表皮生长因子受体模拟表位肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及表皮生长因子受体模拟表位肽及其应用，所述的模拟表位肽能够竞争性地结合抗EGFR的抗体，显示了模拟表位在生物学及结构上同自然表位相近。本发明的模拟表位肽有利于在动物体内大量产生特异性抗体，克服了天然肽表位免疫原性低下、不能产生足够抗体的技术难题。
【专利说明】表皮生长因子受体模拟表位肽及其应用
[0001]本发明是申请号为201010023003.9的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明属于生物【技术领域】；更具体地，本发明涉及表皮生长因子受体模拟表位肽及其应用。
【背景技术】 [0003] 表皮生长因子受体(EGFR)是一个分子量为170KD的酪氨酸激酶受体，它对于不同细胞的增殖和分化起着相当重要的作用。细胞的恶性转化和EGFR的信号通路的增强有着密切的联系。EGFR的信号通路的激活会促进细胞的增殖、肿瘤的侵袭、肿瘤内部的血管新生和肿瘤的转移。EGFR在许多上皮源性肿瘤中过表达，而且过表达的水平与患者的预后有着密切的联系。EGFR的过表达通常是由基因的扩增，亦或者是由于表皮生长因子突变引起的。最常见的EGFR的突变体是表皮生长因子受体III型变异体(EGFRvIII)，它主要缺失了编码序列第2外显子到第7外显子的801碱基，这直接导致了 EGFR胞外区267个氨基酸的缺失，并在外显子连接处形成了一个新的甘氨酸。EGFRvIII在脑胶质瘤，乳腺癌，非小细胞肺癌和前列腺癌中可被检测到，在正常组织中不表达。
[0004]由于EGFR在癌症的发生发展过程有着重要的影响，因此针对EGFR的治疗方法也在不断的发展。mAb806 单克隆抗体(Luwor RB 等，Monoclonal antibody806inhibitsthe growth of tumor xenografts expressing either the de2~7or amplifiedepidermal growth factor receptor (EGFR) but not wiId-type EGFR.CancerRes.2001;61 (14):5355-61.)能够较特异地识别过表达的EGFR和EGFRvIII，研究表明mAb806能够抑制过表达EGFR或表达EGFRvIII的细胞生长。临床I期研究表明，mAb806单抗的人鼠嵌合体CH806能够特异地祀向肿瘤组织(Scott AM等,A phase I clinical trialwith monoclonal antibody ch806targeting transitional state and mutant epidermalgrowth factor receptors.Proc Natl Acad Sci U S A.2007;104 (10):4071-6.)。mAb806单抗识别 EGFR 上的多肽序列为 287CgadsyemeedgVRKC3ci2 (Johns TG 等，Identificationof the epitope for the epidermal growth factor receptor-specific monoclonalantibody806reveals that it preferentially recognizes an untethered form of thereceptor.J Biol Chem.2004Jul 16; 279 (29): 30375-84.)。所以这段多肽序列有望作为疫苗。但是因为这段多肽在正常组织中就存在，如果直接用于人体，可能会因为免疫耐受难以产生相应的单抗，因此需要找到这段多肽的模拟表位肽(mimotope)，用于抗肿瘤疫苗的研制。本发明人在前期研究中筛选到了一个单克隆抗体12H23(国际专利申请号:PCT/CN2009/074090)，它能够识别EGFRvIII和过表达的EGFR，并且在体内体外实验中能够有效的抑制HuH7-EGFRvIII人肝癌细胞及SMMC-7721细胞的生长。研究发现该抗体的表位多肽序列也是 287cgadsyemeedgvrkc3°2。
[0005]单克隆抗体应用于临床仍旧存在着一些限制，比如高昂的治疗费用，仍不够理想的疗效，来自鼠抗或嵌合抗体的副作用以及需要多次免疫才能产生足够的效价。如果用抗体结合位点的结构模拟多肽来免疫人体，使人体自身产生主动免疫，并能够持续产生抗体，就有可能解决单克隆抗体所不能解决的问题。模拟表位肽，在结构上同抗体结合表位类似，但氨基酸序列有可能是不同的，这样有利于在人体内大量产生针对该表位的抗体。因此，本领域迫切需要找到所述表位多肽的模拟表位肽，使其能够诱导产生主动免疫的疫苗 。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供表皮生长因子受体模拟表位肽及其应用。
[0007]本发明的目的还在于提供一种具有免疫原性的物质及其应用。
[0008]本发明的目的还在于提供含有所述受体模拟表位肽或具有免疫原性的物质的药物组合物。
[0009]在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，所述的多肽是选自如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。
[0010]在本发明的另一方面，提供一种具有免疫原性的物质，所述的物质连接有抗原，所述的抗原含有SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或者，所述的物质能表达出抗原，所述的抗原含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0011]在一个优选例中，所述的具有免疫原性的物质是连接(偶联)有抗原的蛋白大分子。
[0012]在另一优选例中，所述的具有免疫原性的物质所述的具有免疫原性的物质包括:钥孔戚血蓝素；以及
[0013]偶联于所述钥孔戚血蓝素的抗原，所述的抗原含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
[0014]在另一优选例中，所述的抗原包括:
[0015]如SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；以及
[0016]与所述的多肽相连的连接肽，所述的连接肽具有1-20个(较佳地4-10个)氨基酸。
[0017]在另一优选例中，所述的连接肽位于SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽的羧基端。
[0018]在另一优选例中，所述的连接肽具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
[0019]在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的多肽。
[0020]在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制备诱导抗体产生的的药物组合物，所述的抗体识别表皮生长因子受体。
[0021 ] 在一个优选例中，所述的多肽用于制备预防或治疗肿瘤的药物组合物。
[0022]在本发明的另一方面，提供所述的具有免疫原性的物质的用途，用于制备诱导抗体产生的的药物组合物，所述的抗体识别表皮生长因子受体。
[0023]在一个优选例中，所述的具有免疫原性的物质用于制备预防或治疗肿瘤或口腔扁平苔藓及白斑的药物组合物。
[0024]在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物含有:[0025]有效量的一种或多种(2种)所述的多肽，或一种或多种(2种)所述的具有免疫原性的物质；和药学上可接受的载体。
[0026]在一个优选例中，所述的药物组合物是疫苗。
[0027]在另一优选例中，所述药物组合物还含有有效量的免疫佐剂。
[0028]在本发明的另一方面，提供一种药盒，所述的药盒中含有:一种或多种所述的多肽；或一种或多种所述的具有免疫原性的物质；或所述的药物组合物。
[0029]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1显示了单抗12H23对富集后的噬菌体克隆的结合特异性分析。
[0031]其中，1、2、3为12H23与展示特定多肽序列的M13噬菌体克隆或野生型M13噬菌体的结合情况，4为同型对照抗体与所述噬菌体克隆的结合情况，5为BSA与所述噬菌体克隆的结合情况。[0032]图2显示了采用ELISA进行噬菌体竞争结合分析。
[0033]I为结合12H23 (左)与对照IgG (右)的噬菌体与G-HCL的竞争结合情况；
[0034]2为结合12H23 (左)与对照IgG (右)的噬菌体与N12-806的竞争结合情况；
[0035]3为结合12H23 (左)与对照IgG (右)的噬菌体与Sl-GFP的竞争结合情况；
[0036]4为结合12H23 (左)与对照IgG (右)的噬菌体与ccl6的竞争结合情况；
[0037]5为结合12H23 (左)与对照IgG (右)的噬菌体与对照肽的竞争结合情况。
[0038]图3显示了 ELISA分析合成多肽与12H23的结合效率。
[0039]其中，I为12H23抗体结合到合成多肽WHTEILKSYPHE - KLH ；2为12H23抗体结合到合成多肽LPAFFVTNQTQD-KLH ；3为12H23抗体结合到合成多肽对照肽-KLH ；4为12H23抗体结合到KLH。
[0040]图4显示了 Western blot检测抗多肽血清与EGFRvIII或EGFR过表达的细胞系的反应性。单克隆抗体12H23或模拟表位肽诱导的抗体(鼠血清中)与Huh7-EGFRvIII和A431细胞裂解蛋白的结合情况，EGFRvIII和EGFR分别可在130kDa和170kDa检测到(泳道1，阳性对照)，由WHTEILKSYPHE-KLH偶联物免疫的小鼠血清(泳道2)与细胞裂解蛋白在130kDa和170kDa产生条带，由LPAFFVTNQTQD-KLH偶联物免疫的小鼠血清(泳道3)与细胞裂解蛋白在130kDa和170kDa产生条带，由对照肽-KLH偶联物免疫的小鼠血清(泳道4)或单独由KLH免疫的小鼠血清(泳道5)没有条带。
[0041]图5显示了免疫荧光结果，所用血清或抗体分别为:A、用WHTEILKSYPHE-KLH免疫后的小鼠血清；B、用LPAFFVTNQTQD-KLH免疫后的小鼠血清；C、对照多肽-KLH免疫后的血清；D、KLH免疫后的小鼠血清；E、12H23单抗。
【具体实施方式】
[0042]本发明人经过深入的研究，首次揭示一种表皮生长因子受体的模拟表位肽。所述的模拟表位肽能够竞争性地结合抗EGFR的抗体(如12H23)，显示了模拟表位在生物学及结构上同自然表位相近。本发明的模拟表位肽有利于在动物体内大量产生特异性抗体，克服了天然肽表位免疫原性低下、不能产生足够抗体的技术难题。
[0043]如本文所用，所述的“模拟表位肽”是指具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽(如表1)或其衍生肽，其在生物学及结构上同表皮生长因子受体的自然表位287cgadsyemeedgvrkc3°2相近，具有诱导机体产生抗表皮生长因子受体的抗体的功能。所述的“模拟表位肽”在文中也简称为“本发明的表位肽”或“所述的表位肽”。本发明中，术语“多肽”、“蛋白”可互换使用。
[0044]表1
[0045]
【权利要求】
1.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽是氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的多肽。
2.一种具有免疫原性的物质，其特征在于，所述的物质连接有抗原，所述的抗原含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或者，所述的物质能表达出抗原，所述的抗原含有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的物质，其特征在于，所述的具有免疫原性的物质包括: 钥孔戚血蓝素；以及 偶联于所述钥孔戚血蓝素的抗原，所述的抗原含有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的物质，其特征在于，所述的抗原包括: 如SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽；以及 与所述的多肽相连的连接肽，所述的连接肽具有1-20个氨基酸。
5.—种分离的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸编码权利要求1所述的多肽。
6.权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制备诱导抗体产生的的药物组合物，所述的抗体识别表皮生长因子受体。
7.权利要求2-4任一所述的具有免疫原性的物质的用途，其特征在于，用于制备诱导抗体产生的的药物组合物，所述的抗体识别表皮生长因子受体。
8.—种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有: 权利要求1所述的多肽，或权利要求2-4任一所述的具有免疫原性的物质；和 药学上可接受的载体。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有有效量的免疫佐剂。
10.一种药盒，其 特征在于，所述的药盒中含有:权利要求1所述的多肽；或权利要求2-4任一所述的具有免疫原性的物质；或权利要求8或9所述的药物组合物。
【文档编号】A61K39/00GK103539840SQ201310442612
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2010年1月20日 优先权日:2010年1月20日
【发明者】李宗海, 杨麟, 王华茂, 王海, 蒋华, 石必枝 申请人:上海市肿瘤研究所