hALR基因微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因治疗【技术领域】，具体涉及人肝再生增强因子基因（hALR）微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的应用。本发明通过研究发现，将人肝再生增强因子基因（hALR）微环真核表达载体通过水动力转染方法，可靶向性地将人肝再生增强因子基因导入肝细胞内，并使其在肝脏中有效表达，从而有效抑制降低肝脏胶原蛋白合成。因此，人肝再生增强因子基因微环真核表达载体在制备降低肝脏胶原蛋白合成的药物方面具有很大的应用前景。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因治疗【技术领域】，具体涉及人肝再生增强因子基因（hALR)微环真核 表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的应用。 hALR基因微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方 面的应用
【背景技术】
[0002] 肝纤维化、肝硬化等慢性肝病均存在以肝脏胶原蛋白合成为主的病理变化，所以， 抑制肝脏胶原蛋白合成，成为治疗和预防肝纤维化、肝硬化等慢性肝病的有效方式。有大 量文献表明肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration, ALR)能减少肝脏纤维化 时胶原蛋白的产生，因此，肝再生增强因子成为了基因治疗肝纤维化的靶标基因。现有技 术中以肝再生增强因子为靶标来治疗肝纤维化的方法主要有以下几种：（1)通过外源物质 增加动物体内肝再生增强因子基因的表达量，从而通过降低肝脏胶原蛋白合成来治疗肝纤 维化。如彭彦辉等发表的文献"中药方剂对肝纤维化大鼠肝脏ALR基因表达的影响"证明： 其文献中记载的中药方剂可显著升高肝纤维化大鼠肝组织ALR mRNA表达，从而抑制肝纤维 化。（2)借助常规表达载体将肝再生增强因子基因导入动物细胞，使肝再生增强因子基因在 细胞内高表达，从而通过降低肝脏胶原蛋白合成来治疗肝纤维化。但是，通过常规表达载体 来介导肝再生增强因子基因的效率很低，而且，常规载体在基因治疗中可能会引起严重的 生物安全问题。如病毒载体中的病毒基因会整合到宿主基因组，病毒载体中的病毒基因编 码蛋白具有免疫原性等；传统质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因未甲基化的CpG基 因序列和一些可能隐藏的表达信号，这些序列在质粒是必须的，但在基因治疗中可能引起 严重的生物安全问题。除此之外，抗性基因会通过水平基因转移的方式在宿主体内传播；隐 藏在真核表达信号上游的抗性基因还会导致哺乳动物细胞中基因的表达发生改变；甚至细 菌序列的存在也会导致目的基因的沉默。这些因素都严重影响基因治疗的效果。
[0003] 微环DNA( minicircle DNA，MC)是1997年发展起来的除细菌序列和仅编码外源 基因的小超螺旋高效载体。具有安全性能好，同时转染效率高、表达时间持久的优点。微环 DNA载体仅由外源基因的表达盒构成，不含有来自细菌质粒的骨架结构，在生物安全性、 转染效率、生物活性方面都优于传统质粒载体。相关文献报道，体内、外试验证明微环DNA 载体的表达效率是亲本质粒载体的几十至几百倍。
[0004] 目前，国内外尚无用微环载体来介导人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration, hALR)基因的相关报道。因为，微环质粒种类纷杂，微环质粒与宿主 工程菌的匹配度是很难选择的，而且，微环质粒中携带的目的基因能否与宿主工程菌相兼 容也是很难控制的。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中利用肝再生增强因子进行基因 治疗存在的缺陷，提供一种人肝再生增强因子基因微环真核表达载体及其构建方法。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 一种人肝再生增强因子基因微环真核表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。 本发明选取微环质粒ZY781作为表达载体，将人肝再生增强因子序列通过酶切连接技术连 接到质粒ZY781中，得到携带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒，将获得的携带人肝再 生增强因子的微环DNA亲本质粒转入工程菌万.coB ZYCY10P3S2T中，通过工程菌自身重组 酶的作用下制备出高纯度的人肝再生增强因子基因微环真核表达载体。
[0007] 本发明之所以选择微环质粒ZY781作为表达载体是经过优化筛选的。现有技术微 环质粒种类纷杂，微环质粒与宿主工程菌的匹配度是很难选择的，而且，微环质粒中携带的 目的基因能否与宿主工程菌相兼容也是很难控制的。另外，本发明通过合理优化重组工程 菌凡cWi ZYCY10P3S2T的发酵条件，高效率制备得到高纯度的人肝再生增强因子基因微环 真核表达载体。
[0008] 所述重组工程菌的优化发酵及诱导条件为：将重组工程菌种子液按照0. 1?0. 3% 的接种量接种到含50 Pg /ml卡那霉素的TB培养液中，37°C，250 rpm/min，培养15h;然 后向培养液中加入1.2倍体积的诱导液，32°C，250 rpm/min培养6h ;所述诱导液为含有3% (v/v) IN NaOH 和 0· 3% (v/v) 20% L-Arabinose 的 LB 液体培养基。
[0009] 所述重组工程菌种子液的制备方法为将重组工程菌接种到TB培养液中，37°C， 250 rpm/min，培养15?18h得0D600值为4?5的重组工程菌种子液。
[0010] 本发明的有益效果是： 本发明通过研究发现，将人肝再生增强因子基因（hALR)微环真核表达载体通过水动力 转染方法，可靶向性地将人肝再生增强因子基因导入肝细胞内，并使其在肝脏中有效表达， 从而有效抑制降低肝脏胶原蛋白合成。因此，人肝再生增强因子基因微环真核表达载体在 制备降低肝脏胶原蛋白合成的药物方面具有很大的应用前景，例如可以使用该载体制备出 hALR蛋白作为药物使用，也可以用于基因治疗，即直接将基因打到动物体内进行基因治疗。
[0011] 说明书附图 图 1. PCDNA3. 1 (+) -hALR 质粒图谱。
[0012] 图2· ZY781空载体结构图。
[0013] 图3. hALR基因表达序列图。
[0014] 图4.hALR基因表达序列酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中，l、Marker :DL5000bp ;6、Marker :DL2000bp ;2、3、4、5 :hALR 基因表达序列酶切样品。
[0015] 图5.酶切、连接、转化技术将hALR微环亲本质粒导入工程菌过程图。
[0016] 图 6. ZY78l-CMV_hALR 质粒图谱。
[0017] 图L转化结果酶切电泳鉴定图；Marker :DL15000bp ;2、3、4、5 :NdeI酶切结果； 6、7、8 :KpnI 酶切结果 9、Marker :DL2000bp。
[0018] 图8. hALR基因微环真核表达载体制备流程图。
[0019] 图9.1^1^基因微环真核表达载体电泳鉴定图；1:1&^1?^01^1500(^? ;2:亲本质 粒ΚρηΙ酶切结果；3、5:微环Kpnl、EcoRI酶切结果；4、6:对照pcDNA3. 1 (+)-hALR载体 KpnI、EcoRI 酶切结果：9:Marker DL5000bp。
[0020] 图10. hALR基因微环真核表达载体结构图。
[0021] 图11.采用新老制备条件制备出的hALR微环真核表达载体纯度比较；左图：文献 制备条件制备的MLR微环质粒；右图：新制备条件制备的hALR微环真核表达载体；左图： 1、 2 :maker ;3 :亲本质粒ΚρηΙ酶切结果；4、5 :hALR微环真核表达载体ΚρηΙ酶切结果；右 图：1、2、7 :maker ;3 :亲本质粒ΚρηΙ酶切结果；4、5、6 :hALR微环真核表达载体ΚρηΙ酶切结 果。
[0022] 图12.大鼠肝脏外观裸视观察结果。
[0023] 图13.大鼠肝功能指标。
[0024] 图14.各组肝脏病理切片HE染色图 图15.各组肝脏切片胶原染色图。
[0025] 图16.各组肝组织胶原蛋白I mRNA检测。
[0026] 图17. pMC-CMV-hALR和pcDNA3. 1 (+)-hALR在体内表达比较图；1.健康对照组； 2. 为生理盐水对照组；3.模型对照组；4、5. pcDNA3. 1 (+) -hALR治疗组48小时和7天ALR 表达情况；6、7 :PMC-CMV-hALR治疗组48小时和7天ALR表达情况。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发 明采用的试剂、设备为本【技术领域】常规试剂和设备。
[0028] pcDNA3. 1 (+)-hALR质粒（6013bp)是由解放军458医院全军肝病中心构建并保藏， 其结构图如图1所示必cWi ZYCY10P3S2T和ZY781空载体由斯坦福大学陈志英教授惠赠， ZY781空载体结构图如图2所示。
[0029] 实施例1 S1.人肝再生增强因子基因序列的获得：以解放军458医院全军肝病中心构建并保藏 pcDNA3. 1 (+) -hALR质粒(质粒序列如SEQ ID N0 :2所示)为模版，设计扩增人肝再生增强因 子基因序列的正向和反向引物： 正向引物 F :5' -GACTGAAGATCTATGTACGGGCCAGATATA-3' 反向引物 R:5' -ATACCGCTCGAGGGTTCTTTCCGCCTCAGA-3' PCR反应体系及反应程序如下：
【权利要求】
1. hALR微环真核表达载体在制备降低肝脏胶原蛋白合成药物中的应用，所述hALR微 环真核表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述降低肝脏胶原蛋白合成药物能治疗肝 纤维化或肝硬化。
3. 根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述应用的具体步骤为：
51. 扩增得到人肝再生增强因子基因表达序列；
52. 将人肝再生增强因子基因表达序列通过酶切连接技术转入质粒ZY781中；得到携 带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒；
53. 将携带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒转入工程菌万.coB ZYCY10P3S2T中 得重组工程菌，优化重组工程菌发酵及诱导条件，通过工程菌自身重组酶的作用下制备出 高纯度的人肝再生增强因子微环真核表达载体；
54. 将人肝再生增强因子微环真核表达载体通过水动力转染方法，靶向性地将人肝再 生增强因子基因导入肝细胞内。
4. 根据权利要求3所述应用，其特征在于，S3所述重组工程菌的优化发酵及诱导条 件为：将重组工程菌种子液按照〇. 1?〇. 3%的接种量接种到含50 Pg /ml卡那霉素的TB 培养液中，37°C，250 rpm/min，培养15?18h ;然后向培养液中加入1. 2倍体积的诱导 液，32°C，250 rpm/min 培养 6h;所述诱导液为含有 3% (v/v)lN NaOH 和 0.3% (v/v)20% L-Arabinose的LB液体培养基。
5. 根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述重组工程菌种子液的制备方法为将重 组工程菌接种到含50 Pg /ml卡那霉素的TB培养液中，37°C，250 rpm/min，培养15?18h 得〇D6QQ值为4?5的重组工程菌种子液。
【文档编号】A61K48/00GK104096239SQ201410011707
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】孔祥平, 武昕, 刘光泽, 张海松, 吴庆洲 申请人:中国人民解放军第四五八医院