著的抑制作用(图2)。实施例4miR-124a对人骨肉瘤细胞系(U2-0`S) NFAT活性的抑制
[0050]细胞培养:U2_0S细胞(购自 ATCC, Manassas, VA), 10%FBS_DMEM 培养基(FBS 购自Gibco，DMEM购自Hyclone)培养。收集生长状态良好的细胞，离心计数，以3 X IO5每孔接种于六孔板内，37 0C，5%C02培养24h。
[0051]转染:待细胞长至30%~50%，利用PEI法共转染表达绿色荧光融合蛋白AcGFP-NFATcl 的载体(IOOng)和 miRNA 过表达载体 pENTR/Ubc-miR-124 或空载体 pENTR/Ubc-Con (600ng)，48h后，利用不含有血清的DMEM培养液配制终浓度为I μ M的1nomycin和10ng/mL的PMA的处理液，刺激细胞I小时。到时间后，迅速弃去孔板中含有药物的培养液，用PBS清洗2次，用4%多聚甲醛覆盖细胞，室温固定10-20分钟。然后弃去固定液，用PBS清洗2-3次后，每孔加入约250 μ L适当稀释的DAPI染料(KGA215，凯基生物)，室温染色约5分钟，弃去染料，PBS清洗2-3次。
[0052]荧光显微镜监测:通过活细胞荧光显微镜实时观察绿色荧光融合蛋白(AcGFP-NFATcl)在细胞中的分布情况，如图3所示，在无刺激的静息细胞中，几乎所有的AcGFP-NFATcl均处于细胞质中。在1nomycin/PMA刺激I小时后，基本上所有AcGFP-NFATcl蛋白均发生核转移。然而，尽管在1nomycin/PMA刺激条件下，miR-124a的过表达导致几乎所有的AcGFP-NFATcl滞留在细胞质中。进一步地说明miR-124a对NFATcl激活及入核的抑制作用。[0053]结果表明:miR-124a通过抑制NFATcl的入核抑制NFAT活性。
[0054]实施例5miR_124a对人外周血白血病T细胞(Jurkat T) NFAT活性的抑制
[0055]细胞培养Jurkat T 细胞(购自 ATCC, Manassas, VA), 10%FBS_DMEM 培养基(FBS 购自Gibco，DMEM购自Hyclone)培养。收集生长状态良好的细胞，接种适量于IOOmm板内，37°C，5%C02 培养 24h。
[0056]转染:
[0057]A.将 Iml 表达人 miR_124a 或其突变体(miR-124a_m: 5’ -uuuccgacgcggugaaugcc-3’，对照)的慢病毒与8 μ 1/ml的Polybrene混匀加入培养Jurkat T细胞的IOOmm培养皿中。2天后，感染的Jurkat T细胞用puromycin(0.5 μ g/ml)筛选。筛选后的Jurkat T细胞接种于35mm培养皿，在终浓度为0.5 μ M的1nomycin和10ng/mL的PMA的处理液，刺激细胞6小时。
[0058]B.另外，还通过瞬时转染,将50nM miR_124a mimic或mimic control (购至锐博生物技术，广州，中国)通过Lipofectamine2000介导转入Jurkat T细胞,6小时后换新鲜培养液，培养48小时，在收集细胞前，用1nomycin和PMA刺激细胞6小时。
[0059]qRT-PCR检测:提取总RNA及通过定量RT-PCR法检测IL_2mRNA的表达。正向引物的序列是5’ -CCCAAGAAGGCCACAGAACT-3’，反向引物的序列是5’ -TGCTGATTAAGTCCCTGGGTCTTA-3’，以 beta-actin 为内参。
[0060]如图4所示，在1nomycin/PMA刺激6小时后，IL_2mRNA表达显著上调，与对照相比，刺激的同时过表达miR-124a却能显著抑制IL_2mRNA的表达；而IL-2是NFAT下游的基因，说明miR-124a可通过抑制NFAT的激活，进而抑制下游基因的表达，达到抑制免疫反应的作用。
[0061]结果表明:miR-124a可通过抑制NFAT的活性进而抑制其下游基因的表达水平，通过级联效应达到抗免疫反应的作用。
[0062]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.小分子RNA作为免疫抑制剂在制备由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病的药物中的应用，所述小分子RNA的碱基序列为SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病为肿瘤转移、心肌肥厚、自身免疫性疾病或器官移植排斥反应。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述小分子RNA为化学修饰的小分子RNA。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述小分子RNA为单链RNA、双链RNA或插于质粒载体中的双链DNA。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述小分子RNA是用DNA载体或病毒载体制备得到的。
【文档编号】A61P37/06GK103505745SQ201310442036
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】苟德明, 康康, 王玉娜, 张小英 申请人:深圳大学